Esse protocolo é significativo porque permite o estudo da função das células-tronco em diferentes músculos esqueléticos, aprofundando nossa compreensão de como elas contribuem para a homeostase, regeneração e progressão da doença. Usando esse protocolo, podemos isolar duas populações de células-tronco vivas de músculos específicos e estudar como elas funcionam. Para iniciar o isolamento muscular, borrife o camundongo eutanasiado com etanol e coloque-o com o abdômen voltado para cima.
Usando tesoura, faça uma incisão horizontal de 0,5 centímetro de comprimento na pele abdominal. Usando ambas as mãos, puxe a pele para expor o tronco, bem como as extremidades inferiores até os membros posteriores. Localize o grácil ou o músculo interno da coxa e, usando um par de pinças curvas, agarre-o e levante levemente o músculo.
Usando tesoura, faça uma incisão de 0,5 centímetro para cortar o músculo grácil. Repita o procedimento na outra perna. Com bisturi, corte a fáscia fazendo uma incisão de 0,5 centímetro ao longo da face lateral da tíbia.
Em seguida, agarre a fáscia com pinça curva e retire-a puxando-a, expondo os tendões na extremidade distal do membro posterior. Em seguida, insira uma pinça reta com pontas super finas entre o tendão distal do TA e o músculo EDL. Separe os músculos deslizando a pinça em direção à extremidade proximal dos músculos.
Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal. Segure suavemente o tendão distal do TA com pinça curva e levante o músculo para cima e sobre sua fixação proximal. Para cortar cuidadosamente o tendão proximal, corte a outra extremidade o mais próximo possível de sua fixação e transfira o TA para uma placa de Petri.
Em seguida, use a pinça reta com pontas super finas para passar por baixo do tendão distal do EDL e deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar os músculos uns dos outros. Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal sem danificar o músculo. Agarrando suavemente o tendão distal do EDL com pinça curva, levante o músculo para cima e sobre sua fixação proximal para cortar cuidadosamente o tendão proximal o mais próximo possível de sua fixação.
Corte a outra extremidade e transfira o músculo EDL para uma placa de Petri. Repita o procedimento para o outro membro posterior. Use pinças retas com pontas super finas para alcançar entre o tendão de Aquiles e os ossos dos membros posteriores inferiores.
Deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar o músculo dos ossos. Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal. Puxe o músculo gastrocnêmio ou GA para cima e sobre a fíbula.
Localizar o tendão sóleo proximal. Insira a pinça reta entre os músculos sóleo e GA e mova a pinça em direção à extremidade distal dos músculos para separar o sóleo do GA. Agora corte o tendão do sóleo proximal. Segure-o com pinça curva e levante cuidadosamente o sous para acessar seu tendão distal.
Cortar o tendão distal para isolar o sóleo do AG e colocá-lo na placa de Petri contendo o meio de lavagem. Em seguida, corte o GA e coloque-o na placa de Petri. Para isolar o músculo tríceps, use pinças retas com pontas super finas para alcançar entre o tríceps e o osso úmero e deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar o músculo do osso.
Em seguida, corte a extremidade distal do músculo tríceps e, com pinça curva, puxe-o para cima e sobre o cotovelo para acessar o tendão proximal. Corte o tendão proximal do tríceps e transfira o músculo para uma placa de Petri. Repita o procedimento para os outros quatro membros.
Para remover o pelo e a pele da mandíbula, use uma tesoura para fazer uma incisão de 0,5 centímetro abaixo do olho, cortando no sentido caudal. Em seguida, usando os polegares e os dedos indicadores de ambas as mãos, aperte em cada lado da incisão e remova a pele puxando-a para cima e para baixo. Localize o tendão maior do masseter no lado caudal abaixo do olho e insira a lâmina plana de bisturi entre o osso e o músculo para cortar o tendão.
Pegue o tendão masseter maior com pinça curva e corte-o com uma lâmina de bisturi ou tesoura na direção rostral para separar o músculo masseter do osso maxilar. Coloque o músculo masseter isolado na placa de Petri e repita o procedimento para o segundo músculo masseter. Use uma tesoura para fazer uma toracotomia no meio do esterno e cortar o esterno.
Expor o diafragma cortando 360 graus através da caixa torácica. Em seguida, para separar a parte superior do corpo do abdômen, use uma tesoura para cortar a traqueia, esôfago, veia cava e aorta abdominal. Em seguida, usando tesoura, pré-forme uma laparotomia um centímetro abaixo do esterno e faça um corte em torno de 360 graus.
Coloque a tesoura fechada entre a caixa torácica e os órgãos abdominais e pressione para baixo. Puxe suavemente a caixa torácica para separá-la dos órgãos abdominais. Para separar o diafragma da caixa torácica, segure o diafragma entre dois dedos e corte a caixa torácica com uma tesoura.
Corte o diafragma o mais próximo possível das costelas em torno de 360 graus e coloque o diafragma isolado em uma placa de Petri. Pique os músculos isolados, um a um, cortando-os em pedaços de aproximadamente um milímetro. Transfira os músculos picados para um tubo cônico de 15 litros contendo cinco litros de tampão de dissociação e incube o tubo a 37 graus Celsius por 35 minutos em banho de água agitada a uma velocidade de 60 rotações por minuto.
Após a digestão enzimática dos músculos picados, transfira a suspensão do tubo de 15 mililitros para um tubo de 50 mililitros. Usando uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 20, ressuspenda a amostra puxando-a para cima e para baixo através da agulha cinco vezes. Desenhe a suspensão celular para dentro da seringa e coe a amostra em um novo tubo cônico de 50 mililitros equipado com um filtro de células na parte superior.
Para recuperar todas as células mononucleadas, lave o tubo cônico vazio com 20 mililitros de meio de lavagem e despeje-o através do filtro para combinar com a amostra coada. Recupere o volume restante sob o filtro de células com uma pipeta P1000. Após a dissociação tecidual e a coloração de anticorpos, as células-tronco musculares esqueléticas ou MuSCs e progenitores fibroadipogênicos ou FAPs de músculos individuais foram purificados por classificação de células ativadas por fluorescência.
Após o fechamento inicial para identificar as células e separar os singlets dos duplos, portões subsequentes foram ajustados usando controles FMO para identificar os limiares de coloração. A amostra corada foi fechada e a população CD31 negativa e CD45 negativa positiva para SCA1 correspondente às FAPs foi classificada em um tubo de coleta separado. A população dupla negativa foi ainda fechada para classificar a população positiva para VCA correspondente aos MuSCs.
As suspensões unicelulares do diafragma e do músculo tríceps, ao contrário das demais, apresentaram maior abundância relativa de MuSCs do que as FAPs. A coloração de EDU, embora robusta, indicou uma diferença nas frações de células positivas para EDU para os dois tipos de células-tronco e entre os diferentes músculos. Para todos os tecidos, no entanto, a fração média de MuSCs EDU positivas foi maior do que a de FAPs EDU positivos.
MuSCs isolados de EDL e GA apresentaram incorporação de EDU significativamente menor em comparação com aqueles de AT, diafragma, grácil ou tríceps. Da mesma forma, variação significativa na incorporação de EDU também foi observada em FAPs isolados de diferentes músculos. Finalmente, a pureza celular foi confirmada com a coloração por imunofluorescência, indicando a especificidade do protocolo de isolamento de células-tronco.
A etapa mais crítica é a digestão mecânica do tecido. Quando o tecido é cortado demais, a viabilidade diminui. Quando o tecido é cortado muito pouco, o EEL diminui.
O protocolo pode ser combinado com ensaios que medem o comportamento celular, como enxertia após transplante para entender melhor as funções das células-tronco in vivo. Esta técnica pode responder se as diferenças no comportamento das células-tronco dentro dos músculos individuais podem contribuir para fenótipos de doenças e doenças caracterizadas por padrões únicos de músculos afetados.
