Ce protocole est important car il permet d’étudier la fonction des cellules souches dans différents muscles squelettiques, approfondissant notre compréhension de la façon dont elles contribuent à l’homéostasie, à la régénération et à la progression de la maladie. En utilisant ce protocole, nous pouvons isoler deux populations de cellules souches vivantes de muscles spécifiques et étudier leur fonctionnement. Pour commencer l’isolement musculaire, vaporisez de l’éthanol sur la souris euthanasiée et placez-la avec l’abdomen tourné vers le haut.
À l’aide de ciseaux, faites une incision horizontale de 0,5 centimètre de long dans la peau abdominale. À l’aide des deux mains, tirez la peau pour exposer le torse ainsi que les membres inférieurs jusqu’aux membres postérieurs. Localisez le gracilis ou le muscle interne de la cuisse et, à l’aide d’une paire de forceps incurvés, saisissez-le et soulevez légèrement le muscle.
À l’aide de ciseaux, faites une incision de 0,5 centimètre pour découper le muscle gracilis. Répétez la procédure sur l’autre jambe. À l’aide d’un scalpel, coupez le fascia en faisant une incision de 0,5 centimètre le long du côté latéral du tibia.
Ensuite, saisissez le fascia à l’aide d’une pince incurvée et retirez-le en tirant, exposant les tendons à l’extrémité distale du membre postérieur. Ensuite, insérez une paire de forceps droits avec des pointes super fines entre le tendon distal du TA et le muscle EDL. Séparez les muscles en faisant glisser la pince vers l’extrémité proximale des muscles.
Ramenez la pince à l’extrémité distale et coupez le tendon distal. Saisissez doucement le tendon distal de l’AT avec une pince incurvée et soulevez le muscle vers le haut et au-dessus de son attachement proximal. Pour couper soigneusement le tendon proximal, coupez l’autre extrémité au plus près possible de sa fixation et transférez le TA dans une boîte de Pétri.
Ensuite, utilisez les pinces droites avec des pointes super fines pour aller sous le tendon distal de l’EDL et faites glisser les forceps vers l’extrémité proximale du muscle pour séparer les muscles les uns des autres. Ramenez la pince à l’extrémité distale et coupez le tendon distal sans endommager le muscle. En saisissant doucement le tendon distal de l’EDL avec une pince incurvée, soulevez le muscle vers le haut et par-dessus son attachement proximal pour couper soigneusement le tendon proximal le plus près possible de son attache.
Coupez l’autre extrémité et transférez le muscle EDL dans une boîte de Pétri. Répétez la procédure pour l’autre membre postérieur. Utilisez une pince droite avec des pointes super fines pour atteindre entre le tendon d’Achille et les os du membre postérieur inférieur.
Faites glisser la pince vers l’extrémité proximale du muscle pour séparer le muscle des os. Ramenez la pince à l’extrémité distale et coupez le tendon distal. Tirez le muscle gastrocnémien ou GA vers le haut et au-dessus du péroné.
Pour localiser le tendon soléaire proximal. Insérez la pince droite entre les muscles du soléaire et de l’AG et déplacez la pince vers l’extrémité distale des muscles pour séparer le soléaire de l’AG. Maintenant, coupez le tendon soléaire proximal. Saisissez-le avec une pince incurvée et soulevez délicatement le sous pour accéder à son tendon distal.
Couper le tendon distal pour isoler le soléaire de l’AG et placer le soléaire dans la boîte de Petri contenant le produit de lavage. Ensuite, coupez le GA et placez-le dans la boîte de Pétri. Pour isoler le muscle triceps, utilisez une pince droite ayant des pointes super fines pour atteindre entre le triceps et l’os de l’humérus et faites glisser la pince vers l’extrémité proximale du muscle pour séparer le muscle de l’os.
Ensuite, coupez l’extrémité distale du muscle triceps et, à l’aide d’une pince incurvée, tirez-la vers le haut et sur le coude pour accéder au tendon proximal. Coupez le tendon proximal du triceps et transférez le muscle dans une boîte de Pétri. Répétez la procédure pour les quatre autres membres.
Pour enlever la fourrure et la peau de la mâchoire, utilisez des ciseaux pour faire une incision de 0,5 centimètre sous l’œil, en coupant dans le sens caudal. Ensuite, à l’aide des pouces et de l’index des deux mains, pincez de chaque côté de l’incision et retirez la peau en la tirant vers le haut et vers le bas. Localisez le tendon principal du masséter dans la face caudale sous l’œil et insérez la lame plate du scalpel entre l’os et le muscle pour couper le tendon.
Saisissez le tendon masséter majeur avec une pince incurvée et coupez-le avec une lame de scalpel ou des ciseaux dans le sens rostral pour séparer le muscle masséter de l’os de la mâchoire. Placez le muscle masséter isolé dans la boîte de Petri et répétez la procédure pour le deuxième muscle masséter. Utilisez des ciseaux pour faire une thoracotomie au milieu du sternum et couper à travers le sternum.
Exposez le diaphragme en coupant à 360 degrés à travers la cage thoracique. Ensuite, pour séparer le haut du corps de l’abdomen, utilisez des ciseaux pour couper à travers la trachée, l’œsophage, la veine cave et l’aorte abdominale. Ensuite, à l’aide de ciseaux, préformez une laparotomie un centimètre sous le sternum et faites une coupe d’environ 360 degrés.
Placez les ciseaux fermés entre la cage thoracique et les organes abdominaux et appuyez vers le bas. Tirez doucement sur la cage thoracique pour la séparer des organes abdominaux. Pour séparer le diaphragme de la cage thoracique, tenez le diaphragme entre deux doigts et coupez à travers la cage thoracique avec des ciseaux.
Couper le diaphragme le plus près possible des côtes autour de 360 degrés et placer le diaphragme isolé dans une boîte de Pétri. Hachez les muscles isolés un par un en les coupant en morceaux d’environ un millimètre. Transférer les muscles hachés dans un tube conique de 15 litres contenant cinq litres de tampon de dissociation et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 35 minutes dans un bain-marie secouant à une vitesse de 60 rotations par minute.
Après digestion enzymatique des muscles émincés, transférer la suspension du tube de 15 millilitres dans un tube de 50 millilitres. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 20, remettre l’échantillon en suspension en le tirant cinq fois de haut en bas à travers l’aiguille. Aspirez la suspension cellulaire dans la seringue et filtrez l’échantillon dans un nouveau tube conique de 50 millilitres muni d’une passoire à cellules sur le dessus.
Pour récupérer toutes les cellules mononucléées, lavez le tube conique vide avec 20 millilitres de produit de lavage et versez-le à travers la passoire pour le combiner avec l’échantillon filtré. Récupérez le volume restant sous la crépine à cellules à l’aide d’une pipette P1000. Après la dissociation tissulaire et la coloration des anticorps, les cellules souches du muscle squelettique ou MuSC et les progéniteurs fibro-adipogéniques ou FAP des muscles individuels ont été purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence.
Après l’établissement initial de points de contrôle pour identifier les cellules et séparer les singlets des doublets, les portes subséquentes ont été établies à l’aide de contrôles FMO pour identifier les seuils de coloration. L’échantillon de coloration a été contrôlé et la population CD31 positive au SCA1 et la population CD45 négative correspondant aux PAF ont été triées dans un tube de prélèvement séparé. La population doublement négative a ensuite été fermée pour trier la population positive VCA correspondant aux MuSC.
Les suspensions unicellulaires du muscle diaphragme et triceps, contrairement aux autres, présentaient une abondance relative plus élevée de MuSC que les FAP. La coloration EDU, bien que robuste, indiquait une différence dans les fractions de cellules EDU positives pour les deux types de cellules souches et entre les différents muscles. Pour tous les tissus, cependant, la fraction moyenne des MuSC positifs à l’EDU était supérieure à celle des PAF positifs pour l’EDU.
Les MuSC isolés de l’EDL et de l’AG ont montré une incorporation d’EDU significativement plus faible par rapport à ceux de TA, diaphragme, gracilis ou triceps. De même, une variation significative de l’incorporation d’EDU a également été observée dans les FAP isolés de différents muscles. Enfin, la pureté cellulaire a été confirmée par coloration immunofluorescente, indiquant la spécificité du protocole d’isolement des cellules souches.
L’étape la plus critique est la digestion mécanique du tissu. Lorsque le tissu est trop coupé, la viabilité diminue. Lorsque le tissu est coupé trop peu, l’anguille diminue.
Le protocole peut être combiné avec des tests qui mesurent le comportement cellulaire, tels que la greffe après la transplantation pour mieux comprendre les fonctions des cellules souches in vivo. Cette technique peut répondre à la question de savoir si les différences dans le comportement des cellules souches dans les muscles individuels peuvent contribuer aux phénotypes de maladies et aux maladies caractérisées par des modèles uniques de muscles affectés.
