هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن من دراسة وظيفة الخلايا الجذعية عبر عضلات الهيكل العظمي المختلفة ، مما يعمق فهمنا لكيفية مساهمتها في التوازن والتجديد وتطور المرض. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا عزل مجموعتين من الخلايا الجذعية الحية من عضلات معينة ودراسة كيفية عملها. لبدء عزل العضلات ، قم برش الفأر الرحيم بالإيثانول وضعه مع توجيه البطن لأعلى.
باستخدام المقص ، قم بعمل شق أفقي بطول 0.5 سم في جلد البطن. باستخدام كلتا اليدين ، اسحب الجلد لكشف الجذع وكذلك الأطراف السفلية حتى الأطراف الخلفية. حدد موقع gracilis أو عضلة الفخذ الداخلية وباستخدام زوج من الملقط المنحني أمسك بها وارفع العضلات قليلا.
باستخدام المقص ، قم بعمل شق 0.5 سم لقطع عضلة جراسيليس. كرر الإجراء على الساق الأخرى. باستخدام مشرط ، اقطع اللفافة عن طريق إجراء شق 0.5 سم على طول الجانب الجانبي من الظنبوب.
ثم أمسك اللفافة باستخدام ملقط منحني وقم بإزالتها عن طريق السحب ، وفضح الأوتار في الطرف البعيد للطرف الخلفي. بعد ذلك ، أدخل زوجا من الملقط المستقيم بأطراف فائقة الدقة بين الوتر البعيد لعضلة TA وعضلة EDL. افصل العضلات عن طريق تحريك الملقط نحو الطرف القريب من العضلات.
أعد الملقط إلى النهاية البعيدة واقطع الوتر البعيد. أمسك بلطف الوتر البعيد من TA بالملقط المنحني وارفع العضلات لأعلى وفوق ارتباطها القريب. لقطع الوتر القريب بعناية ، قم بقص الطرف الآخر في أقرب مكان ممكن لتعلقه ونقل TA إلى طبق بتري.
ثم استخدم الملقط المستقيم مع أطراف فائقة الدقة للذهاب تحت الوتر البعيد ل EDL وحرك الملقط نحو الطرف القريب من العضلات لفصل العضلات عن بعضها البعض. أعد الملقط إلى النهاية البعيدة واقطع الوتر البعيد دون الإضرار بالعضلات. من خلال إمساك الوتر البعيد ل EDL برفق باستخدام ملقط منحني ، ارفع العضلة لأعلى وفوق ارتباطها القريب لقطع الوتر القريب بعناية بالقرب من ارتباطه قدر الإمكان.
قطع الطرف الآخر ونقل عضلة EDL إلى طبق بتري. كرر الإجراء للطرف الخلفي الآخر. استخدم ملقط مستقيم مع أطراف فائقة الدقة للوصول بين وتر العرقوب وعظام الأطراف الخلفية السفلية.
حرك الملقط نحو الطرف القريب من العضلة لفصل العضلات عن العظام. أعد الملقط إلى النهاية البعيدة واقطع الوتر البعيد. اسحب عضلة الساق أو عضلة GA لأعلى وفوق الشظية.
لتحديد موقع الوتر النعل القريب. أدخل الملقط المستقيم بين العضلات النعلية وعضلات GA وحرك الملقط نحو الطرف البعيد للعضلات لفصل النعل عن GA. الآن قطع الوتر الوحيد القريب. امسكه بالملقط المنحني وارفع السوس بعناية للوصول إلى الوتر البعيد.
اقطع الوتر البعيد لعزل النعل عن GA وضع النعل في طبق بتري الذي يحتوي على وسط الغسيل. ثم قطع GA ووضعه في طبق بتري. لعزل عضلة ثلاثية الرؤوس ، استخدم ملقط مستقيما يحتوي على أطراف دقيقة للغاية للوصول بين العضلة ثلاثية الرؤوس وعظم العضد وحرك الملقط نحو الطرف القريب من العضلة لفصل العضلات عن العظم.
بعد ذلك ، قم بقص الطرف البعيد للعضلة ثلاثية الرؤوس وباستخدام ملقط منحني اسحبه لأعلى وفوق الكوع للوصول إلى الوتر القريب. قطع الوتر القريب من ثلاثية الرؤوس ونقل العضلات إلى طبق بتري. كرر الإجراء للأطراف الأربعة الأخرى.
لإزالة الفراء والجلد من الفك ، استخدم المقص لعمل شق 0.5 سم تحت العين ، مع قطع الاتجاه الذيلي. ثم باستخدام الإبهام والسبابة بكلتا اليدين ، اضغط على كل جانب من الشق وقم بإزالة الجلد عن طريق سحبه لأعلى ولأسفل. حدد موقع الوتر الرئيسي للعضل في الجانب الذيلي أسفل العين وأدخل شفرة المشرط المسطحة بين العظم والعضلة لقطع الوتر.
أمسك وتر الماضغ الرئيسي بالملقط المنحني واقطعه بشفرة مشرط أو مقص في اتجاه المنضدة لفصل عضلة العضلة الماضغة عن عظم الفك. ضع عضلة الماضغة المعزولة في طبق بتري وكرر الإجراء الخاص بعضلة العضل الثانية. استخدم المقص لعمل بضع الصدر في منتصف القص وقطع القص.
فضح الحجاب الحاجز عن طريق قطع 360 درجة من خلال القفص الصدري. ثم لفصل الجزء العلوي من الجسم عن البطن ، استخدم المقص لقطع القصبة الهوائية والمريء والوريد الأجوف والشريان الأورطي البطني. بعد ذلك ، باستخدام المقص ، قم بتشكيل بضع البطن سنتيمترا واحدا تحت القص وقم بعمل قطع حوالي 360 درجة.
ضع المقص المغلق بين القفص الصدري وأعضاء البطن واضغط لأسفل. اسحب القفص الصدري برفق لفصله عن أعضاء البطن. لفصل الحجاب الحاجز عن القفص الصدري ، أمسك الحجاب الحاجز بشكل فضفاض بين إصبعين وقطع القفص الصدري بالمقص.
اقطع الحجاب الحاجز بالقرب من الضلوع قدر الإمكان حوالي 360 درجة وضع الحجاب الحاجز المعزول في طبق بتري. فرم العضلات المعزولة واحدة تلو الأخرى عن طريق تقطيعها إلى قطع من ملليمتر واحد تقريبا. انقل العضلات المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 لترا يحتوي على خمسة لترات من محلول التفكك ، واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة في حمام مائي مهتز بسرعة 60 دورة في الدقيقة.
بعد الهضم الأنزيمي للعضلات المفرومة ، انقل التعليق من أنبوب 15 ملليلتر إلى أنبوب 50 ملليلتر. باستخدام حقنة سعة 10 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 20 ، أعد تعليق العينة عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل عبر الإبرة خمس مرات. اسحب معلق الخلية في المحقنة وقم بتصفية العينة في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر مزود بمصفاة خلوية في الأعلى.
لاسترداد جميع الخلايا أحادية النواة ، اغسل الأنبوب المخروطي الفارغ ب 20 ملليلتر من وسائط الغسيل واسكبه عبر المصفاة لتتحد مع العينة المتوترة. استرجع وحدة التخزين المتبقية تحت مصفاة الخلية باستخدام ماصة P1000. بعد تفكك الأنسجة وتلطيخ الأجسام المضادة ، تم تنقية الخلايا الجذعية للعضلات الهيكلية أو MuSCs والأسلاف الليفية الشحمية أو FAPs من العضلات الفردية عن طريق فرز الخلايا المنشط بالتألق.
بعد البوابات الأولية لتحديد الخلايا وفصل المفردات عن الثنائيات ، تم تعيين بوابات لاحقة باستخدام عناصر تحكم FMO لتحديد عتبات التلطيخ. تم إغلاق عينة البقعة وتم فرز السكان الموجب CD31 CD31 و CD45 السلبي المقابل ل FAPs في أنبوب تجميع منفصل. تم إدخال السكان السالبين المزدوجين لفرز السكان الإيجابيين VCA المطابقين ل MuSCs.
كان لمعلقات الخلية المفردة الحجاب الحاجز وثلاثية الرؤوس ، على عكس الآخرين ، وفرة نسبية أعلى من MuSCs من FAPs. على الرغم من أن تلطيخ EDU قوي ، إلا أنه أشار إلى اختلاف في كسور الخلايا الإيجابية EDU لنوعي الخلايا الجذعية وعبر العضلات المختلفة. ومع ذلك ، بالنسبة لجميع الأنسجة ، كان متوسط جزء MuSCs الإيجابي ل EDU أعلى من متوسط FAPs الإيجابي EDU.
أظهرت MuSCs المعزولة من EDL و GA اندماجا أقل بكثير في EDU مقارنة بتلك الموجودة في TA أو الحجاب الحاجز أو gracilis أو ثلاثية الرؤوس. وبالمثل ، لوحظ أيضا تباين كبير في دمج EDU في FAPs المعزولة من العضلات المختلفة. أخيرا ، تم تأكيد نقاء الخلايا من خلال تلطيخ مناعي ، مما يشير إلى خصوصية بروتوكول عزل الخلايا الجذعية.
الخطوة الأكثر أهمية هي الهضم الميكانيكي للأنسجة. عندما يتم قطع الأنسجة أكثر من اللازم ، تنخفض الصلاحية. عندما يتم قطع الأنسجة قليلا جدا ، ينخفض ثعبان البحر.
يمكن دمج البروتوكول مع المقايسات التي تقيس سلوك الخلية ، مثل التطعيمات بعد الزرع لفهم وظائف الخلايا الجذعية بشكل أفضل في الجسم الحي. قد تجيب هذه التقنية عما إذا كانت الاختلافات في سلوك الخلايا الجذعية داخل العضلات الفردية يمكن أن تسهم في الأنماط الظاهرية للأمراض والأمراض التي تتميز بأنماط فريدة من العضلات المصابة.
