从单个骨骼肌中分离静止干细胞群

该协议意义重大，因为它能够研究不同骨骼肌的干细胞功能，加深我们对它们如何促进体内平衡、再生和疾病进展的理解。使用该协议，我们可以从特定肌肉中分离出两个活干细胞群，并研究它们是如何工作的。要开始肌肉隔离，请用乙醇喷洒安乐死的小鼠，并将其腹部朝上放置。

用剪刀在腹部皮肤上做一个0.5厘米长的水平切口。用双手拉动皮肤，使躯干以及下肢直到后肢。找到腹股或大腿内侧肌肉，然后用一对弯曲的镊子抓住它并稍微抬起肌肉。

用剪刀做一个0.5厘米的切口，切出肌细肌。在另一条腿上重复该过程。使用手术刀，沿着胫骨外侧切开 0.5 厘米的切口来切开筋膜。

然后用弯曲的镊子抓住筋膜，通过拉扯将其移除，露出后肢远端的肌腱。接下来，在 TA 的远端肌腱和 EDL 肌肉之间插入一对带有超细尖端的直钳。通过将镊子滑向肌肉的近端来分离肌肉。

将镊子带回远端并切断远端肌腱。用弯曲的镊子轻轻抓住 TA 的远端肌腱，并将肌肉向上抬起并越过其近端附件。要小心地切割近端肌腱，请在最接近其附件的地方切割另一端，然后将TA转移到培养皿中。

然后使用带有超细尖端的直镊子进入EDL的远端肌腱下方，并将镊子滑向肌肉的近端，以将肌肉彼此分开。将镊子放回远端，在不损伤肌肉的情况下切断远端肌腱。用弯曲的镊子轻轻抓住EDL的远端肌腱，将肌肉向上抬起并越过其近端附件，以小心地将近端肌腱切得尽可能靠近其附件。

切开另一端并将EDL肌肉转移到培养皿中。对另一个后肢重复该过程。使用带有超细尖端的直镊子到达跟腱和下后肢骨之间。

将镊子滑向肌肉的近端，将肌肉与骨骼分开。将镊子带回远端并切断远端肌腱。将腓肠肌或 GA 肌肉向上拉过腓骨。

定位近端比目鱼肌腱。将直镊子插入比目鱼肌和GA肌肉之间，并将镊子移向肌肉的远端，以将比目鱼卵鱼与GA分开。现在切近端比目鱼肌腱。用弯曲的镊子抓住它，小心地提起苏以进入其远端肌腱。

切开远端肌腱以将比目鱼肌与GA隔离，并将比目鱼腱放入含有洗涤介质的培养皿中。然后切开GA并将其放入培养皿中。为了隔离三头肌，请使用具有超细尖端的直镊子到达三头肌和肱骨之间，并将镊子滑向肌肉的近端，以将肌肉与骨骼分开。

接下来，切开三头肌的远端，并使用弯曲的镊子将其向上拉过肘部以进入近端肌腱。切开三头肌的近端肌腱并将肌肉转移到培养皿中。对其他四个肢体重复该过程。

要去除下颌的皮毛和皮肤，请使用剪刀在眼睛下方切开0.5厘米的切口，沿尾部方向切割。然后用双手的拇指和食指捏住切口的每一侧，并通过向上和向下拉来去除皮肤。将咬肌的主要肌腱定位在眼睛下方的尾侧，并将扁平手术刀刀片插入骨骼和肌肉之间以切断肌腱。

用弯曲的镊子抓住主要的咬肌腱，然后用手术刀刀片或剪刀沿嘴部方向切割，将咬肌与颚骨分开。将分离的咬肌放入培养皿中，并对第二块咬肌重复该过程。用剪刀在胸骨中间做开胸术，然后切开胸骨。

通过肋骨切割 360 度来暴露隔膜。然后用剪刀将上半身与腹部分开，切开气管、食道、腔静脉和腹主动脉。接下来，使用剪刀在胸骨下方一厘米处进行剖腹手术，并在 360 度左右切开。

将闭合的剪刀放在肋骨和腹部器官之间，然后向下按压。轻轻拉动胸腔，将其与腹部器官分开。要将隔膜与肋骨分开，请将隔膜松散地夹在两根手指之间，然后用剪刀切开肋骨。

将隔膜尽可能靠近肋骨切割约360度，然后将分离的隔膜放入培养皿中。将孤立的肌肉切成大约一毫米的碎片，逐个切碎。将切碎的肌肉转移到装有5升解离缓冲液的15升锥形管中，并在37摄氏度下以每分钟60转的速度在摇动水浴中孵育管35分钟。

在对切碎的肌肉进行酶消化后，将悬浮液从15毫升管转移到50毫升管中。使用装有 20 号针头的 10 毫升注射器，通过针头上下拉动样品五次来重新悬浮样品。将细胞悬液吸入注射器中，并将样品过滤到顶部装有细胞过滤器的新50毫升锥形管中。

要检索所有单核细胞，请用20毫升洗涤介质洗涤空锥形管，并将其倒入过滤器以与过滤的样品结合。用P1000移液器取出细胞过滤器下的剩余体积。在组织解离和抗体染色后，通过荧光活化细胞分选纯化来自单个肌肉的骨骼肌干细胞或MuSCs和纤维成脂祖细胞或FAP。

在初始设门以识别细胞并将单体与双峰分离后，使用FMO对照设置后续门以识别染色阈值。对染色样品进行门控，并将对应于FAP的SCA1阳性CD31阴性和CD45阴性群体分选到单独的收集管中。进一步对双阴性群体进行门控，以对对应于MuSC的VCA阳性群体进行排序。

与其他悬液不同，横膈膜和三头肌单细胞悬浮液的MuSC相对丰度高于FAP。EDU染色虽然稳健，但表明两种干细胞类型和不同肌肉的EDU阳性细胞分数存在差异。然而，对于所有组织，EDU阳性MuSCs的平均比例高于EDU阳性FAPs。

与来自 TA、横膈膜、腹股肌或三头肌的 MuSC 相比，从 EDL 和 GA 中分离的 MuSC 显示出显着较低的 EDU 掺入量。同样，在从不同肌肉分离的FAP中也观察到EDU掺入的显着差异。最后，通过免疫荧光染色确认细胞纯度，表明干细胞分离方案的特异性。

最关键的一步是组织的机械消化。当组织被切割太多时，活力下降。当组织切割得太少时，鳗鱼会下降。

该方案可以与测量细胞行为的测定相结合，例如移植后的植入，以更好地了解体内干细胞的功能。该技术可以回答单个肌肉内干细胞行为的差异是否会导致疾病表型和以受影响肌肉的独特模式为特征的疾病。