Este método permite a los usuarios rastrear fácilmente las células T in vivo para evaluar la cinética del homing y monitorear la persistencia de las células T. La principal ventaja de esta técnica es que puede repetirse en múltiples puntos de tiempo en el mismo animal sin requerir sacrificio en citometría de flujo o inmunohistoquímica. Esta técnica podría modificarse para rastrear otros tipos de células inmunes también.
Para cultivar células 293T, prepare un litro de DMEM agregando 110 mililitros de suero bovino fetal inactivado por calor y 11 mililitros de estreptomicina de penicilina. Descongele cinco veces 10 a la sexta célula 293T y transfiéralas a un matraz T175 que contenga DMEM. Divida las células de una a 10 cada tres días durante seis días antes de que las células se vuelvan más del 90% confluentes.
Para la transfección, transfiera 1,5 mililitros de medios a dos tubos de 50 mililitros con una pipeta. A un tubo, agregue 10 microgramos de plásmido VSVG, 20 microgramos de gag pol y 20 microgramos de plásmido de luciferasa rojo de escarabajo clic o plásmido CBRTDR y mezcle. Agregue 100 microlitros de reactivo de transfección in vitro de ADN a otro tubo y mezcle.
Incubar ambos tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN gota a gota al tubo que contiene los plásmidos de ADN y mezcle suavemente con una pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Durante la incubación, separe las células 293T agregando de cinco a 10 mililitros de tripsina al 0,05%. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio y centrifugar a 800 G durante cinco minutos. Resuspender las células en 1,5 mililitros de medio.
Agregue los medios que contienen el reactivo de transfección in vitro de ADN y los plásmidos de ADN a las células 293T e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, transferir la suspensión a un matraz T175. Agregue 18 mililitros de medios e incube a 37 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio sin separar las células y reemplácelo con 18 mililitros de medios frescos. Nuevamente, incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, retire el sobrenadante viral con una pipeta sobre hielo y centrifugar a 800 G durante cinco minutos para granular las células y los desechos.
Filtre el sobrenadante viral con un filtro de 0,22 micras y colóquelo inmediatamente en hielo. Para la activación in vitro de células T humanas, agregue 10 mililitros de PBS que contengan 0,1% de albúmina sérica bovina o BSA y dos EDTA milimolares a un tubo estéril de 15 mililitros. Luego, para lavar las cuentas, agregue las perlas en un tubo y coloque el tubo en una rejilla magnética.
Después de dos minutos, retire el PBS del tubo. Después de preparar DMEM, agregue perlas lavadas e interleucina-2 o IL-2 a una concentración final de 30 unidades internacionales por mililitro. Cuente las células T usando un hemocitómetro y tinción azul de tripano.
Después de contar, agregue el número deseado de células T al medio e invierta suavemente el tubo para mezclar. Placa de 2,5 mililitros de medios que contienen dos millones de células T, perlas e IL-2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Cultivo a 37 grados centígrados en dióxido de carbono humidificado al 5%.
Examine las células T bajo un objetivo de 20X todos los días durante tres días para determinar cuándo transducir con luciferasa. Luego, para preparar una placa de RetroNectin, agregue dos mililitros de 20 microgramos por mililitro de RetroNectin en PBS a un pocillo de una placa de seis pocillos sin tratar e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Aspire el RetroNectin sin rayar el fondo de la placa y agregue tres mililitros de BSA al 2% en PBS por pocillo en la placa de seis pocillos.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, para la espinoculación, aspire el BSA y lave los pocillos una vez con tres mililitros de PBS. Continúe o reemplace con PBS fresco y deje el plato cubierto a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, agregue dos mililitros de sobrenadante viral de luciferasa CBRTDR por pocillo y centrifugar a 1, 240 G durante 90 minutos a 32 grados centígrados. Para la transducción, después de contar las células T, aspirar el sobrenadante viral y colocar en placa dos millones de células T por pocillo en seis mililitros de DMEM que contienen 30 unidades internacionales por mililitro de IL-2 humana. Examine las células T durante dos días.
Cuando las células estén casi confluentes, lávelas suavemente del fondo de la placa con una pipeta y transfiera cada pocillo a un matraz T75 separado. Añadir nueve mililitros de medios para un total de 15 mililitros de volumen por matraz. Al día siguiente, agregue 15 mililitros de medios y confirme la transducción exitosa realizando una citometría de flujo.
Después de anestesiar al ratón, usando una aguja de calibre 26, inyecte 20 millones de células T en 100 microlitros de medios retroorbitalmente. Administrar 1, 000 unidades de IL-2 recombinante por vía subcutánea para apoyar la supervivencia de las células T in vivo. Luego administre el anticuerpo biespecífico retroorbital o intraperitonealmente.
Para imágenes in vivo, administrar 100 microlitros de tres miligramos de D-luciferina por inyección retroorbitaria con una aguja de calibre 26 en un ratón anestesiado. Para capturar imágenes, coloque el ratón en la cámara hermética a la luz del generador de imágenes de modo que el flanco que lleva el xenoinjerto esté orientado hacia la cámara. Con el panel de control de adquisición, seleccione luminiscente, fotografía y superposición.
Establezca el tiempo de exposición en automático, el binning en medio y f-stop en uno y adquiera imágenes. Después de la primera imagen, establezca el tiempo de exposición para que coincida con el calculado automáticamente para la primera imagen para que las imágenes posteriores se puedan comparar directamente. Tome otro conjunto de imágenes con el ratón en decúbito supino para evaluar la presencia de células T en los pulmones.
Las células T armadas traficaron al tumor más rápido que las células T desarmadas, dejando los pulmones dos días antes. La cuantificación de la infiltración de células T en los tumores a lo largo del tiempo se midió mediante bioluminiscencia y se expresó como bandadas totales o resplandor por píxel integrado sobre el contorno tumoral. El tráfico de células T podría monitorizarse durante 28 días después de la inyección de las células T transducidas por luciferasa, lo que permite rastrear la localización y la persistencia de las células T durante todo el tratamiento.
Se muestra el tráfico de células T en xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama humano HER2 positivo en ratones DKO. El tratamiento con el anticuerpo biespecífico HER2 con una CF sin silenciamiento no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral en comparación con un anticuerpo biespecífico controlado. Por el contrario, el tratamiento con anticuerpos biespecíficos HER2 que contienen la mutación N297A sola o en combinación con una mutación K322A fue capaz de detener completamente el crecimiento tumoral.
Para los grupos con las mutaciones de silenciamiento, la señal de luminiscencia de las células T alcanzó un pico más alto en el tercer día después de la inyección y persistió en un nivel más alto en comparación con el anticuerpo biespecífico controlado y el anticuerpo biespecífico HER2 sin silenciar. Los ratones portadores de xenoinjertos derivados de pacientes con neuroblastoma demostraron que el agotamiento de los macrófagos positivos para Ly6C aumentó significativamente la orientación de las células T a los tumores, lo que resultó en una disminución del crecimiento tumoral y una supervivencia prolongada. El efecto fue más pronunciado en los xenoinjertos derivados de pacientes con osteosarcoma.
Entre los anticuerpos biespecíficos dirigidos al antígeno tumoral STEAP1, el formato IGGL SCFV dio lugar a una infiltración de células T significativamente mayor en el sexto día después de la primera dosis de células T que persistió durante la duración del tratamiento. Tales observaciones no fueron predichas por ensayos de citotoxicidad in vitro. Después de rastrear las células T in vivo, los usuarios aún pueden realizar inmunohistoquímica para determinar más específicamente dónde se encuentran las células T dentro del tumor u otros tejidos normales.
