Desenvolvimento de um modelo de traumatismo cranioencefálico leve não complicado modificado pelo método de perda de peso e evidenciado por ressonância magnética

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo animal de traumatismo cranioencefálico fechado replicando o resultado da neuroimagem de lesão cerebral traumática leve não complicada com a estrutura cerebral preservada na fase aguda e atrofia cerebral de longo prazo. A ressonância magnética longitudinal é o principal método usado para evidência.

A lesão cerebral traumática leve (mTBI), conhecida como concussão, é responsável por mais de 85% das lesões cerebrais em todo o mundo. Especificamente, o mTBI não complicado mostrando achados negativos em imagens clínicas de rotina na fase aguda dificulta o tratamento precoce e adequado nesses pacientes. Foi reconhecido que diferentes parâmetros de impacto podem afetar e até acelerar o progresso dos sintomas neuropsicológicos subsequentes após o mTBI. No entanto, a associação dos parâmetros de impacto durante a concussão com o resultado não foi examinada extensivamente. No presente estudo, um modelo animal com traumatismo cranioencefálico fechado (CHI) modificado a partir do paradigma de lesão por queda de peso foi descrito e demonstrado em detalhes. Ratos Sprague-Dawley machos adultos (n = 20) foram aleatoriamente designados para grupos CHI com diferentes parâmetros de impacto (n = 4 por grupo). Estudos longitudinais de imagem por RM, incluindo imagens ponderadas em T2 e imagens por tensor de difusão, e avaliações comportamentais sequenciais, como escore de gravidade neurológica modificado (mNSS) e teste de caminhada por feixe, foram realizados durante um período de estudo de 50 dias. A coloração imuno-histoquímica para astrogliose foi realizada no 50º dia pós-lesão. Pior desempenho comportamental foi observado em animais após CHI repetitivo em comparação com o grupo de lesão única e simulada. Usando ressonância magnética longitudinal (RM), nenhuma contusão cerebral significativa foi observada 24 horas após a lesão. No entanto, atrofia cortical e alteração da anisotropia fracionada cortical (FA) foram demonstradas no dia 50 pós-lesão, sugerindo a replicação bem-sucedida do mTBI clínico não complicado. Mais importante ainda, as mudanças nos resultados neurocomportamentais e nas características de imagem observadas após o mTBI dependeram do número de impacto, intervalos entre lesões e do local de impacto selecionado nos animais. Este modelo de mTBI in vivo combinado com ressonância magnética pré-clínica fornece um meio de explorar a lesão cerebral em uma escala de todo o cérebro. Também permite a investigação de biomarcadores de imagem sensíveis ao mTBI em vários parâmetros de impacto e níveis de gravidade.

O traumatismo cranioencefálico leve (mTBI) é observado principalmente em atletas envolvidos em esportes de contato, veteranos militares e indivíduos envolvidos em acidentes de trânsito¹. É responsável por mais de 85% de todos os traumatismos cranianos relatados². A vasta etiologia do mTBI e sua crescente incidência global ressaltam a inclusão do mTBI como um fator de risco ambiental provisório de doença neurodegenerativa de início tardio³. O TCE leve não complicado é caracterizado por um escore de coma de Glasgow (GCS) de 13-15, sem anormalidades estruturais observadas em tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM). Os sintomas comuns experimentados por pacientes com mTBI não complicado incluem dores de cabeça, tontura, náuseas ou vômitos e fadiga. No entanto, a avaliação longitudinal dos resultados após o mTBI não complicado apresenta desafios consideráveis devido à alta taxa de abandono em pacientes⁴.

As preocupações com o mTBI repetitivo aumentaram, particularmente na comunidade de atletas profissionais da National Football League (NFL), aumentando posteriormente a conscientização entre os atletas não profissionais⁵. Presume-se que a vulnerabilidade cerebral aumente após o mTBI inicial, com insultos subsequentes potencialmente exacerbando os resultados da lesão. Descobertas recentes da maior coorte cerebral doada de jogadores de futebol não apenas implicaram a participação anterior no futebol na gravidade da encefalopatia traumática crônica (CTE), mas também sugeriram uma correlação entre diferentes fatores relacionados ao futebol e o risco e a gravidade do CTE⁶. Assim, a preocupação com a influência do número de concussões e do regime repetitivo nos resultados das lesões está crescendo. A pesquisa pré-clínica explorou alterações neuropatológicas, cascata neuroinflamatória e comprometimento neuropsicológico após mTBI repetitivo usando vários modelos de traumatismo cranioencefálico fechado (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . No entanto, a investigação dos parâmetros de impacto no modelo mTBI não complicado, que pode imitar de perto os impactos repetitivos da cabeça concussivos relacionados ao esporte, resultando em comprometimento funcional na fase aguda e atrofia cerebral na fase crônica, não foi bem examinada.

A imagem por tensor de difusão (DTI), uma técnica que avalia a difusão de moléculas de água, tem sido comumente utilizada em estudos que investigam os efeitos do mTBI. A anisotropia fracionada (FA), uma métrica chave derivada do DTI, quantifica o grau de coerência da difusividade da água e fornece informações sobre a organização estrutural dos axônios e feixes de fibras nervosas. A perturbação dos valores de FA na substância branca (WM) foi proposta após mTBI em vários modelos 8,10,11,15,16,17. Além disso, a difusividade axial (DA) e a difusividade radial (RD), indicando integridade axonal e mielina, foram alteradas após mTBI em estudos pré-clínicos 10,15,16,18,19,20. No entanto, as discrepâncias nos achados do DTI entre estudos anteriores são provavelmente devidas a variações na gravidade do mTBI, diferenças nos parâmetros de impacto, diversos modelos de mTBI e pontos de tempo de acompanhamento pós-lesão inconsistentes⁹.

O presente artigo de protocolo, portanto, visa estabelecer um modelo animal de mTBI projetado para avaliar os efeitos cumulativos de mTBI único e repetitivo. Incorporamos avaliações abrangentes e longitudinais, incluindo avaliações de bem-estar animal, resultados comportamentais, parâmetros DTI e volume cortical, para capturar mudanças dinâmicas pós-lesão e explorar os efeitos de diferentes parâmetros de impacto. Ao demonstrar comprometimento funcional agudo e alterações microestruturais de longo prazo, este modelo replica efetivamente as principais características do mTBI não complicado que não foram totalmente abordadas em estudos anteriores com animais. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o desenvolvimento de um modelo de mTBI não complicado usando um método modificado de queda de peso de cabeça fechada ^8,11 e conduzindo a avaliação longitudinal após o mTBI.

O estudo foi realizado de acordo com as recomendações das diretrizes do National Institutes of Health Guidelines for Animal Research (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e as diretrizes Animal Research: Reporting In Vivo Experiments. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional Yang Ming Chiao Tung. Vinte animais foram aleatoriamente divididos em 5 grupos (n = 4 por grupo): (i) impacto único no córtex sensório-motor (SMCx/único), (ii) impactos duplos no SMCx com o intervalo de 1 h (SMCx/2 acertos/1 h), (iii) impactos duplos no SMCx com o intervalo de 10 min (SMCx/2 acertos/10 min), (iv) impactos duplos no cérebro central com o intervalo de 1 h (Central/2 acertos/1 h), e (v) o grupo simulado apenas com cirurgia, mas sem impacto direto na cabeça, para avaliação longitudinal do resultado (Figura 1). É importante ressaltar que os intervalos entre lesões selecionados para este estudo (intervalos de 1 h vs. 10 minutos) foram projetados para imitar os impactos subconcussivos repetitivos 8,10,11,13,21, que podem ser até mil vezes em uma única temporada, experimentados pelos atletas que praticam esportes de contato^22,23.

1. Indução de traumatismo cranioencefálico fechado (CHI)

NOTA: Ratos Sprague-Dawley machos adultos com idades compreendidas entre as 10 e as 12 semanas e pesando mais de 250 g são alojados num ciclo claro/escuro de 12/12 h com acesso ad libitum a alimentos e água.

1. Coloque o rato em uma pequena câmara de indução e anestesiá-lo com uma mistura de isoflurano (5%) e ar medicinal (2,5-3 L / min). Remova o rato da câmara até que ele não responda a um beliscão na pata ou na cauda.
2. Coloque o rato na almofada de aquecimento.
   NOTA: Ligue a almofada de aquecimento durante a cirurgia para manter a temperatura corporal dos ratos.
3. Traga o rato para uma estrutura estereotáxica e prenda-o com uma barra de dente. Administre isoflurano a 2% usando o cone nasal conectado com ar medicinal a uma taxa de fluxo de 1,5-2 L/min para manutenção durante a cirurgia.
4. Posicione as barras auriculares. Certifique-se de que o rato esteja centralizado e simétrico na estrutura estereotáxica.
   NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados em condições assépticas. Os instrumentos foram esterilizados antes da cirurgia em autoclave a vapor, e suas pontas foram adicionalmente esterilizadas com esterilizador de esferas durante o procedimento. Para evitar a contaminação, um campo cirúrgico foi colocado sobre o animal. O cirurgião usava touca para cobrir os cabelos, máscara para cobrir o rosto e estava equipado com jaleco e luvas cirúrgicas durante o procedimento²⁴.
5. Coloque o sensor do oxímetro de pulso na pata traseira do animal para monitorar a frequência respiratória, a frequência cardíaca, o nível de oxigênio no sangue e a temperatura corporal do animal.
6. Injete 1 mL / kg de peso corporal de lidocaína (20 mg / mL) por via subcutânea no pescoço do rato como analgésico.
7. Aplique o creme depilatório na cabeça do animal e aguarde 3 min. Limpe o creme com cotonetes de álcool isopropílico 70%.
8. Limpe a área raspada várias vezes usando um cotonete estéril embebido em iodo. Remova o resíduo de iodo usando um cotonete embebido em etanol 70%.
9. Crie uma incisão na linha média de aproximadamente 2-2,5 cm de comprimento na pele raspada usando lâmina cirúrgica estéril para acessar a superfície do crânio.
10. Remova o tecido do osso usando uma almofada de algodão para expor o crânio. Limpe a superfície do crânio usando um cotonete embebido em solução salina a 0,9% e, em seguida, limpe-o com um algodão seco.
    NOTA: As suturas do crânio e o bregma e o lambda agora podem ser facilmente identificados.
11. Identifique o bregma como ponto de referência para descobrir melhor a área de impacto com base na coordenada.
    NOTA: Neste protocolo, dois conjuntos de coordenadas são utilizados para a indução do CHI: (-2,5,-2,0) (2,5 mm lateral 2,0 mm posterior ao bregma) no topo do córtex sensório-motor (SMCx), bem como (0,-3,0) no topo do cérebro central (central).
12. Identifique as coordenadas escolhidas na superfície do crânio e cimente um capacete circular de aço inoxidável (10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura) sobre a área designada usando cimento dentário. Remova a almofada de aquecimento e o oxímetro de pulso.
13. Mova o dispositivo estereotáxico e o rato na mesa elevatória (14 cm de comprimento, 8 cm de largura e 6,15 cm de profundidade) sob o pêndulo CHI.
14. Eleve o corpo do rato usando uma esponja de espuma (19 cm de comprimento, 10 cm de largura e 4 cm de profundidade, com densidade de 18 kg/m³).
15. Remova o rato das barras auriculares da estrutura estereotáxica. Mantenha o rato imóvel na barra dentária conectada ao cone do nariz, fornecendo 2% de isoflurano. Certifique-se de que a cabeça e o corpo estejam alinhados no sentido rostral-caudal.
16. Ajuste a mesa elevatória para garantir que não haja espaço entre o impactor CHI e o capacete. Desligue o isoflurano 5 s logo antes do impacto.
    NOTA: Para especificar o reflexo de endireitamento devido à lesão cerebral, foi realizada a interrupção temporária do isoflurano²⁵.
17. Deixar cair um latão de 600 g de uma altura de 1 m através de um tubo de aço inoxidável (1 m de altura com um diâmetro interior de 20 mm para limpar uma coluna de pesos de latão inoxidável) para o impactor fixado com uma ponta redonda apontando para o capacete de metal.
    NOTA: Os animais do grupo simulado não sofreram impacto, pois a gota de latão foi liberada sem fazer contato com o capacete na cabeça do rato.
18. Abaixe a mesa elevatória. Remova o rato da estrutura estereotáxica e coloque-o em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento.
19. Registre o tempo do reflexo de endireitamento, que é o momento em que o animal tenta mudar da posição supina para a posição prona^26,27.
    NOTA: Os animais submetidos ao CHI repetitivo foram novamente anestesiados 3 min antes do^2º impacto. Para os animais do grupo SMCx/duplo/10 min que não voltaram para a posição prona a tempo, o tempo correspondente de reflexo de endireitamento foi registrado como 420 s.
20. Após o registro do reflexo de endireitamento, anestesiar o rato com isoflurano novamente usando a etapa 1.1.
21. Imobilize o rato com o quadro estereotáxico usando a etapa 1.2.
    NOTA: Depois de confirmar a estabilidade do capacete na parte superior do stull, repita os passos 1.13-1.17 novamente para realizar o^2º impacto.
22. Remova o capacete. Remova todo o tecido conjuntivo e cimento no topo do crânio.
23. Cubra o crânio com o cimento dental e deixe secar. Verifique se o cimento dentário está rígido e duro usando a pinça traseira.
    NOTA: O cimento dentário foi aplicado no topo do crânio para eliminar artefatos de suscetibilidade causados pelas interfaces crânio-ar ou crânio-sangue entre o crânio e o couro cabeludo no pós-operatório.
24. Feche a incisão com suturas cirúrgicas de náilon 4-0 com 4-5 nós independentes.
    NOTA: A ferida tem aproximadamente 2-2,5 cm de comprimento. Certifique-se de que as suturas cirúrgicas não tenham ação capilar e sejam feitas de material de seda ou nylon. Não suturar a incisão com um único nó para evitar a abertura da ferida pelo arranhão do animal.
25. Aplique antibióticos tópicos (creme Dermanest) no local da cirurgia para prevenir infecções.
26. Injete 1 mL / kg de peso corporal de carprofeno (50 mg / mL) por via subcutânea no pescoço como analgésico pós-operatório.
27. Coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento até que ele recupere a consciência. Assim que o rato se sentar ereto, devolva-o à gaiola de casa.
28. Administrar por via oral 5 mL de paracetamol (24 mg/mL) misturado em 200 mL de água ao animal diariamente como analgésico por 3 dias consecutivos após a cirurgia.

2. Ressonância magnética (MRI)

NOTA: A imagem ponderada em T2 e a imagem por tensor de difusão são realizadas usando um sistema PET/MR 7T sequencial antes do CHI, bem como em 1 e 50 dias após a lesão (Figura 1). Uma ressonância magnética basal foi realizada dentro de 1 semana antes do procedimento de CHI. Para as avaliações em 1 e 50 dias pós-CHI, as avaliações comportamentais foram realizadas pela manhã, seguidas de exames de ressonância magnética à tarde no mesmo dia.

1. Anestesiar o rato em uma pequena câmara de indução cheia de uma mistura de isoflurano (5%) e ar medicinal (2,5-3 L/min).
2. Uma vez que o rato não responda a um beliscão da pata ou da cauda, suspenda temporariamente a anestesia ao transferir para o berço do animal em uma posição de cabeça para baixo.
3. Posicione o rato no suporte de cabeça conectado a um cone de nariz, fornecendo isoflurano a 2% com ar medicinal a uma taxa de fluxo de 1,5-2 L/min para manutenção durante a aquisição da imagem.
4. Fixe a cabeça com um pequeno pedaço de fita adesiva para evitar movimento durante a digitalização.
   NOTA: Aplique um pouco de pasta de dente na cabeça do rato no primeiro dia pós-CHI para evitar artefatos de suscetibilidade magnética devido à remoção do couro cabeludo^28,29.
5. Coloque uma almofada de pressão sob o tórax do rato para monitorar a respiração. Prenda os clipes do oxímetro no membro posterior para monitorar a frequência cardíaca.
6. Insira a sonda retal para medir a temperatura retal. Cubra o rato com um cobertor de aquecimento com água morna circulante e envoltório de lenço de papel durante o experimento para manter a temperatura corporal.
   NOTA: Ao longo do experimento, monitore as condições fisiológicas, incluindo frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura retal. Antes de escanear, verifique todos os sinais fisiológicos do rato para garantir a qualidade do monitor de sinais vitais.
7. Use o sistema de posicionamento a laser do scanner PET/MR para marcar o centro da cabeça para um alinhamento preciso.
8. Mova o animal para o orifício de ressonância magnética automaticamente usando o sistema de transporte de animais motorizado até que o centro da cabeça se alinhe com o isocentro do scanner.
   NOTA: O sistema de transporte de animais motorizado integrado ao sistema PET/MR garante o posicionamento preciso do animal e agiliza o fluxo de trabalho ao fazer a transição entre as modalidades de imagem.
9. Obtenha a sequência de ressonância magnética.
   1. Execute a localização inicial e o ajuste geral.
   2. Use o corte sagital do meio e alinhe o^8º corte do anterior com a decussação da comissura anterior.
      NOTA: Os cortes coronais são posicionados perpendicularmente ao plano horizontal definido pela linha que liga a comissura anterior e a base do cerebelo, correspondendo a um ângulo de aproximadamente 15° em relação ao longo eixo do corpo caloso. Os principais parâmetros da varredura T2-RARE para o corte sagital médio são os seguintes: tempo de repetição (TR) = 2500 ms, tempo de eco (TE) = 44 ms, campo de visão (FOV) = 3,5 cm, tamanho da matriz = 256 256, espessura do corte = 1 mm, número de cortes = 1, fator RARE = 8, largura de banda = 75 kHz, número de médias = 1, tempo de aquisição = 1 min 20 s.
   3. Use aquisição rápida com realce de relaxamento (RARE) com supressão de gordura e uma banda de saturação sob o cérebro para obter imagens ponderadas em T2 para referência anatômica (Figura 2).
      NOTA: Os principais parâmetros da varredura T2-RARE são os seguintes: tempo de repetição (TR) = 3600 ms, tempo de eco (TE) = 40 ms, campo de visão (FOV) = 2 cm, tamanho da matriz = 256 256, espessura do corte = 1 mm, número de cortes = 16, fator RARE = 8, largura de banda = 75 kHz, número de médias = 8, tempo de aquisição = 7 min 40 s.
   4. Use um EPI spin-eco de 4 disparos para adquirir imagens de tensor de difusão (Figura 2).
      NOTA: Os principais parâmetros da varredura DTI são os seguintes: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, campo de visão (FOV) = 2 cm, tamanho da matriz = 96 96, espessura = 1 mm, número de cortes = 16, duração do pulso (δ) = 5 ms, tempo entre os dois pulsos (Δ) = 15 ms, número de B0 = 5, número de direções = 30, valor b = 1000 s/mm³, largura de banda = 150 kHz, número de média = 4, tempo de aquisição = 14 min.
   5. Conclua o protocolo de digitalização. Deslize o berço do animal para fora do ímã. Retire o animal do berço.
   6. Transfira o rato para uma gaiola limpa com uma almofada de aquecimento embaixo para manter a temperatura corporal. Devolva o rato à sua gaiola de origem assim que recuperar a consciência.
10. Pré-processamento de imagem
    NOTA: Use MRtrix3, software de mapeamento paramétrico estatístico (SPM) e scripts MATLAB personalizados para processamento e análise de dados.
    1. Reduza o ruído das imagens DTI usando o comando MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. Remova os artefatos de toque de Gibb das imagens DTI usando o comando MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. Registre imagens DTI em imagens ponderadas em T2 de um único assunto em varreduras longitudinais usando funções SPM (spm_coreg e spm_powell).
    4. Execute a remoção do crânio em imagens ponderadas em T2 contornando manualmente a área do cérebro fatia por fatia, seguida pela remoção de pixels com intensidade abaixo do limite calculado determinado pelo método³¹ de Otsu (script MATLAB personalizado thr_otsu2.m).
    5. Realizar o corregistro entre sujeitos entre animais do mesmo grupo experimental usando funções SPM (spm_coreg.m e spm_powell.m). Aplique a máscara cerebral nas imagens DTI correspondentes.
       NOTA: A remoção do crânio é realizada para diminuir o tempo de processamento do computador.
    6. Calcule mapas tensoriais com base em DTI (script MATLAB personalizado, tensormap.m).
    7. Calcular mapas FA (script MATLAB personalizado, calFA.m)
       NOTA: Todos os scripts MATLAB personalizados estão disponíveis através do seguinte banco de dados (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
11. Análise de imagem-FA
    1. Desenhe regiões de interesse (ROIs) no córtex e corpo caloso (CC) para as três fatias consecutivas de imagem abaixo da coordenada de CHI.
       NOTA: Todas as ROIs foram desenhadas manualmente e inspecionadas visualmente quanto a erros grosseiros por 2 investigadores experientes cegos para os grupos experimentais.
    2. Extraia e calcule a média do valor de FA dos ROIs.
       NOTA: Para o corpo caloso abaixo do córtex, pixels com valores de FA < 0,35 foram excluídos no ROI selecionado para eliminar efeitos parciais de volume. Para o córtex, todos os pixels com valores de FA < 0,35 no ROI foram recrutados para análise.
12. Análise de imagem-Volume
    1. Desenhe manualmente ROIs cobrindo as regiões corticais para 11 fatias de imagem consecutivas em Bregma -7 a +3 mm.
       NOTA: Todas as ROIs foram desenhadas manualmente por 2 investigadores experientes cegos para os grupos experimentais.
    2. Some o total de pixels das ROIs entre as fatias e transforme-os em volume multiplicando a espessura da fatia (1 mm).
    3. Normalize o volume cortical após o CHI com o volume correspondente antes do CHI de cada animal.
       NOTA: Normalize os dados para eliminar diferenças individuais no volume cerebral entre os animais antes da apresentação.

3. Avaliação de comportamento

NOTA: Os experimentos comportamentais são realizados usando o teste de equilíbrio de caminhada de feixe e mNSS antes do CHI, bem como em 1 e 50 dias pós-CHI (Figura 1). Toda a avaliação foi realizada por pelo menos dois observadores para garantir a precisão, consistência e objetividade dos dados coletados.

1. Teste de equilíbrio de caminhada do feixe
   1. Ligue a câmera de vídeo e inicie o cronômetro.
   2. Coloque os ratos em uma extremidade da trave de equilíbrio (3 cm de profundidade, 3 cm de largura, 80 cm de comprimento e 60 cm acima do chão).
   3. Pare o cronômetro quando o rato completar uma viagem de ida e volta, cair ou congelar por mais de 3 minutos.
      1. Durante o experimento, observe a condição do animal para a avaliação usando mNSS 11,32,33,34. Siga estes padrões para avaliação:
      2. Se o rato mantiver o equilíbrio com uma postura firme na trave, atribua uma pontuação de 0.
      3. Se o rato agarrar o lado da viga, atribua uma pontuação de 1.
      4. Se o rato cair com um membro fora da viga, atribua uma pontuação de 2.
      5. Se o rato cair com dois membros fora ou girar na trave (>60 s), atribua uma pontuação de 3.
      6. Se o rato tentar se equilibrar na trave, mas cair (>40 s), atribua uma pontuação de 4.
      7. Se o rato tentar se equilibrar na trave, mas cair (>20 s), atribua uma pontuação de 5.
      8. Se o rato não tentar se equilibrar ou se pendurar na viga e cair dentro de 20 s, atribua uma pontuação de 6.
      9. Se o rato não conseguir completar a tarefa, considere-a como tendo levado o tempo máximo de 3 minutos e atribua uma pontuação de 6.
   4. Agende dias de teste em pontos de tempo específicos.
      NOTA: Exclua os ratos que não completaram a viagem de ida e volta da caminhada do feixe por dois ensaios antes do CHI da cirurgia subsequente e da avaliação comportamental de acompanhamento.
2. Escore de gravidade neurológica modificada (mNSS)
   NOTA: a avaliação da mNSS inclui testes motores, testes sensoriais, ausência de reflexo, movimentos anormais, equilíbrio da trave e caminhada no chão ^32,33, que foi realizada rapidamente no dia a dia.
   1. Realize testes motores.
      1. Levante o rato pela base da cauda e observe os reflexos de seus membros por cerca de 15 s para avaliar a flexão e extensão adequadas.
      2. Se for observada flexão normal no membro anterior, atribua uma pontuação de 0. Se nenhuma flexão for observada, atribua uma pontuação de 1.
      3. Se a flexão normal for observada no membro posterior, atribua uma pontuação de 0. Se nenhuma flexão for observada, atribua uma pontuação de 1.
      4. Se a cabeça se mover >10° em relação ao eixo vertical dentro de 30 s após levantar o rato pela cauda, atribua uma pontuação de 0. Caso contrário, atribua uma pontuação de 1.
         NOTA: Um máximo de 3 pontuações serão atribuídas nesta sessão do teste.
   2. Realize testes de colocação de membros.
      NOTA: O teste de colocação é realizado para avaliar a coordenação entre a função sensorial (visual, sensação tátil e propriocepção) e motora.
      1. Abaixe lentamente o rato em direção à superfície da mesa. Observe se as patas dos ratos alcançaram e se esticaram em direção à superfície.
      2. Se os ratos alcançaram a superfície com os dois membros esticados e para a frente, atribua uma pontuação de 0. Se houver um atraso ou nenhuma resposta, atribua uma pontuação de 1.
      3. Coloque o rato na superfície e puxe a pata contra a borda da mesa. Observe se sua pata retorna a uma posição normal na superfície da mesa.
      4. Se forem observadas respostas imediatas e normais de colocação, atribua uma pontuação de 0. Se forem observadas respostas de colocação atrasadas, atribua uma pontuação de 1. Se não houver resposta, atribua uma pontuação de 2.
         NOTA: Um máximo de 3 pontuações serão atribuídas nesta sessão do teste.
   3. Observe refletir ausência e movimentos anormais.
      1. Observe os movimentos de cabeça para avaliar o reflexo do pavilhão auricular ao tocar o conduto auditivo com a ponta de algodão de um cotonete.
      2. Se um reflexo normal for observado, atribua uma pontuação de 0. Se nenhum reflexo for observado, atribua uma pontuação de 1.
      3. Avalie a presença do reflexo da córnea tocando a córnea com a ponta de algodão de um cotonete.
      4. Se uma resposta normal for obtida, atribua uma pontuação de 0. Se nenhuma resposta ao piscar de olhos for obtida, atribua uma pontuação de 1.
      5. Faça um aplauso curto e forte com as mãos. Observe a presença do reflexo de sobressalto.
      6. Se um reflexo for observado, atribua uma pontuação de 0. Se nenhum reflexo for observado, atribua uma pontuação de 1.
      7. Observe se o rato tem convulsões, mioclonia ou miodistonia.
      8. Se algum deles ocorrer, atribua uma pontuação de 1.
         NOTA: Um máximo de 4 pontuações serão atribuídas nesta sessão do teste.
   4. Realize o teste de equilíbrio do feixe, conforme descrito anteriormente (etapa 3.1).
      NOTA: Um máximo de 6 pontuações serão atribuídas nesta sessão do teste.
   5. Realize o teste de caminhada no chão.
      1. Prepare a arena de campo aberto (75 cm de comprimento, 50 cm de largura e 40 cm de profundidade). Certifique-se de que esteja limpo e livre de quaisquer sinais de odor anteriores.
      2. Coloque um rato no centro da arena de campo aberto e observe como o rato anda na arena.
      3. Se o rato realizar uma caminhada regular, atribua uma pontuação de 0.
      4. Se o rato não puder andar em linha reta, atribua uma pontuação de 1.
      5. Se o rato cair para o lado parético depois de colocá-lo no chão, atribua uma pontuação de 3.
         NOTA: Um máximo de 3 pontuações serão atribuídas nesta sessão do teste.
   6. Some todas as pontuações; A pontuação máxima possível é 18.
      NOTA: A pontuação mais alta indica um resultado pior.

4. Imuno-histologia

1. Realizar perfusão transcardíaca³⁵.
   NOTA: A perfusão transcardíaca é realizada após a ressonância magnética 50 dias após o TCI (Figura 1).
   1. Coloque o rato em uma pequena câmara de indução e anestesiá-lo com isoflurano (5%) até que não responda a um beliscão da pata ou da cauda.
   2. Administre 50 mg / kg de peso corporal de zoletil (50 mg / mL) e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina (Roumpun, 23,32 mg / mL) por injeção intraperitoneal para anestesia profunda.
   3. Coloque o rato em decúbito dorsal.
   4. Faça uma incisão transversal de aproximadamente 4-5 cm de comprimento sob o tórax usando uma tesoura.
   5. Localize o diafragma e corte-o para expor o coração.
   6. Use uma pinça hemostática para pinçar a artéria pulmonar e, em seguida, faça uma incisão de aproximadamente 0,5-1 cm de comprimento no átrio direito.
   7. Conecte a agulha à tubulação conectada à bomba de infusão.
   8. Insira a agulha no ventrículo esquerdo.
   9. Enxágue o animal por perfusão transcardíaca (40 mL/min) com 500 mL de soro fisiológico a 0,9% até que o sangue esteja limpo.
   10. Perfundir o animal através de perfusão transcardíaca (40 mL/min) com 500 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% para fixação.
   11. Remova a cabeça do rato e retire cuidadosamente o tecido cerebral do crânio.
   12. Preserve o cérebro em aproximadamente 20 mL de PFA a 4% no frasco por 48 h para pós-fixação.
2. Realize o processamento de tecidos e coloração IHC ^36,37.
   NOTA: Realize a coloração imuno-histoquímica em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina usando o kit do sistema de detecção secundária de imunoperoxidase.
   1. Use seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina.
   2. Realize a desparafinização e trate as lâminas com 3% de H₂O₂ para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Efectuar a recuperação do antigénio utilizando tampão citrato a 90 °C.
   3. Realize a coloração imuno-histoquímica usando o kit do sistema de detecção secundária da imunoperoxidase.
      NOTA: Os procedimentos de coloração são realizados de acordo com as recomendações do fabricante.
   4. Use hematoxilina para contra-corar as amostras.
   5. Monte as amostras com um reagente antidesbotamento.
   6. Use anticorpos anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para coloração imuno-histoquímica.
   7. Adquira as imagens de ROIs usando um scanner de lâminas de microscópio de luz (Figura 6).

5. Análise estatística de comportamentos e resultados de imagem

NOTA: No presente estudo, a análise estatística foi realizada no SPSS; no entanto, a análise estatística pode ser realizada em outras caixas de ferramentas estatísticas.

1. Carregue os dados no formato largo em um arquivo SPSS *.sav.
2. Realize a análise de variância de medidas repetidas (ANOVA) para comparar os resultados comportamentais (peso normalizado, mNSS e duração da caminhada do feixe) e de imagem (valores de FA no córtex e CC) ao longo do tempo entre os grupos.
   1. Clique em Analisar > Modelo Linear Geral > Medidas Repetidas.
   2. Atribua um nome na caixa Nome do fator dentro do assunto (por exemplo, tempo) e coloque '3' na caixa Número de níveis (três níveis com diferentes pontos de tempo de acompanhamento). Atribua um nome na caixa Nome da Medida (por exemplo, mNSS) na caixa de diálogo Medidas Repetidas Definem Fator(es).
   3. Carregue as variáveis dentro do sujeito (dados adquiridos no pré, D1 e D50 pós-CHI) que precisam ser testadas e especifique o fator entre os sujeitos (por exemplo, grupos de animais com diferentes parâmetros de impacto) na caixa de diálogo Medidas repetidas .
   4. Selecione Bonferroni como um teste post hoc para fator(es) (por exemplo, grupos de animais) na caixa de diálogo comparações múltiplas post hoc para médias observadas .
      NOTA: Para corrigir comparações múltiplas, o erro tipo I foi ajustado usando correções de Bonferroni (0,05/3) para as comparações ao longo do tempo. A significância estatística foi definida como p < 0,05 (SPSS ajustado).
3. Realize uma análise ANOVA unidirecional para comparar o reflexo de endireitamento e a mudança do volume cortical entre os grupos.
   1. Clique em Analisar > comparar médias > ANOVA unidirecional.
   2. Carregar as variáveis (reflexo de endireitamento e alteração do volume cortical) na Lista dependente e os grupos como o Fator no diálogo ANOVA unidirecional .
   3. Selecione Bonferroni como um teste post hoc na caixa de diálogo ANOVA unidirecional: Comparações múltiplas post hoc .
      NOTA: Para corrigir comparações múltiplas, o erro tipo I foi ajustado usando correções de Bonferroni (0,05/5) para as comparações entre os grupos. A significância estatística foi definida como p < 0,05 (SPSS ajustado).

A Figura 2 mostra ressonâncias magnéticas longitudinais de animais representativos com CHI simulado e repetitivo no SMCx. Nenhuma fratura craniana significativa ou contusão cerebral foi encontrada nas imagens ponderadas em T2 em 1 e 50 dias pós-CHI. Nenhum edema ou deformação significativa da MW foi encontrado nos mapas de AF em 1 e 50 dias pós-CHI. Todos os animais submetidos ao CHI neste estudo sobreviveram a toda a duração experimental de 50 dias...

Este estudo teve como objetivo estabelecer um modelo animal de lesão cerebral traumática leve não complicada (mTBI) para avaliar os efeitos cumulativos de lesões únicas e repetitivas, bem como os resultados dos impactos em diferentes regiões do cérebro. O modelo de lesão de cabeça fechada (CHI), adaptado do paradigma de lesão de queda de peso de cabeça fechada, foi projetado para imitar concussões comumente experimentadas por atletas e indivíduos com proteção de capacete. ...

Os autores não têm potenciais conflitos de interesse a divulgar.

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (NSTC) de Taiwan (NSTC 113-2314-B-A49-047).