Minha pesquisa se concentra na tosse crônica. Para entender a fisiopatologia da tosse, meus estudos exigiram amostras de teste para verificar as mudanças nos níveis dos fatores-chave. Meu objetivo é estabelecer procedimentos padronizados para a coleta de amostras de tecido de camundongos.
A hipersensibilidade à tosse é frequentemente desencadeada por uma infecção viral. Pela primeira vez, descobrimos que a infecção viral pode desencadear hipersensibilidade à tosse enquanto aumenta a liberação de interferon-gama dos linfócitos T no pulmão. A maioria dos pacientes com tosse crônica apresenta hipersensibilidade à tosse, caracterizada pelo aumento da responsividade neural a uma variedade de estímulos que afetam as vias aéreas e os pulmões.
No futuro, vamos nos concentrar nos processos periféricos e centrais que contribuem para a hipersensibilidade à tosse. Para começar, pegue o camundongo infectado com H1N1 profundamente anestesiado após a detecção da tosse e colete sangue das órbitas oculares. Agite o tubo de coleta de sangue para misturar totalmente o sangue e o anticoagulante para evitar a coagulação do sangue.
Em seguida, centrifugue o sangue coletado a 800 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante e guarde-o. Ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de D-Hank.
Espalhe 10 microlitros da suspensão de células sanguíneas em uma lâmina de vidro para determinar os perfis celulares. Para colher o baço, abra o peito do camundongo, remova a aurícula esquerda e, em seguida, perfunda a circulação pulmonar e sistêmica com cinco mililitros de solução salina normal. Usando uma pinça cirúrgica, remova todo o baço do mouse.
Agora, meça o peso do baço. Corte o baço em duas metades. Fixe a primeira metade com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente para análise histopatológica.
Armazene a segunda metade a menos 80 graus Celsius para medição de citocinas. Para a coleta de fluido de lavagem broncoalveolar, separe o pulmão direito ligando o brônquio da haste principal direita. Colete o fluido de lavagem broncoalveolar dos pulmões esquerdos lavando-o três vezes com 0,5 mililitros de PBS.
A centrífuga coletou o lavado broncoalveolar a 800 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, colete o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBS.
Usando uma lâmina de contagem, conte os leucócitos no fluido de lavagem broncoalveolar. Para determinar os perfis celulares por contagens diferenciais, espalhe 50 microlitros da suspensão celular em lâminas de vidro e deixe secar. Fixe a lâmina com 4% de paraformaldeído durante a noite antes de corar com hematoxilina eosina.
Após a coleta do lavado broncoalveolar, remova e fixe metade do pulmão direito e traqueia com paraformaldeído a 4% para análise histopatológica. Armazene a outra metade a menos 80 graus Celsius para western blotting, RT-qPCR e ensaio de imunoabsorção enzimática. A infecção pelo vírus H1N1 resultou em alterações inflamatórias nos pulmões de camundongos, incluindo edema e muitos linfócitos e infiltração de neutrófilos.
A infecção pelo vírus H1N1 induziu alterações inflamatórias nas traqueias de camundongos, incluindo derramamento de cílios e infiltrações de células inflamatórias. A infecção pelo vírus H1N1 aumentou significativamente a proporção da área da polpa branca em relação a toda a área do baço em camundongos, com linfócitos se acumulando na polpa branca do baço.
