检测小鼠咳嗽和气道炎症的方法

我的研究重点是慢性咳嗽。为了了解咳嗽的病理生理学，我的研究需要测试样本来验证关键因子水平的变化。我的目标是建立从小鼠中收集组织样本的标准化程序。

咳嗽超敏反应通常是由病毒感染引发的。我们首次发现病毒感染可能会引发咳嗽超敏反应，同时增加肺部 T 淋巴细胞中干扰素-γ 的释放。大多数慢性咳嗽患者患有咳嗽超敏反应，其特征是对影响气道和肺部的一系列刺激的神经反应性增加。

未来，我们将专注于导致咳嗽超敏反应的外周和中枢过程。首先，在咳嗽检测到后取深度麻醉的 H1N1 感染小鼠，并从眼眶收集血液。摇动采血管，使血液和抗凝剂充分混合，以防止血液凝固。

然后，将收集的血液在 4 摄氏度下以 800 G 离心 5 分钟。收集上清液并储存。将沉淀重悬于 1 mL D-Hank 溶液中。

将 10 μL 血细胞悬液涂在载玻片上以确定细胞谱。要收获脾脏，请打开小鼠的胸部，切除左耳廓，然后用 5 毫升生理盐水灌注肺和体循环。使用手术钳，从小鼠身上去除整个脾脏。

现在，测量脾脏的重量。将脾脏切成两半。在室温下用 4% 多聚甲醛固定前半部分用于组织病理学分析。

将后半部分储存在零下 80 摄氏度用于细胞因子测量。对于支气管肺泡灌洗液收集，通过结扎右主支气管来分离右肺。用 0.5 毫升 PBS 灌洗 3 次，从左肺收集支气管肺泡灌洗液。

将收集的支气管肺泡灌洗液以 800 G 离心，在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后，收集上清液。将沉淀重悬于 200 微升 PBS 中。

使用计数玻片，计数支气管肺泡灌洗液中的白细胞。要通过差异计数确定细胞图谱，请将 50 μL 细胞悬液涂抹在载玻片上并使其干燥。用 4% 多聚甲醛固定载玻片过夜，然后用苏木精伊红染色。

支气管肺泡灌洗液采集后，取出并用 4% 多聚甲醛固定右肺和气管的一半，用于组织病理学分析。将另一半储存在零下 80 摄氏度，用于蛋白质印迹、RT-qPCR 和酶联免疫吸附测定。H1N1 病毒感染导致小鼠肺部炎症改变，包括水肿和许多淋巴细胞和中性粒细胞浸润。

H1N1 病毒感染诱导小鼠气管炎症变化，包括纤毛脱落和炎性细胞浸润。H1N1 病毒感染显著增加了小鼠白髓面积与整个脾脏面积的比值，淋巴细胞在脾脏白髓中积累。