Sviluppo di un modello non complicato di lesione cerebrale traumatica lieve modificato con il metodo della caduta di peso ed evidenziato dalla risonanza magnetica

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello animale di trauma cranico chiuso che replica l'esito della neuroimmagine di una lesione cerebrale traumatica lieve non complicata con la struttura cerebrale preservata nella fase acuta e l'atrofia cerebrale a lungo termine. La risonanza magnetica longitudinale è il metodo principale utilizzato per l'evidenza.

La lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI), nota come commozione cerebrale, rappresenta oltre l'85% delle lesioni cerebrali a livello globale. In particolare, l'mTBI non complicato che mostra risultati negativi nell'imaging clinico di routine nella fase acuta ostacola un'assistenza precoce e appropriata in questi pazienti. È stato riconosciuto che diversi parametri di impatto possono influenzare e persino accelerare il progresso dei successivi sintomi neuropsicologici a seguito di mTBI. Tuttavia, l'associazione dei parametri di impatto durante la commozione cerebrale con l'esito non è stata ampiamente esaminata. Nel presente studio, è stato descritto e dimostrato in dettaglio un modello animale con lesione cranica chiusa (CHI) modificata rispetto al paradigma della lesione da caduta di peso. I ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (n = 20) sono stati assegnati in modo casuale a gruppi CHI con diversi parametri di impatto (n = 4 per gruppo). Gli studi di imaging RM longitudinale, tra cui l'imaging pesato in T2 e l'imaging del tensore di diffusione, e le valutazioni comportamentali sequenziali, come il punteggio di gravità neurologica modificato (mNSS) e il test di camminata del fascio, sono stati condotti per un periodo di studio di 50 giorni. La colorazione immunoistochimica per l'astrogliosi è stata eseguita il giorno 50 dopo l'infortunio. Prestazioni comportamentali peggiori sono state osservate negli animali che seguivano CHI ripetitivo rispetto al gruppo con lesione singola e sham. Utilizzando la risonanza magnetica longitudinale (MRI), non è stata osservata alcuna contusione cerebrale significativa a 24 ore dopo l'infortunio. Tuttavia, l'atrofia corticale e l'alterazione dell'anisotropia frazionata corticale (FA) sono state dimostrate il giorno 50 dopo l'infortunio, suggerendo il successo della replicazione clinica non complicata del mTBI. Ancora più importante, i cambiamenti negli esiti neurocomportamentali e nelle caratteristiche dell'immagine osservati dopo l'mTBI dipendevano dal numero di impatto, dagli intervalli tra le lesioni e dal sito di impatto selezionato negli animali. Questo modello di mTBI in vivo , combinato con la risonanza magnetica preclinica, fornisce un mezzo per esplorare la lesione cerebrale su scala dell'intero cervello. Consente inoltre lo studio di biomarcatori di imaging sensibili all'mTBI in diversi parametri di impatto e livelli di gravità.

La lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) si osserva principalmente negli atleti impegnati in sport di contatto, nei veterani militari e nelle persone coinvolte in incidenti stradali¹. Rappresenta oltre l'85 % di tutte le lesioni alla testa segnalate². L'ampia eziologia dell'mTBI e la sua crescente incidenza globale sottolineano l'inclusione dell'mTBI come fattore di rischio ambientale provvisorio della malattia neurodegenerativa ad esordio tardivo³. Il trauma cranico lieve non complicato è caratterizzato da un punteggio del coma di Glasgow (GCS) di 13-15, senza anomalie strutturali osservate nella tomografia computerizzata (TC) o nella risonanza magnetica per immagini (MRI). I sintomi comuni riscontrati dai pazienti con mTBI non complicato includono mal di testa, vertigini, nausea o vomito e affaticamento. Tuttavia, la valutazione longitudinale degli esiti a seguito di mTBI non complicata presenta sfide considerevoli a causa dell'elevato tasso di abbandono nei pazienti⁴.

Le preoccupazioni per l'mTBI ripetitivo sono aumentate, in particolare all'interno della comunità degli atleti professionisti della National Football League (NFL), aumentando successivamente la consapevolezza tra gli atleti non professionisti⁵. Si presume che la vulnerabilità cerebrale aumenti dopo l'mTBI iniziale, con successivi insulti che potenzialmente esacerbano gli esiti delle lesioni. Recenti scoperte della più grande coorte di giocatori di football hanno donato il cervello non solo implicando una precedente partecipazione al calcio nella gravità dell'encefalopatia traumatica cronica (CTE), ma hanno anche suggerito una correlazione tra diversi fattori legati al calcio e il rischio e la gravità della CTE⁶. Pertanto, la preoccupazione per l'influenza del numero di commozioni cerebrali e del regime ripetitivo sugli esiti degli infortuni sta crescendo. La ricerca preclinica ha esplorato i cambiamenti neuropatologici, la cascata neuroinfiammatoria e la compromissione neuropsicologica dopo mTBI ripetitivo utilizzando vari modelli di trauma cranico chiuso (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . Tuttavia, l'indagine sui parametri di impatto sul modello mTBI non complicato, che può imitare da vicino gli impatti ripetuti della testa concussivi legati allo sport con conseguente compromissione funzionale nella fase acuta e atrofia cerebrale nella fase cronica, non è stata ben esaminata.

L'imaging del tensore di diffusione (DTI), una tecnica che valuta la diffusione delle molecole d'acqua, è stata comunemente utilizzata negli studi che indagano gli effetti dell'mTBI. L'anisotropia frazionaria (FA), una metrica chiave derivata dalla DTI, quantifica il grado di coerenza della diffusività dell'acqua e fornisce informazioni riguardanti l'organizzazione strutturale degli assoni e dei fasci di fibre nervose. La perturbazione dei valori di FA nella sostanza bianca (WM) è stata proposta seguendo mTBI in vari modelli 8,10,11,15,16,17. Inoltre, la diffusività assiale (AD) e la diffusività radiale (RD), che indicano l'integrità assonale e mielinica, sono cambiate dopo mTBI negli studi preclinici 10,15,16,18,19,20. Tuttavia, le discrepanze nei risultati del DTI tra gli studi precedenti sono probabilmente dovute a variazioni nella gravità dell'mTBI, differenze nei parametri di impatto, diversi modelli di mTBI e punti temporali di follow-up post-infortunio incoerenti⁹.

L'attuale documento protocollare, quindi, mira a stabilire un modello animale di mTBI progettato per valutare gli effetti cumulativi di mTBI singolo e ripetitivo. Abbiamo incorporato valutazioni complete e longitudinali, comprese le valutazioni del benessere degli animali, gli esiti comportamentali, i parametri DTI e il volume corticale, per catturare i cambiamenti dinamici post-infortunio ed esplorare gli effetti di diversi parametri di impatto. Dimostrando sia la compromissione funzionale acuta che i cambiamenti microstrutturali a lungo termine, questo modello replica efficacemente le caratteristiche chiave dell'mTBI non complicato che non sono state completamente affrontate in precedenti studi sugli animali. Qui, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per lo sviluppo di un modello mTBI non complicato utilizzando un metodo di caduta del peso a testa chiusa modificato ^8,11 e conducendo una valutazione longitudinale dopo mTBI.

Lo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni delle linee guida del National Institutes of Health per la ricerca sugli animali (Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio) e le linee guida per la ricerca sugli animali: segnalazione di esperimenti in vivo. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della National Yang Ming Chiao Tung University. Venti animali sono stati assegnati in modo casuale a 5 gruppi (n = 4 per gruppo): (i) impatto singolo alla corteccia sensomotoria (SMCx/singolo), (ii) doppio impatto a SMCx con intervallo di 1 ora (SMCx/2 colpi/1 ora), (iii) doppio impatto a SMCx con intervallo di 10 minuti (SMCx/2 colpi/10 min), (iv) doppio impatto al cervello centrale con l'intervallo di 1 ora (Centrale/2 colpi/1 ora), e (v) il gruppo fittizio con solo intervento chirurgico ma non impatto diretto sulla testa, per la valutazione longitudinale dell'esito (Figura 1). Da notare che gli intervalli tra gli infortuni selezionati per questo studio (intervalli di 1 ora contro 10 minuti) sono stati progettati per imitare gli impatti subconcussivi ripetitivi 8,10,11,13,21, che possono essere fino a mille volte in una singola stagione, sperimentati dagli atleti che praticano sport di contatto^22,23.

1. Induzione di trauma cranico chiuso (CHI)

NOTA: I ratti maschi adulti di Sprague-Dawley di età compresa tra 10 e 12 settimane e di peso superiore a 250 g sono alloggiati in un ciclo luce/buio di 12/12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.

1. Posizionare il ratto in una piccola camera di induzione e anestetizzarlo con una miscela di isoflurano (5%) e aria medica (2,5-3 L/min). Rimuovi il ratto dalla camera finché non risponde a un pizzicamento della zampa o della coda.
2. Posiziona il topo sul termoforo.
   NOTA: Accendere il termoforo durante l'intervento chirurgico per mantenere la temperatura corporea dei ratti.
3. Porta il ratto su un telaio stereotassico e fissalo con una barra per denti. Somministrare isoflurano al 2% utilizzando il cono nasale collegato con aria medica a una portata di 1,5-2 L/min per il mantenimento durante l'intervento chirurgico.
4. Posizionare le barre auricolari. Assicurati che il ratto sia centrato e simmetrico sul telaio stereotassico.
   NOTA: Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite in condizioni asettiche. Gli strumenti sono stati sterilizzati prima dell'intervento chirurgico utilizzando un'autoclave a vapore e le loro punte sono state ulteriormente sterilizzate con uno sterilizzatore a microsfere durante la procedura. Per prevenire la contaminazione, è stato posizionato un telo chirurgico sull'animale. Il chirurgo indossava un berretto per coprire i capelli, una maschera per coprire il viso ed era dotato di camice da laboratorio e guanti chirurgici durante la procedura²⁴.
5. Metti il sensore del pulsossimetro sulla zampa posteriore dell'animale per monitorare la frequenza respiratoria, la frequenza cardiaca, il livello di ossigeno nel sangue e la temperatura corporea dell'animale.
6. Iniettare 1 mL/kg di peso corporeo di lidocaina (20 mg/mL) per via sottocutanea nel collo del ratto come analgesico.
7. Applicare la crema depilatoria sulla testa dell'animale e attendere 3 minuti. Pulisci la crema con tamponi di alcol isopropilico al 70%.
8. Pulire più volte la zona rasata utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di iodio. Rimuovere i residui di iodio utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.
9. Creare un'incisione della linea mediana di circa 2-2,5 cm di lunghezza nella pelle rasata utilizzando una lama chirurgica sterile per accedere alla superficie del cranio.
10. Rimuovere il tessuto sull'osso usando un batuffolo di cotone per esporre il cranio. Pulisci la superficie del cranio con un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione fisiologica allo 0,9%, quindi puliscilo con un batuffolo di cotone asciutto.
    NOTA: Le suture del cranio e sia la bregma che la lambda possono ora essere facilmente identificate.
11. Identificare la bregma come punto di riferimento per scoprire ulteriormente l'area di impatto in base alle coordinate.
    NOTA: In questo protocollo, vengono utilizzati due set di coordinate per l'induzione del CHI: (-2,5,-2,0) (2,5 mm lateralmente 2,0 mm posteriormente al bregma) sulla parte superiore della corteccia sensomotoria (SMCx), nonché (0,-3,0) sulla parte superiore del cervello centrale (centrale).
12. Identifica le coordinate scelte sulla superficie del cranio e incolla un casco circolare in acciaio inossidabile (10 mm di diametro e 1 mm di spessore) sull'area designata utilizzando cemento dentale. Rimuovere il termoforo e il pulsossimetro.
13. Spostare il dispositivo stereotassico e il ratto sulla piattaforma elevatrice (14 cm di lunghezza, 8 cm di larghezza e 6,15 cm di profondità) sotto l'impattatore CHI.
14. Sollevare il corpo del ratto utilizzando una spugna di schiuma (19 cm di lunghezza, 10 cm di larghezza e 4 cm di profondità, con una densità di 18 kg/m³).
15. Rimuovere il ratto dalle barre auricolari della montatura stereotassica. Tenere il ratto fermo sulla barra del dente collegata al cono del naso, erogando il 2% di isoflurano. Assicurarsi che la testa e il corpo siano allineati a livello in direzione rostrale-caudale.
16. Regolare la piattaforma elevatrice per garantire che non ci sia spazio tra l'impattatore CHI e il casco. Spegnere l'isoflurano 5 s subito prima dell'impatto.
    NOTA: Per specificare il riflesso di raddrizzamento dovuto a lesione cerebrale, è stata eseguita la sospensione temporanea dell'isoflurano²⁵.
17. Far cadere un ottone da 600 g da un'altezza di 1 m attraverso un tubo di acciaio inossidabile (1 m di altezza con un diametro interno di 20 mm per liberare una colonna di pesi in ottone inossidabile) fino all'impattatore sicuro con una punta rotonda che punta verso il casco di metallo.
    NOTA: Gli animali del gruppo fittizio non hanno subito un impatto, poiché la goccia di ottone è stata rilasciata senza entrare in contatto con l'elmetto sulla testa del topo.
18. Abbassare la piattaforma elevatrice. Rimuovere il ratto dal telaio stereotassico e posizionare il ratto in posizione supina su un termoforo.
19. Registra il tempo del riflesso di raddrizzamento, che è il momento in cui l'animale tenta di passare dalla posizione supina alla posizione prona^26,27.
    NOTA: Gli animali sottoposti al CHI ripetitivo sono stati nuovamente anestetizzati 3 minuti prima del 2^° impatto. Per gli animali del gruppo SMCx/doppio/10 min che non sono tornati in tempo alla posizione prona, il tempo corrispondente del riflesso di raddrizzamento è stato registrato come 420 s.
20. Dopo la registrazione del riflesso raddrizzante, anestetizzare nuovamente il ratto con isoflurano utilizzando il passaggio 1.1.
21. Immobilizzare il ratto con il telaio stereotassico utilizzando il passaggio 1.2.
    NOTA: Dopo aver confermato la stabilità del casco sulla parte superiore dello stull, ripetere nuovamente i passaggi 1.13-1.17 per eseguire il 2^{° impatto.}
22. Togliete il casco. Rimuovere tutto il tessuto connettivo e il cemento sulla parte superiore del cranio.
23. Copri il cranio con il cemento dentale e lascialo asciugare. Verificare che il cemento dentale sia rigido e duro utilizzando la pinzetta posteriore.
    NOTA: Il cemento dentale è stato applicato sopra il cranio per eliminare gli artefatti di suscettibilità causati dalle interfacce cranio-aria o cranio-sangue tra il cranio e il cuoio capelluto dopo l'intervento chirurgico.
24. Chiudere l'incisione utilizzando suture chirurgiche in nylon 4-0 con 4-5 nodi indipendenti.
    NOTA: La ferita è lunga circa 2-2,5 cm. Assicurarsi che le suture chirurgiche non abbiano azione capillare e siano realizzate in materiale di seta o nylon. Non suturare l'incisione utilizzando un solo nodo per evitare l'apertura della ferita a causa del graffio dell'animale.
25. Applicare antibiotici topici (crema Dermanest) sul sito chirurgico per prevenire le infezioni.
26. Iniettare 1 mL/kg di peso corporeo di carprofene (50 mg/mL) per via sottocutanea nel collo come analgesici post-operatori.
27. Metti il topo in una gabbia pulita su un termoforo finché non riprende conoscenza. Una volta che il topo si siede in posizione eretta, rimettilo nella gabbia di casa.
28. Somministrare per via orale 5 mL di paracetamolo (24 mg/mL) miscelato in 200 mL di acqua all'animale ogni giorno come analgesico per 3 giorni consecutivi dopo l'intervento chirurgico.

2. Risonanza magnetica per immagini (MRI)

NOTA: L'immagine pesata in T2 e l'imaging del tensore di diffusione vengono eseguiti utilizzando un sistema sequenziale PET/MR 7T prima del CHI, nonché 1 e 50 giorni dopo l'infortunio (Figura 1). Una risonanza magnetica di base è stata eseguita entro 1 settimana prima della procedura CHI. Per le valutazioni a 1 e 50 giorni dopo il CHI, le valutazioni comportamentali sono state condotte al mattino, seguite da scansioni MRI nel pomeriggio dello stesso giorno.

1. Anestetizzare il ratto in una piccola camera di induzione riempita con una miscela di isoflurano (5%) e aria medica (2,5-3 L/min).
2. Una volta che il ratto non risponde a un pizzicamento della zampa o della coda, sospendere temporaneamente l'anestesia durante il trasferimento nella culla dell'animale in posizione prona a testa in giù.
3. Posizionare il ratto nel supporto per la testa collegato con un cono anteriore, erogando isoflurano al 2% con aria medicale a una portata di 1,5-2 L/min per il mantenimento durante l'acquisizione dell'immagine.
4. Fissare la testina con un piccolo pezzo di nastro adesivo per evitare movimenti durante la scansione.
   NOTA: Applicare un po' di dentifricio sulla testa del ratto il primo giorno post-CHI per prevenire artefatti di suscettibilità magnetica dovuti alla rimozione del cuoio capelluto ^28,29.
5. Posizionare un cuscinetto a pressione sotto il torace del ratto per monitorare la respirazione. Fissare con nastro adesivo l'ossimetro all'arto posteriore per monitorare la frequenza cardiaca.
6. Inserire la sonda rettale per misurare la temperatura rettale. Coprire il ratto con una coperta riscaldante con acqua calda circolante e un involucro di tessuto durante l'esperimento per mantenere la temperatura corporea.
   NOTA: Durante l'esperimento, monitorare le condizioni fisiologiche, tra cui frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e temperatura rettale. Prima della scansione, controllare tutti i segnali fisiologici del ratto per garantire la qualità del monitor dei segni vitali.
7. Utilizzare il sistema di posizionamento laser dello scanner PET/MR per contrassegnare il centro della testa per un allineamento preciso.
8. Spostare automaticamente l'animale nel foro della risonanza magnetica utilizzando il sistema di trasporto motorizzato degli animali fino a quando il centro della testa non si allinea con l'iso-centro dello scanner.
   NOTA: Il sistema di trasporto motorizzato degli animali integrato nel sistema PET/MR garantisce un posizionamento accurato degli animali e semplifica il flusso di lavoro durante la transizione tra le modalità di imaging.
9. Ottieni la sequenza MRI.
   1. Eseguire la localizzazione iniziale e la regolazione generale.
   2. Utilizzare la fetta sagittale centrale e allineare l'8a^fetta dalla parte anteriore con la decussazione della commessura anteriore.
      NOTA: Le fette coronali sono posizionate perpendicolarmente al piano orizzontale definito dalla linea che collega la commessura anteriore e la base del cervelletto, corrispondente a un angolo di circa 15° rispetto all'asse lungo del corpo calloso. I parametri chiave della scansione T2-RARE per la fetta sagittale media sono i seguenti: tempo di ripetizione (TR) = 2500 ms, tempo di eco (TE) = 44 ms, campo visivo (FOV) = 3,5 cm, dimensione della matrice = 256 256, spessore della fetta = 1 mm, numero di fette = 1, fattore RARE = 8, larghezza di banda = 75 kHz, numero di medie = 1, tempo di acquisizione = 1 min 20 s.
   3. Utilizzare l'acquisizione rapida con il miglioramento del rilassamento (RARE) con soppressione del grasso e una banda di saturazione sotto il cervello per ottenere immagini pesate in T2 per riferimento anatomico (Figura 2).
      NOTA: I parametri chiave della scansione T2-RARE sono i seguenti: tempo di ripetizione (TR) = 3600 ms, tempo di eco (TE) = 40 ms, campo visivo (FOV) = 2 cm, dimensione della matrice = 256 256, spessore della fetta = 1 mm, numero di fette = 16, fattore RARE = 8, larghezza di banda = 75 kHz, numero di medie = 8, tempo di acquisizione = 7 min 40 s.
   4. Utilizzare un EPI spin-echo a 4 scatti per acquisire immagini del tensore di diffusione (Figura 2).
      NOTA: I parametri chiave della scansione DTI sono i seguenti: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, campo visivo (FOV) = 2 cm, dimensione della matrice = 96 96, spessore = 1 mm, numero di fette = 16, durata dell'impulso (δ) = 5 ms, tempo tra i due impulsi (Δ) = 15 ms, numero di B0 = 5, numero di direzioni = 30, valore b = 1000 s/mm³, larghezza di banda = 150 kHz, numero di media = 4, tempo di acquisizione = 14 min.
   5. Completare il protocollo di scansione. Far scorrere la culla per animali fuori dal magnete. Rimuovere l'animale dalla culla.
   6. Trasferisci il ratto in una gabbia pulita con un termoforo sotto per mantenere la sua temperatura corporea. Rimetti il topo nella sua gabbia di casa una volta che riprende conoscenza.
10. Pre-elaborazione delle immagini
    NOTA: Utilizzare MRtrix3, il software SPM (Statistical Parametric Mapping) e gli script MATLAB personalizzati per l'elaborazione e l'analisi dei dati.
    1. Elimina il rumore dalle immagini DTI utilizzando il comando MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. Rimuovere gli artefatti di squillo di Gibb dalle immagini DTI utilizzando il comando MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. Coregistra le immagini DTI con immagini pesate in T2 del singolo soggetto attraverso scansioni longitudinali utilizzando le funzioni SPM (spm_coreg.m e spm_powell.m).
    4. Esegui lo stripping del cranio su immagini pesate in T2 contornando manualmente l'area del cervello fetta per fetta, quindi rimuovendo i pixel con intensità inferiore alla soglia calcolata determinata dal metodo³¹ di Otsu (script MATLAB personalizzato thr_otsu2.m).
    5. Eseguire la coregistrazione cross-soggetti tra animali dello stesso gruppo sperimentale utilizzando le funzioni SPM (spm_coreg.m e spm_powell.m). Applicare la maschera cerebrale alle immagini DTI corrispondenti.
       NOTA: Lo stripping del cranio viene eseguito per ridurre il tempo di elaborazione del computer.
    6. Calcola le mappe tensoriali basate su DTI (script MATLAB personalizzato, tensormap.m).
    7. Calcolo delle mappe FA (script MATLAB personalizzato, calFA.m)
       NOTA: Tutti gli script MATLAB personalizzati sono disponibili tramite il seguente database (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
11. Analisi delle immagini-FA
    1. Disegna le regioni di interesse (ROI) nella corteccia e nel corpo calloso (CC) per le tre sezioni consecutive dell'immagine sotto la coordinata del CHI.
       NOTA: Tutte le ROI sono state disegnate manualmente e ispezionate visivamente per errori grossolani da 2 ricercatori esperti all'oscuro dei gruppi sperimentali.
    2. Estrai e calcola la media del valore FA dai ROI.
       NOTA: Per il corpo calloso sotto la corteccia, i pixel con valori di FA < 0,35 sono stati esclusi nel ROI selezionato per eliminare gli effetti di volume parziale. Per la corteccia, tutti i pixel con valori di FA < 0,35 nel ROI sono stati reclutati per l'analisi.
12. Analisi delle immagini-Volume
    1. Disegna manualmente le ROI che coprono le regioni corticali per 11 sezioni consecutive dell'immagine a Bregma da -7 a +3 mm.
       NOTA: Tutti i ROI sono stati disegnati manualmente da 2 ricercatori esperti all'oscuro dei gruppi sperimentali.
    2. Somma i pixel totali delle ROI tra le sezioni e trasformali nel volume moltiplicando lo spessore della fetta (1 mm).
    3. Normalizzare il volume corticale dopo il CHI con il volume corrispondente prima del CHI di ciascun animale.
       NOTA: Normalizzare i dati per eliminare le differenze individuali nel volume del cervello tra gli animali prima della presentazione.

3. Valutazione del comportamento

NOTA: Gli esperimenti comportamentali vengono eseguiti utilizzando il test di equilibrio del beam walk e l'mNSS prima del CHI, nonché su 1 e 50 giorni dopo il CHI (Figura 1). Tutta la valutazione è stata eseguita da almeno due osservatori per garantire l'accuratezza, la coerenza e l'obiettività dei dati raccolti.

1. Test di equilibrio della camminata della trave
   1. Accendi la videocamera e avvia il timer.
   2. Posiziona i ratti a un'estremità della trave di equilibrio (3 cm di profondità, 3 cm di larghezza, 80 cm di lunghezza e 60 cm dal pavimento).
   3. Arresta il timer una volta che il topo completa un viaggio di andata e ritorno, cade o si blocca per oltre 3 minuti.
      1. Durante l'esperimento, osservare le condizioni dell'animale per la valutazione utilizzando mNSS 11,32,33,34. Segui questi standard per la valutazione:
      2. Se il ratto mantiene l'equilibrio con una postura stabile sulla trave, assegna un punteggio di 0.
      3. Se il ratto afferra il lato della trave, assegna un punteggio di 1.
      4. Se il ratto cade con un arto fuori dalla trave, assegna un punteggio di 2.
      5. Se il ratto cade con due arti staccati o gira sulla trave (>60 s), assegna un punteggio di 3.
      6. Se il ratto tenta di stare in equilibrio sulla trave ma cade (>40 s), assegna un punteggio di 4.
      7. Se il ratto tenta di stare in equilibrio sulla trave ma cade (>20 s), assegna un punteggio di 5.
      8. Se il ratto non tenta di stare in equilibrio o di appendersi alla trave e cade entro 20 s, assegna un punteggio di 6.
      9. Se il topo non riesce a completare il compito, considera che ha impiegato il tempo massimo di 3 minuti e assegna un punteggio di 6.
   4. Pianifica i giorni di test in momenti specifici.
      NOTA: Escludere i ratti che non hanno completato il viaggio di andata e ritorno del beam walk per due prove prima del CHI dal successivo intervento chirurgico e dalla valutazione comportamentale di follow-up.
2. Punteggio di gravità neurologica modificato (mNSS)
   NOTA: la valutazione mNSS include test motori, test sensoriali, assenza di riflessi, movimenti anomali, bilanciamento del fascio e camminata sul pavimento ^32,33, che è stata eseguita rapidamente su base giornaliera.
   1. Eseguire test del motore.
      1. Sollevare il ratto dalla base della coda e osservare i riflessi dei suoi arti per circa 15 s per valutare la corretta flessione ed estensione.
      2. Se si osserva una flessione normale nell'arto anteriore, assegnare un punteggio di 0. Se non si osserva alcuna flessione, assegnare un punteggio di 1.
      3. Se si osserva una flessione normale nell'arto posteriore, assegnare un punteggio di 0. Se non si osserva alcuna flessione, assegnare un punteggio di 1.
      4. Se la testa si sposta di >10° rispetto all'asse verticale entro 30 s dopo aver sollevato il ratto per la coda, assegnare un punteggio di 0. In caso contrario, assegna un punteggio di 1.
         NOTA: In questa sessione del test verranno assegnati un massimo di 3 punteggi.
   2. Eseguire test di posizionamento degli arti.
      NOTA: Il test di posizionamento viene eseguito per valutare la coordinazione tra la funzione sensoriale (sensazione visiva, tattile e propriocezione) e motoria.
      1. Abbassa lentamente il ratto verso la superficie del tavolo. Osserva se le zampe dei ratti raggiungevano e si allungavano verso la superficie.
      2. Se i ratti hanno raggiunto la superficie con entrambi gli arti allungati e in avanti, assegna un punteggio di 0. Se c'è un ritardo o nessuna risposta, assegna un punteggio di 1.
      3. Posiziona il topo sulla superficie e tira la zampa contro il bordo del tavolo. Osserva se la sua zampa ritorna in una posizione normale sulla superficie del tavolo.
      4. Se si osservano risposte di posizionamento immediate e normali, assegnare un punteggio di 0. Se si osservano risposte di posizionamento ritardato, assegnare un punteggio di 1. Se non c'è risposta, assegna un punteggio di 2.
         NOTA: In questa sessione del test verranno assegnati un massimo di 3 punteggi.
   3. Osservare l'assenza e i movimenti anomali.
      1. Osservare gli scuotimenti della testa per valutare il riflesso del padiglione auricolare quando si tocca il meato uditivo con l'estremità di cotone di un batuffolo di cotone.
      2. Se si osserva un riflesso normale, assegnare un punteggio di 0. Se non si osserva alcun riflesso, assegnare un punteggio di 1.
      3. Valutare la presenza del riflesso corneale toccando la cornea con l'estremità di cotone di un batuffolo di cotone.
      4. Se viene suscitata una risposta normale, assegna un punteggio di 0. Se non viene suscitata alcuna risposta al battito delle palpebre, assegna un punteggio di 1.
      5. Fai un battito di mani breve e forte. Osservare la presenza del riflesso di trasalimento.
      6. Se si osserva un riflesso, assegnare un punteggio di 0. Se non si osserva alcun riflesso, assegnare un punteggio di 1.
      7. Osserva se il ratto ha convulsioni, mioclono o miodistonia.
      8. Se si verifica uno di essi, assegna un punteggio di 1.
         NOTA: In questa sessione del test verranno assegnati un massimo di 4 punteggi.
   4. Eseguire il test di bilanciamento del raggio, come descritto in precedenza (passaggio 3.1).
      NOTA: In questa sessione del test verranno assegnati un massimo di 6 punteggi.
   5. Eseguire il test della camminata sul pavimento.
      1. Prepara l'arena in campo aperto (75 cm di lunghezza, 50 cm di larghezza e 40 cm di profondità). Assicurati che sia pulito e privo di precedenti segnali di odore.
      2. Posiziona un topo al centro dell'arena del campo aperto e osserva come il topo cammina nell'arena.
      3. Se il ratto esegue una camminata regolare, assegna un punteggio di 0.
      4. Se il ratto non può camminare dritto, assegna un punteggio di 1.
      5. Se il ratto cade sul lato paretico dopo averlo posizionato sul pavimento, assegna un punteggio di 3.
         NOTA: In questa sessione del test verranno assegnati un massimo di 3 punteggi.
   6. Somma tutti i punteggi; Il punteggio massimo possibile è 18.
      NOTA: Il punteggio più alto indica un risultato peggiore.

4. Immunoistologia

1. Eseguire la perfusione transcardiaca³⁵.
   NOTA: La perfusione transcardiaca viene eseguita dopo la risonanza magnetica 50 giorni dopo il CHI (Figura 1).
   1. Metti il ratto in una piccola camera di induzione e anestetizzalo con isoflurano (5%) fino a quando non risponde a un pizzico della zampa o della coda.
   2. Somministrare 50 mg/kg di peso corporeo di zoletil (50 mg/mL) e 10 mg/kg di peso corporeo di xilazina (Roumpun, 23,32 mg/mL) tramite iniezione intraperitoneale per l'anestesia profonda.
   3. Metti il topo in posizione supina.
   4. Praticare un'incisione trasversale di circa 4-5 cm di lunghezza sotto il torace utilizzando le forbici.
   5. Individua il diaframma e taglialo per esporre il cuore.
   6. Utilizzare una pinza emostatica per bloccare l'arteria polmonare e quindi praticare un'incisione di circa 0,5-1 cm di lunghezza nell'atrio destro.
   7. Collegare l'ago alla tubazione collegata alla pompa di infusione.
   8. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro.
   9. Sciacquare l'animale attraverso la perfusione transcardiaca (40 ml/min) con 500 ml di soluzione fisiologica allo 0,9% fino a quando il sangue non è pulito.
   10. Perfondere l'animale attraverso la perfusione transcardiaca (40 mL/min) con 500 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per la fissazione.
   11. Rimuovi la testa del ratto e stacca con cura il tessuto cerebrale dal cranio.
   12. Conservare il cervello in circa 20 ml di PFA al 4% nel flacone per 48 ore per la post-fissazione.
2. Eseguire il processamento dei tessuti e la colorazione IHC^36,37.
   NOTA: Eseguire la colorazione immunoistochimica su sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina utilizzando il kit del sistema di rilevamento secondario dell'immunoperossidasi.
   1. Utilizzare sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina.
   2. Eseguire la deparaffinazione e trattare i vetrini con il 3% di H₂O₂ per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Eseguire il prelievo dell'antigene utilizzando un tampone citrato a 90 °C.
   3. Eseguire la colorazione immunoistochimica utilizzando il kit del sistema di rilevamento secondario dell'immunoperossidasi.
      NOTA: Le procedure di colorazione vengono eseguite seguendo le raccomandazioni del produttore.
   4. Utilizzare l'ematossilina per controcolorare i campioni.
   5. Montare i campioni con un reagente antifading.
   6. Utilizzare anticorpi anti-proteina acida fibrillare gliale (GFAP) per la colorazione immunoistochimica.
   7. Acquisire le immagini delle ROI utilizzando uno scanner per vetrini al microscopio ottico (Figura 6).

5. Analisi statistica del comportamento e dei risultati dell'immagine

NOTA: Nel presente studio, l'analisi statistica è stata eseguita in SPSS; Tuttavia, l'analisi statistica può essere eseguita in altri strumenti statistici.

1. Caricare i dati nel formato wide in un file SPSS *.sav.
2. Condurre l'analisi della varianza a misure ripetute (ANOVA) per confrontare i risultati comportamentali (peso normalizzato, mNSS e durata della camminata del raggio) e di immagine (valori FA nella corteccia e CC) nel tempo tra i gruppi.
   1. Fate clic su Analizza (Analyze > General Linear Model> Repeated Measures).
   2. Assegna un nome nella casella Nome fattore all'interno del soggetto (ad esempio, tempo) e inserisci '3' nella casella Numero di livelli (tre livelli con diversi punti temporali di follow-up). Assegnare un nome nella casella Nome misura (ad esempio, mNSS) nella finestra di dialogo Misure ripetute Definisci fattore/i .
   3. Caricare le variabili all'interno del soggetto (dati acquisiti a pre-, D1 e D50 post-CHI) che devono essere testate e specificare il fattore tra i soggetti (ad esempio, gruppi di animali con diversi parametri di impatto) nella finestra di dialogo Misure ripetute .
   4. Selezionare Bonferroni come test post hoc per i fattori (ad esempio, gruppi di animali) nella finestra di dialogo confronti multipli post hoc per le medie osservate .
      NOTA: Per correggere i confronti multipli, l'errore di tipo I è stato regolato utilizzando le correzioni di Bonferroni (0,05/3) per i confronti nel tempo. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05 (SPSS aggiustato).
3. Condurre un'analisi ANOVA a una via per confrontare il riflesso di raddrizzamento e la variazione del volume corticale tra i gruppi.
   1. Fare clic su Analizza > Confronta mezzi > ANOVA unidirezionale.
   2. Caricare le variabili (riflesso di raddrizzamento e variazione del volume corticale) nell'elenco dipendente e i gruppi come fattore nella finestra di dialogo ANOVA unidirezionale .
   3. Selezionare Bonferroni come test post hoc nella finestra di dialogo ANOVA unidirezionale: Confronti multipli post hoc .
      NOTA: Per correggere i confronti multipli, l'errore di tipo I è stato corretto utilizzando le correzioni di Bonferroni (0,05/5) per i confronti tra i gruppi. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05 (SPSS aggiustato).

La Figura 2 mostra le risonanze magnetiche longitudinali di animali rappresentativi con CHI fittizio e ripetitivo all'SMCx. Non sono state riscontrate fratture craniche significative o contusioni cerebrali nelle immagini pesate in T2 a 1 e 50 giorni dopo l'CHI. Non è stato riscontrato alcun edema o deformazione significativa di WM nelle mappe FA a 1 e 50 giorni dopo il CHI. Tutti gli animali sottoposti a CHI in questo studio sono sopravvissuti all'intera du...

Questo studio mirava a stabilire un modello animale di lesione cerebrale traumatica lieve non complicata (mTBI) per valutare gli effetti cumulativi di lesioni singole e ripetitive, nonché i risultati degli impatti su diverse regioni cerebrali. Il modello di lesione cranica chiusa (CHI), adattato dal paradigma di lesione da caduta di peso a testa chiusa, è stato progettato per imitare le commozioni cerebrali comunemente sperimentate da atleti e individui con protezione del casco. Questo...

Gli autori non hanno potenziali conflitti di interesse da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca del National Science and Technology Council (NSTC) di Taiwan (NSTC 113-2314-B-A49-047).