Name: real-time live imaging of t-cell signaling complex formation
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

Os autores agradecem a Sophia Fried para assistência técnica. MBS agradece aos seguintes órgãos para o seu apoio à investigação: a Fundação Israel Ciência para bolsas no.1659/08, 971/08 de 1503/08 e 491/10, dos Ministérios da Saúde e Ciência de subvenções não. 3-4114 e 3-6540, o Israel Cancer Association através da propriedade do falecido Alexander Smidoda, e da Fundação Família Taubenblatt para a concessão excelência Bio-medicina.

1. A transfecção de células T <ol><li> Preparar a solução Nucleofector Amaxa ativado através da mistura de solução &quot;Anexo&quot; do kit para a solução Nucleofector. A solução activada pode ser armazenado a 4 ° C durante até três meses. </li><li> Cultivar células T de Jurkat em meio de cultura [10% de soro fetal de vitelo (FCS), uma solução de Penicilina-Estreptomicina a 1%, e 2 mM de L-glutamina em meio RPMI]. Idealmente, as células devem ser utilizados 1-2 semanas depois do descongelamento. Utilizando culturas de células em crescimento logarítmico é crucial para a alta eficiência de transfecção e da sobrevivência celular. Alternativamente, com modificações menores, este protocolo pode ser utilizado com células T primárias, tal como anteriormente descrito 8. Deve ser enfatizado que, como a duração do processo de activação de células T primárias é mais longa do que a de células T de Jurkat (~ 30 min), uma fase de microscópio montado sistema de incubação deve ser usada para manter os níveis de humidade e de temperatura em todo o CO 2, ativação do processo. </li><li> Colete 5× 10 6-fase log por transfecção de células T para um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente. </li><li> Durante a centrifugação, preparar uma placa de 6 poços. Encher um poço para cada transfecção com 5 ml de meio de cultura, e pré-incubado a 37 ° C. </li><li> Recolher os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de RPMI. </li><li> Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente. </li><li> Durante a centrifugação, a preparação da solução de transfecção. Em um poço de uma placa de 96 poços, misturar 100 ul de solução Amaxa Nucleofector activado, preparado no passo 1, com 5 ug de ADN do plasmídeo de interesse que codifica para uma proteína fluorescente marcado. Idealmente, a concentração de DNA deve ser maior do que 1 ug / ml, a fim de evitar a diluição da solução de transfecção. </li><li> Misture bem por pipetagem suave. </li><li> Após a centrifugação das células, remova cuidadosamente todo o sobrenadante enquanto não disturbing o sedimento. </li><li> Pipetar a solução de ADN / transfecção duas vezes. </li><li> Adicionar a solução de DNA / transfecção com o sedimento. </li><li> Transferir as células à Amaxa cuvete. </li><li> Insira a cuvete no dispositivo Nucleofector Amaxa. </li><li> Usar o ajuste H-10 Amaxa transfecção por electroporação (para Jurkat) e T-23 (para as células T primárias). </li><li> Remova a placa de 6 poços da incubadora. </li><li> Após electroporação, transferir cuidadosamente o sobrenadante com a suspensão de células para a placa de 6 poços utilizando uma pipeta de Pasteur. Um sedimento consistindo em fragmentos de células podem formar. Evitar transferir o sedimento. </li><li> Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C. </li><li> Transferir 2,5 ml de suspensão de células de cada poço para um poço novo. Adicionar 2,5 ml de meio de cultura quente (descrito no passo 2) a cada poço. </li><li> Após 72 h, a transferência das células para um tubo de centrífuga estéril e durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e substituí-lo wipo meio de cultura suplementado com o antibiótico de selecção de células de mamífero apropriada para o plasmídeo utilizado (aplicar uma concentração adequada para os antibióticos usados, foi aplicado a G418 e / ou higromicina em concentrações de 1,3 mg / ml e / ou 0,2 mg / ml, respectivamente). Cultura da suspensão de células num poço fresco. Alternativamente, as células podem ser transfectadas transitoriamente e fotografada 48 horas após a transfecção. Para preparar as células transfectadas transitoriamente, co-transfecção as células com os dois plasmídeos simultaneamente no passo 8, continuando normalmente a etapa 20 e, em seguida, pular diretamente para o passo 23. Note-se que neste cenário, as células devem ser usados ​​imediatamente, e, geralmente, a sua intensidade de fluorescência é heterogênea e não necessariamente de alta. </li><li> Cultivar células em meio de cultura suplementado com o antibiótico de selecção apropriado. Dividir as células e complementá-los com meio de cultura suplementado com antibiótico, se necessário. </li><li> Após 2 semanas, verificar a transfecção bem sucedida com o uso de FACS (gripeseparação de células activada por orescence) como se segue: </li><li> Recolha 10 6 células transfectadas, 10 6 células transfectadas simuladas (controlo negativo), e 10 6 células que são conhecidas por expressar estavelmente a proteína fluorescente marcado. Se as células são transfectadas com mais de uma proteína fluorescente (ver passo 27), o uso de várias linhas de células, individualmente marcados como controlos positivos. </li><li> Centrifugar as células durante 7 minutos a 400 x g à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS (PBS w / o Ca 2 + e Mg 2 +, 5% de FCS, 0,05% de azida de sódio). </li><li> Use um FACS análise para verificar a fluorescência celular. Comparar a fluorescência das células transfectadas com a dos controlos negativos e positivos. </li><li> Para transfectar as células com um adicional, marcados por fluorescência de proteína, repetir os passos 3-26 utilizando as células transfectadas. </li><li> Células são visualizadas elevados níveis de fluorescência deveria ser usado. Idealmente, pelo menos, 50% deas células da cultura deve ser altamente fluorescente. Fluorescência celular pode ser aumentada por separação de células por meio de FACS. </li></ol> As proteínas marcadas com adicionais devem ser fundidos com fluoróforos diferentes e ser codificado em plasmídeos que codificam para diferentes antibióticos de selecção. Meio de selecção para as células transfectadas com mais do que um plasmídeo deve ser suplementado com todos os antibióticos apropriados. 2. De células T Espalhando Preparação de Ensaio <ol><li> Use Lab-Tek II sistema lamela alemão 4 slides de câmara. Certifique-se de que não arranhar acidentalmente a superfície interior das câmaras, por exemplo, com uma ponta de pipeta, durante a preparação ou utilização. </li><li> Preparar 50 ml de solução de preparação da lâmina: Tome 4,6 mL de 12 M (37%) de HCl, adicionar 38,5 ml de etanol a 100%, e 6,9 ​​ml de água bidestilada. </li><li> Encha cada câmara do slide com 500 mL solução de preparação da lâmina. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Aspirar a câmaras, secá-los completamente. </li><li> Incubar as lâminas descoberto por 1 hora a 45 ° C até secar completamente. </li><li> Preparar a solução de poli-L-lisina 0,01% por diluição de 0,1% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) em água duplamente destilada. </li><li> Aplicar 500 mL para cada câmara. </li><li> Incubar as lâminas durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar as câmaras, secá-los completamente. </li><li> Incubar durante 3 horas a 45 ° C até secar completamente. </li><li> Lâminas revestidas podem ser armazenadas secas durante vários meses à temperatura ambiente. </li><li> Prepara-se uma solução de anticorpo activador. Utilização de um anticorpo anti-CD3: ou HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) ou UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml em 400 ul de PBS, em cada câmara. Esta solução deve ser preparada pouco antes de preparação. </li><li> Encher cada câmara com 400 ul da solução de anticorpo activador. </li><li> Incubar a lâmina durante 2 horas a 37 ° C ou, de preferência, durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover o anticorpo de activação solenóidebuição e lave imediatamente a câmara duas vezes com 300 mL PBS. A partir deste ponto, certifique-se as câmaras permanecem cheias de buffer. </li><li> Armazenar o diapositivo PBS preenchido a 4 ° C. Sugerimos o uso das câmaras de slides preparados dentro de 1 semana. </li></ol> 3. A ativação de células T e Imagem <ol><li> Preparar tampão de imagiologia [1,25 ml de HEPES (1 M), 10 ml de FCS, 38,75 mL de meio RPMI sem vermelho de fenol]. Tampão de imagiologia pode ser armazenado a 4 ° C após filtração. </li><li> Ative o Zeiss LSM 510 Meta microscópio. Aqueça o heatable estrutura de montagem microscópio para 37 ° C. Selecione &quot;Modo Expert&quot;. </li><li> Clique na aba &quot;Adquirir&quot; e abra as seguintes guias: Lasers; Microscopia; configuração; digitalização; Tempo Series. </li><li> Ative os lasers necessários. Para excitação do CGPP e mYFP, defina o Argon / 2 laser para &quot;standby&quot; para 5 min, em seguida, para &quot;on&quot;. </li><li> Se você executou este ensaio de imagens de células ao vivo antes, usando os mesmos fluorophores, abra o arquivo LSM resultante, clique no botão &quot;reutilização&quot; iengodo, e continuar a partir do passo 9. Caso contrário, continuam a partir do passo 6. </li><li> Definir canais utilizando os filtros apropriados para a excitação e de emissão das proteínas fluorescentes utilizados. </li><li> Na janela &quot;Scan controle&quot;, selecione a opção pilha Z. </li><li> Digite os seguintes parâmetros de rastreamento: número de fatias: 5; intervalo: 0,5 m; fatia atual: 3. </li><li> Preparar um banho Accublock digital seco (Labnet) a 37 ° C perto do microscópio. </li><li> Aquecer o tampão de imagiologia e 37 ° C. </li><li> Prepare o slide armazenados por aspiração do PBS, substituindo-o por 600 mL de tampão de imagem quente. </li><li> Incubar a lâmina a 37 ° C. Manter a lâmina na incubadora até passo 13, durante pelo menos 15 min. </li><li> Colete 5 × 10 5 células T transfectadas. </li><li> Centrifugar as células durante 2 minutos a 400 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de tampão de imagiologia quente, e transferi-los para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Coloque a ttubo est no banho a seco Digital Accublock. </li><li> Leve o slide aquecido da incubadora, e montá-lo no microscópio estrutura de montagem aquecido. </li><li> Clique no ícone &quot;VIS&quot;. </li><li> Misture a suspensão de células e remover 1-2 ul. </li><li> Inserir a ponta da pipeta para o buffer de imagem de cima da parte inferior da lâmina. Evite coçar o slide. </li><li> Semente das células sobre a abertura da objetiva. </li><li> Começar imediatamente rastrear visualmente as células fluorescentes como eles descem. Seleccionar uma célula que exibe fluorescência elevada em ambos os canais. </li><li> Antes de a célula atinge a superfície da lâmina, activar o modo de LSM. </li><li> Alterna apenas uma excitação com laser. Selecione um laser para o qual você tem um canal de DIC. </li><li> Definir Zoom para 1. Clique no ícone &quot;Fast XY&quot;. Clique no ícone &quot;Stop&quot;. Usando a ferramenta Recortar, selecione um ROI centrado na célula. </li><li> Definir Zoom para 3. Clique no ícone &quot;Fast XY&quot;, em seguida, definir o foco manualmente para ver perfeitamente o celular. Clique no botão &quot;Stop&quot; icon. </li><li> Alternar todos os lasers de excitação necessários. </li><li> Iniciar a gravação clicando no ícone &quot;StartT&quot;. Imagem da célula para a totalidade do processo de difusão (habitualmente 5 min.) Quando terminar, clique no ícone &quot;Stop&quot;. </li><li> Salve o arquivo. </li><li> Para adquirir células adicionais, clique no ícone &quot;VIS&quot;. Se há células que ainda não entrou em contato com o fundo do slide, continue a partir do passo 23. Evite células de imagem que já começaram o processo de propagação. Caso contrário, vá para o passo 32. </li><li> Se a área de lâmina observada é principalmente desprovida de células, adicionar uma outra alíquota de células continuam a partir do passo (20). Caso contrário, vá para o passo 33. </li><li> Para adquirir células adicionais, mover a corrediça de modo que a zona superior da abertura da objectiva é desprovida de células. </li><li> Adicionar outra aliquota de células (e continuar no passo 20). </li><li> Após a realização de toda a imagem desejada, abrir um arquivo LSM salvos. </li><li> Clique em &quot;Galeria&quot;, &quot;Time + Z&quot; e &quot;subconjunto&quot;. </li><li> Selecione o relevant intervalo de tempo e pilha Z. </li><li> Salve o novo arquivo. </li><li> Realize os passos 35-38 para todos os arquivos de imagem. </li></ol> 4. Análise de dados de imagem <ol><li> Abra os arquivos usando o software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurich Suíça). </li><li> Clique em &quot;Superar&quot;. Clique no menu &quot;Processamento de Imagem&quot; e selecione &quot;Troque Tempo e Z&quot;. Isso vai ajudar no cultivo correto da imagem. </li><li> Clique no botão &quot;Editar&quot; da barra de ferramentas e selecione a opção &quot;Crop 3D&quot; no menu drop. Cortar a imagem para incluir apenas a área circundante da célula. Sugerimos cortar um quadrado de pixels 300 × 300 centrado na célula. Note-se que a forma ea localização da célula pode mudar ao longo do tempo. Observando-se o eixo t, certifique-se de que a célula está dentro da região cortada em todos os momentos. </li><li> Clique no menu &quot;Processamento de Imagem&quot; e selecione &quot;Troque Tempo e Z&quot; para restaurar a separação temporal original da imagem. </li><li> Pressione o botão &quot;Coloc&quot; na barra de ferramentas principal. Selecione &quot;Construir Tempo Dep. COLOC &quot;. Imaris calculará automaticamente limiares de intensidade para cada canal em cada momento. </li><li> Ver os resultados da análise de co-localização, selecionando &quot;Estatísticas Channel&quot;. Exportar os dados, clicando em &quot;Export&quot;. </li><li> Repetir os passos 1 a 6, para cada célula de imagens. Recomenda-se que pelo menos 50 células ser analisados ​​desta forma. </li><li> Calcule o coeficiente de co-localização média de Pearson e seu erro padrão ou desvio. </li></ol>

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Nós não temos conflitos de interesse de divulgar.

A regulação e função de vários processos celulares dependem da formação e terminação de interacções proteína-proteína. Imagens microscópicas permite o acompanhamento em tempo real das proteínas fluorescentes marcados em células vivas. Co-localização de proteínas marcadas pode sugerir uma interacção directa ou indirecta entre as proteínas, e podem ser usados ​​para reforçar resultados obtidos por métodos bioquímicos, tais como a imunoprecipitação. Ao contrário de métodos bioquímicos, ima...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 clone) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>German coverglass system 4 chamber slides </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Accublock digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation device</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence activated cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

A protecção contra doenças infecciosas é mediada pelo sistema imunológico 1,2. Os linfócitos T são os coordenadores mestre do sistema imunitário, que regula a activação e respostas de várias células imunitárias 3,4. A activação das células T depende do reconhecimento de antigénios específicos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs). O receptor de antigénio de célula T (TCR) é específico para cada clone de células T e determina a especificidade do antigénio 5. A ligação do TCR para o antigénio induz a fosforilação dos componentes do complexo TCR. A fim de promover a activação das células T, o sinal deve ser transduzida a partir da membrana para o citoplasma e o núcleo, inicia várias respostas cruciais tais como o recrutamento de proteínas de sinalização para o TCR; da APC (da sinapse imune), a sua activação molecular, rearranjo do citoesqueleto, a elevação da concentração de cálcio intracelular, e as alterações na expressão do gene 6,7. O correto emitiation e terminação dos sinais de activação é crucial para as respostas de células T apropriadas. A actividade das proteínas de sinalização é dependente da formação e terminação de interacções proteína-proteína, pós translacionais, tais como a fosforilação da proteína, a formação de complexos de proteína, ubiquitinação de proteínas e ao recrutamento de proteínas para vários locais celulares 8. Compreender o funcionamento interno do processo de ativação de células T é crucial para a pesquisa imunológica e aplicações clínicas. Diversos ensaios têm sido desenvolvidas a fim de investigar as interacções proteína-proteína, no entanto, os ensaios bioquímicos, tais como o método de co-imunoprecipitação amplamente utilizado, não permitem a localização da proteína para ser discernidos, impedindo assim a observação de informações valiosas sobre a dinâmica de celular mecanismos. Além disso, estes ensaios granel geralmente combinam proteínas de muitas células diferentes que podem estar em diferentes fases da tele investigou processo celular. Isto pode ter um efeito prejudicial na resolução temporal. A utilização de imagens em tempo real de células vivas tanto permite o rastreio espacial das proteínas e a capacidade de distinguir entre os eventos de sinalização temporalmente, derramando assim luz sobre a dinâmica do processo de 9,10. Apresenta-se um método de imagem em tempo real da formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T. As células T primárias ou linhas de células T, como Jurkat, são transfectadas com plasmídeos que codificam para proteínas de interesse fundidos a proteínas fluorescentes monoméricos, impedindo oligomerização não fisiológico 11. Vivo células T são eliminadas durante uma lamela pré-revestida com anticorpo de activação de células T 8,9, o qual se liga ao complexo CD3/TCR, indução da activação de células T ao superar a necessidade de antigénios de activação específicas. As células activadas são constantemente fotografada com a utilização de microscopia confocal. Dados de imagem são analisados ​​para produzir resultados quantitativos, como o colcoeficiente ocalization das proteínas de sinalização.

Nós apresentamos um exemplo de imagem de células T ao vivo e análise. Antes do experimento imagiologia, SLP76 células T deficientes (J14) foram analisadas com o uso de FACS para determinar a expressão de proteínas fluorescentes (Figura 1). As células T transfectadas com as proteínas de sinalização etiquetados CGPP-Nck e SLP76-mYFP foram depositadas sobre lâminas de activação e fotografada durante o espalhamento das células-T (Figura 2). Recolhidas as imagens mostram a din?...

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Imagens ao vivo em tempo real da formação do complexo de sinalização de células T | Imunologia e Infecção | Vídeo

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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13.6K visualizações.  Bar-Ilan University. Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Vídeo: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Bioquímica

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological synapse, a stereotyped cell-cell junction that regulates T cell activation and directionally targets effector responses. To study these processes effectively, an imaging approach that is tailored to capturing fast, polarized responses is necessary. This protocol describes such a system, which is based on a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) that is non-stimulatory until it is exposed to ultraviolet light. Targeted decaging of this reagent during videomicroscopy experiments enables precise spatiotemporal control of TCR activation and high-resolution monitoring of subsequent cellular responses by total internal reflection (TIRF) imaging. This approach is also compatible with genetic and pharmacological perturbation strategies. This allows for the assembly of well-defined molecular pathways that link TCR signaling to the formation of the polarized cytoskeletal structures that underlie the immunological synapse.

This protocol describes an imaging-based method to activate T lymphocytes using photoactivatable peptide-MHC, enabling precise spatiotemporal control of T cell activation.

Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Técnica de imagem de alta resolução para detecção de microdomínios de Ca2+ em células T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a ativação inicial da resposta imune adaptativa para intervenção terapêutica

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...