Este método permite que os usuários rastreiem facilmente as células T in vivo para avaliar a cinética de homing e monitorar a persistência das células T. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser repetida em vários momentos no mesmo animal sem a necessidade de sacrifício em citometria de fluxo ou imunohistoquímica. Essa técnica também pode ser modificada para rastrear outros tipos de células imunológicas.
Para cultivar células 293T, preparar um litro de DMEM adicionando 110 mililitros de soro fetal bovino inativado pelo calor e 11 mililitros de estreptomicina com penicilina. Descongelar cinco vezes 10 até a sexta célula 293T e transferi-las para um frasco T175 contendo DMEM. Divida as células de uma a 10 a cada três dias por seis dias antes que as células se tornem mais de 90% confluentes.
Para transfecção, transfira 1,5 mililitros de meio para dois tubos de 50 mililitros usando uma pipeta. Para um tubo, adicione 10 microgramas de plasmídeo VSVG, 20 microgramas de pol de mordaça e 20 microgramas de plasma de escaravelho vermelho ou CBRTDR luciferase plasmídeo e misture. Adicionar 100 microlitros de DNA in vitro transfecção reagente a outro tubo e misturar.
Incubar ambos os tubos à temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfira o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA gota a gota para o tubo contendo os plasmídeos de DNA e misture suavemente com uma pipeta. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos.
Durante a incubação, destacar as células 293T adicionando cinco a 10 mililitros de tripsina a 0,05%. Depois que as células se desprenderem, adicione 10 mililitros de meio e centrifugue a 800 G por cinco minutos. Ressuspenda as células em 1,5 mililitros de meio.
Adicionar o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA e os plasmídeos de DNA às células 293T e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, transferir a suspensão para um balão T175. Adicione 18 mililitros de mídia e incube a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro sem desprender as células e substituí-lo por 18 mililitros de meio fresco. Novamente, incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova o sobrenadante viral usando uma pipeta colocada no gelo e centrifuga a 800 G por cinco minutos para peletizar as células e detritos.
Filtre o sobrenadante viral usando um filtro de 0,22 mícron e coloque-o imediatamente no gelo. Para ativação in vitro de células T humanas, adicionar 10 mililitros de PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino ou BSA e dois EDTA milimolares a um tubo estéril de 15 mililitros. Em seguida, para lavar as contas, adicione contas em um tubo e coloque o tubo em um rack magnético.
Após dois minutos, retire o PBS do tubo. Após o preparo do DMEM, adicionar as esferas lavadas e a interleucina-2 ou IL-2 a uma concentração final de 30 unidades internacionais por mililitro. Conte as células T usando um hemocitômetro e coloração com azul de Trypan.
Após a contagem, adicione o número desejado de células T ao meio e inverta suavemente o tubo para misturar. Placa de 2,5 mililitros de meio contendo dois milhões de células T, contas e IL-2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Cultura a 37 graus Celsius em dióxido de carbono umidificado a 5%.
Examinar as células T sob uma objetiva de 20X todos os dias durante três dias para determinar quando transduzir com luciferase. Em seguida, para preparar uma placa de RetroNectina, adicione dois mililitros de 20 microgramas por mililitro de RetroNectina em PBS a um poço de uma placa de seis poços não tratada e incube por duas horas à temperatura ambiente. Aspirar a RetroNectina sem riscar o fundo da placa e adicionar três mililitros de 2% BSA em PBS por poço na placa de seis poços.
Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, para espinoculação, aspirar a BSA e lavar os poços uma vez com três mililitros de PBS. Continue ou substitua por PBS fresco e deixe a placa coberta a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, adicione dois mililitros de sobrenadante viral CBRTDR luciferase por poço e centrífuga a 1.240 G por 90 minutos a 32 graus Celsius. Para a transdução, após a contagem das células T, aspirar o sobrenadante viral e placa dois milhões de células T por poço em seis mililitros de DMEM contendo 30 unidades internacionais por mililitro de IL-2 humana. Examine as células T por dois dias.
Quando as células estiverem quase confluentes, lave-as suavemente do fundo da placa usando uma pipeta e transfira cada poço para um balão T75 separado. Adicionar nove mililitros de meio para um volume total de 15 mililitros por frasco. No dia seguinte, adicione 15 mililitros de meio e confirme o sucesso da transdução realizando citometria de fluxo.
Após anestesiar o camundongo, com agulha calibre 26, injetar retroorbitalmente 20 milhões de células T em 100 microlitros de meio. Administrar 1.000 unidades de IL-2 recombinante por via subcutânea para apoiar a sobrevivência de células T in vivo. Em seguida, administrar o anticorpo biespecífico retroorbital ou intraperitonealmente.
Para exames de imagem in vivo, administrar 100 microlitros de três miligramas de D-luciferina por injeção retroorbital com uma agulha calibre 26 em um camundongo anestesiado. Para capturar imagens, coloque o mouse na câmara apertada do imageador de tal forma que o flanco que suporta o xenoenxerto esteja voltado para cima em direção à câmera. Usando o painel de controle de aquisição, selecione luminescente, fotografia e sobreposição.
Defina o tempo de exposição para automático, o binning para médio e f-stop para um e adquira imagens. Após a primeira imagem, defina o tempo de exposição para corresponder ao calculado automaticamente para a primeira imagem para que as imagens subsequentes possam ser comparadas diretamente. Tire outro conjunto de imagens com o camundongo em decúbito dorsal para avaliar a presença de células T nos pulmões.
As células T armadas traficavam para o tumor mais rapidamente do que as células T desarmadas, deixando os pulmões dois dias mais cedo. A quantificação da infiltração de células T nos tumores ao longo do tempo foi medida por bioluminescência e expressa como bandos totais ou radiância por pixel integrada sobre o contorno tumoral. O tráfego de células T pode ser monitorado por 28 dias após a injeção das células T transduzidas pela luciferase, permitindo rastrear o homing de células T e a persistência durante todo o tratamento.
O tráfico de células T para xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama humano HER2 positivo em camundongos DKO é mostrado. O tratamento com o anticorpo biespecífico HER2 com uma CF não silenciada não teve efeito sobre o crescimento tumoral em comparação com um anticorpo biespecífico controlado. Em contraste, o tratamento com o anticorpo biespecífico HER2 contendo a mutação N297A isoladamente ou em combinação com uma mutação K322A foi capaz de interromper completamente o crescimento do tumor.
Para os grupos com as mutações silenciadoras, o sinal de luminescência das células T atingiu um pico mais alto no terceiro dia pós-injeção e persistiu em um nível mais alto em comparação com o anticorpo biespecífico controlado e o anticorpo biespecífico HER2 não silenciado. Camundongos portadores de xenoenxertos derivados de pacientes com neuroblastoma demonstraram que a depleção de macrófagos positivos para Ly6C aumentou significativamente o homing de células T para tumores, resultando em diminuição do crescimento tumoral e sobrevida prolongada. O efeito foi mais pronunciado nos xenoenxertos derivados de pacientes com osteossarcoma.
Entre os anticorpos biespecíficos direcionados ao antígeno tumoral STEAP1, o formato IGGL SCFV resultou em significativamente mais infiltração de células T no sexto dia após a primeira dose de células T, que persistiu durante o tratamento. Tais observações não foram previstas por ensaios de citotoxicidade in vitro. Depois de rastrear as células T in vivo, os usuários ainda podem realizar imunohistoquímica para determinar mais especificamente onde as células T estão localizadas dentro do tumor ou outros tecidos normais.
