Esta pesquisa foi financiada pelo NIH 1R01HL140239-01 para a AMC. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagens Celulares da Universidade Drexel.

1. Crescimento de células epiteliais mamárias e mídia de ensaio
<ol><li>Células epiteliais mamárias MCF10A NOTA: A linha de células epiteliais de mama imortalizada não tumorigênica é derivada de uma paciente com doença fibrocística43. As células não expressam receptor de estrogênio.<ol>
<li>Para preparar 20 μg/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), dissolva 100 μg de EGF liofilizado em 500 μL de dH2O estéril para fazer 200 μg/mL EGF. Adicione 500 μL de 200 μg/mL EGF em 4,5 mL de BSA estéril de 0,1% em dH2O para fazer uma solução de estoque EGF de 20 μg/mL. Loja preparada 20 μg/mL EGF alíquotas a -20 °C por até 12 meses.</li>
		<li>Para preparar 500 μg/mL hidrocortisona, diluir 1 mg de hidrocortisona em 1 mL de etanol absoluto (prova de 200). Adicione 1 mL de DMEM F:12 estéreis a esta mistura para fazer uma solução de estoque de hidrocortisona de 500 μg/mL. Armazene alíquotas de estoque de hidrocortisona a -80 °C por até 12 meses.</li>
		<li>Para preparar 10 μg/mL toxina da cólera, dissolva 1 mg de pó liofilizado de toxina cólera em 1 mL de dH2O estéril para fazer uma solução de estoque de toxina de cólera de 1 mg/mL. Armazene alíquotas de estoque de toxinas de cólera a -80 °C por até 12 meses.</li>
		<li>Para preparar o Growth Medium, adicione 500 μL de EGF (20 μg/mL), 500 μL de hidrocortisona (500 μg/mL), 5 μL de toxina de cólera (1 mg/mL), 500 μL de insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL de penicilina e estreptomia, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM F:12 para uma concentração final de 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL hidrocortisona, 10 ng/mL toxina de cólera, 10 ng/mL insulina bovina, penicilina v/v e estreptomicina, e 5% de soro v/v de cavalo. A concentração de antibióticos foi aumentada para 2% para explicar a diminuição da esterilidade no processo de bioimpressão; no entanto, a concentração de antibióticos pode ser reduzida para 1%.</li>
		<li>Para preparar o Assay Medium, adicione 500 μL de hidrocortisona (500 μg/mL), 5 μL de toxina de cólera (1 mg/mL), 500 μL de insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL de penicilina e estreptomicina, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM F:12 para uma concentração final de 500 ng/mL hidrocortisona, 10 ng/mL micose de cólera, 10 ng/mL insulina bovina, 2% v/v penicilina e estreptomicina, e 5% v/v de soro de cavalo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOTA: A linha celular epitelial do câncer de mama triplamente negativa (sem receptor de estrogênio, receptor de progesterona e receptor de fator de crescimento epidérmico 2) é criada a partir da efusão pleural de uma paciente do sexo feminino com adenocarcinoma mamário metastático44. As células representam um câncer de mama agressivo, invasivo e pouco diferenciado.<ol>
<li>Para preparar o Crescimento e o Médio de Ensaio, adicione 50 mL de soro bovino fetal, 10 mL de penicilina e estreptomicina, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM para concentração final 10% v/v soro bovino fetal, 2% v/v penicilina e estreptomicina, e 5% v/v de soro bovino.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura celular epitelial mamária
<ol><li>Semente 500.000 células MCF10A ou MDA-MB-231 em um prato de cultura de tecido de 10 cm (P100) com 10 mL de mcf10A ou mídia de crescimento MDA-MB-231. As células MCF10A e MDA-MB-231 atingem >90% de confluência em 48 horas.</li>
	<li>Para passar células epiteliais mamárias, primeiro lavar células com 10 mL de PBS quente.</li>
	<li>Despete as células epiteliais da mama adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 20-25 minutos.</li>
	<li>Adicione 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium às células experimentpsinizadas para neutralizar a trippsina. Pipeta a mistura de mídia celular para cima e para baixo para resuspend células e quebrar aglomerados celulares.</li>
	<li>Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 1.200 x g por 3 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasal e resuspenha a pelota de célula em 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium.</li>
	<li>Placa 1 mL de suspensão celular em 5 novos pratos de cultura tecidual de 10 cm, juntamente com MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. As células estarão prontas para serem passagem novamente em 2-3 dias. As células MCF10A podem ser mantidas na passagem número 35, após a qual apresentam alterações morfológicas. As células MDA-MB-231 podem ser mantidas na passagem número 24, após a qual apresentam alterações morfológicas.</li>
</ol>3. Formação esferoide Epitelial de Mama
<ol><li>Congele 200 pontas de pipeta μL por 30 minutos antes de iniciar o ensaio. Mantenha a solução matricial reduzida do fator de crescimento (por exemplo, Matrigel) (10 mg/mL) no gelo durante todo o processo.</li>
	<li>Pipeta lentamente 30 μL de solução de matriz gelada usando pontas de pipeta de 200 μL geladas em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços. Comece pelos lados e arraste a ponta da pipeta ao longo dos cantos, adicionando uma gota final ao centro do poço para garantir um revestimento uniforme de cada poço. Evite bolhas de ar durante esta etapa para garantir uma camada uniforme de solução de matriz. Use novas dicas de pipeta para cada poço.</li>
	<li>Incubar lâminas de câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 15-20 minutos para polimerizar a solução matricial.</li>
	<li>Células MCF10A experimentadas de resuspendam em 200.000 células/mL ou células MDA-MB-231 experimentadas em MDA-MB-231 Em MDA-MB-231 Growth Medium a 200.000 células/mL.</li>
	<li>Se usar células MCF10A, prepare o novo McF10A Spheroid Growth Medium adicionando 5 μL de EGF (20 μg/mL) e 100 μL de solução matricial a 5 mL de Assay Medium para uma concentração final de 2% de solução matricial.</li>
	<li>Remova o slide da câmara pré-revestido com solução de matriz da incubadora. Adicione 50 μL de suspensão celular MCF10A ou MDA-MB-231 (10.000 células) a cada poço. Se usar células MCF10A, adicione 450 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium. Se usar células MDA-MB-231, adicione 450 μL de MDA-MB-231 Growth Medium pré-misturada com solução de matriz de 2% (9 μL). Coloque imediatamente o deslizamento da câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua o meio a cada 4 dias. Pipeta cuidadosamente 200 μL de mídia antiga de um canto de cada poço usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Durante este processo, incline o deslizamento da câmara a 45° para garantir que os esferoides não sejam perturbados. Adicione 200 μL de McF10A Spheroid Growth Medium recém-preparado ou MDA-MB-231 Growth Medium previamente misturado com solução de matriz de 2% para cada poço no canto em gotas para garantir que os esferoides permaneçam ligados à matriz de camadas. Apenas ~50% da mídia é substituída para que todas as citocinas produzidas pelos esferoides não estejam completamente esgotadas. NOTA: Os epitélios mamários MCF10A levam até 8 dias para polarizar e formar centros ocos. Os esferoides epiteliais mamários MDA-MB-231 levam até 5 dias para se formar e não têm centros ocos.</li>
</ol>4. Formação da Rede celular endotelial
<ol><li>Cultura da Célula Endotelial da Veia Umbilical Humana (HUVEC)<ol>
<li>Adicione o conteúdo de um único kit de crescimento endotelial médio-2 contendo fator de crescimento de insulina, fator de crescimento do fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular, ácido ascórbico, fator de crescimento epidérmico, heparina e gentamicina-anfotericina B, juntamente com 50 mL de soro bovino fetal, penicilina-estreptomicina de 5 mL e 5 mL de glutamina de 200 mM a 500 mL de Médio-2 Basal Endotelial (EBM-2) para criar médio completo de crescimento endotelial (EGM-2).</li>
		<li>Semente 500.000 células endoteliais em um prato de cultura tecidual de 10 cm em 10 mL de EGM-2. Coloque as células em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 até atingirem >80% de confluência (em torno de 48 horas).</li>
		<li>Para as células de passagem, lave as células endoteliais com 10 mL de PBS quente. Desprender huvec adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato de cultura tecidual de 10 cm. Monitore de perto as células por microscopia de contraste de fase. As células estão prontas quando estão emarinhadas, mas permanecem presas ao prato.</li>
		<li>Aspire cuidadosamente o trypsin para fora do prato. Adicione 8 mL de EGM-2 ao prato. Lave as células do prato, pipetando o EGM-2 para cima e para baixo sobre toda a superfície do prato.</li>
		<li>Alternativamente, adicione 5 mL de EGM-2 às células experimentadas para neutralizar a trippsina. Pipeta a mistura de mídia celular para cima e para baixo para resuspend células e quebrar aglomerados celulares. Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 1.200 x g por 3 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspenja a pelota de célula em 10 mL de EGM-2.</li>
		<li>Adicione 1 mL de suspensão celular a 9 mL de EGM-2 em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. Troque 2/3 do meio com EGM-2 fresco a cada 2 dias. As células estarão prontas para passar em 3-5 dias. O HUVEC pode ser mantido até a passagem 8 após o qual eles não conseguem formar redes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formação de Rede de Células Endoteliais (HUVEC)</li>
	<li>Congele 200 pontas de pipeta μL por 30 minutos antes de iniciar o ensaio. Mantenha a solução matricial reduzida do fator de crescimento (10 mg/mL) no gelo durante todo o processo.</li>
	<li>Pipeta lentamente 30 μL de solução de matriz gelada usando pontas de pipeta de 200 μL geladas em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços. Comece pelos lados e arraste a ponta da pipeta ao longo dos cantos, adicionando uma gota final ao centro do poço para garantir um revestimento uniforme de cada poço. Evite bolhas de ar durante esta etapa para garantir uma camada uniforme de solução de matriz. Use novas dicas de pipeta para cada poço.</li>
	<li>Incubar lâminas de câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 por 15-20 minutos para polimerizar Matrigel.<ol>
<li>Pré-colorir um prato de 10 cm de HUVEC com 10 μL de rastreador de célula vermelha (1:1000) por 30 minutos em 37 °C, 5% incubadora CO2.</li>
		<li>Lave células endoteliais com 10 mL de PBS quente. Desprender huvec adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato de cultura tecidual de 10 cm. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 5 minutos para desprender totalmente as células.</li>
		<li>Adicione 5 mL de EGM-2 ao prato para neutralizar o trypsin. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 25 mL. Centrifugar HUVEC a 1.200 x g por 5 minutos. Aspire o supernasce e resuspense a pelota celular em 5 mL de EBM-2 sem soro.</li>
		<li>Conte células usando azul Trypan para determinar células viáveis. Crie uma solução de 1 x 106 células/mL.</li>
		<li>Adicione 100.000 HUVEC a cada poço com 200 μL de EBM-2 sem soro. Se mais células forem adicionadas, elas criarão uma monocamada superficial em vez de uma rede de tubos.</li>
		<li>Incubar huvec em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2. Após 6 horas, imagem redes HUVEC por microscopia de contraste de fase. As redes estão prontas para a cocultura com esferoides de mama.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioimpressão Epiteliais epitelóides em redes HUVEC pré-formadas
NOTA: Um sistema de bio-deposição de bico duplo deve ser usado para o processo de biofabização. Neste caso, o sistema tinha três braços de movimento para permitir o controle espacial em escala de micron da deposição de material, bem como dois motores acionados por parafuso para depositar bioink a partir de seringas de 10 mL. O sistema deve ser funcionalizado com um sistema de filtragem de ar particulado de alta eficiência, bem como capacidades de esterilização UV para manter um ambiente estéril durante a bioimpressão. A bioimpressora é esterilizada por uma hora antes do processo de impressão.
<ol><li>Crie esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC como descrito anteriormente. Estimar o número de esferoides epiteliais mamários em cada poço contando esferoides em imagens de microscopia de contraste de fase representativa.</li>
	<li>Corte 0,5 cm da extremidade de uma ponta de pipeta de 1000 μL. Use a ponta de pipeta cortada para pipeta cuidadosamente todos os esferoides fora do deslizamento de câmara de 8 poços e em um tubo de 50 mL. Spheróides resuspend no bioink selecionado a 100 esferoides/100 μL. NOTA: Concentrações mais elevadas de esferoides podem resultar em agrupamento esferoides e impedir a visualização de interações entre os esferoides e as redes endoteliais.</li>
	<li>Passe a mistura de esferoides através de um coador de células de 70 μm para remover quaisquer esferoides grandes ou agrupados.</li>
	<li>Carregue os esferoides agrupados em uma seringa estéril de 10 mL e tampe-a com uma agulha estéril de calibre 25. Conecte a seringa ao sistema de bio-deposição.</li>
	<li>Aspire o meio fora das redes HUVEC no slide de câmara de 8 poços.</li>
	<li>Extrude 100 μL de esferoides epiteliais mamários em 6 poços de redes HUVEC a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Mantenha 2 poços de redes HUVEC como controles.</li>
	<li>Adicione 400 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium se usar spheroids MCF10A impressos em redes HUVEC ou adicionar 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium previamente misturado com solução de matriz de 2% se usar spheroids MDA-MB-231 impressos em redes HUVEC. O respectivo meio de crescimento esferoide deve ser utilizado em poços de controle HUVEC.</li>
	<li>Incubar co-culturas em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 24 – 96 horas sem alteração de mídia. As coculturas permanecerão viáveis no meio original por até quatro dias.</li>
</ol>6. Microscopia Confocal
<ol><li>Preparação de tampão de lavagem de imunofluorescência e PBS-Glycine<ol>
<li>Prepare a solução de estoque tampão de imunofluorescência (IF) 10x adicionando 2,5 g de azida de sódio, 5 g de albumina de soro bovino, 10 mL de Triton X-100 e 2,05 mL de Tween-20 em 500 mL de 10x PBS. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução de estoque por até um ano a 4 °C para evitar sedimentação.</li>
		<li>Crie um buffer IF funcionando diluindo 50 mL de 10x IF tampão em 450 mL de água deionizada estéril. Armazene a solução de trabalho em temperatura ambiente por até uma semana.</li>
		<li>Prepare a solução de estoque tampão PBS-Glycine de 10x adicionando 37,5 g de glicina a 500 mL de PBS 10x. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução de estoque por até 6 meses a 4 °C para evitar sedimentação.</li>
		<li>Crie uma solução PBS-Glycine em funcionamento diluindo 50 mL de tampão PBS-Glycine de 10x em 450 mL de água desionizada estéril. Armazene a solução de trabalho a 4 °C por até uma semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rotular Amostras bioimpressoras e imagem por Microscopia Confocal<ol>
<li>Aspirar meio a partir de co-culturas 3D bioimpressionadas e enxaguar 3 vezes com PBS quente. Corrija co-culturas 3D bioimpressoras com 4% de paraformaldeído por 1 h à temperatura ambiente. Enxágüe amostras 3 vezes por 20 minutos com 1x PBS-Glycine.</li>
		<li>Bloqueie amostras com tampão IF misturado com soro de cabra de 10% por 90 minutos (bloco primário), seguido de 40 minutos com tampão IF mais 10% de soro de cabra e fragmento de Affinipure Fab (1:100, bloco secundário).</li>
		<li>Se usar esferoides MCF10A, rotule amostras com um anticorpo primário para integrin α6 (1:100) no buffer de bloqueio secundário durante a noite a 4 °C, seguido por um Alexa Fluor 488 anticorpo secundário (1:200) e Hoescht 33342 (1:1000) para 1h à temperatura ambiente protegido da luz. As linhas celulares MCF10A expressam altos níveis de integrin α6, o que é essencial para mostrar polarização e morfologia efpheróides.</li>
		<li>Se usar spheroids MDA-MB-231, que expressam baixos níveis de integrin α6, rotule amostras com Alexa Fluor 488 fálice (1:100) e Hoescht 33342 (1:1000) em tampão de bloqueio secundário por 4 horas à temperatura ambiente protegido da luz. A falotinina permite a visualização de filamentos de actina para que a morfologia amorfo e invasiva e esfélide possa ser avaliada.</li>
		<li>Lave amostras com 1X PBS-glycine 3 vezes por 20 minutos.</li>
		<li>Prepare amostras para montagem removendo o slide da câmara usando a ferramenta do fabricante. Adicione uma pequena gota de solução antifade a cada poço. Coloque uma tampa de 22 mm x 60 mm em cada slide de câmara e sele cuidadosamente as bordas com esmalte claro.</li>
		<li>Amostras de imagem usando um microscópio confocal como pilhas Z de ~10 fatias em passos de 5 μm. Se desejar, comprimir os planos Z em um único plano usando o comando Extended Focus no software de imagem celular.</li>
		<li>Quantifique a adesão eferóide às redes endoteliais usando a imagem J. O número de esferoides aderidos pode ser quantificado usando o plugin de análise com o tamanho e circularidade de partículas apropriados. Normalize o número de esferoides conectados à área de imagem.</li>
		<li>Para garantir a reprodutibilidade, quantifique o número de esferoides aderidos em imagens de 4 x 4 de azulejos de co-culturas. Se o número de esferoides for estatisticamente significativamente menor do que outros experimentos, o experimento deve ser repetido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo é o primeiro de seu tipo a bioimpressão spheroids em sua arquitetura 3D para co-cultura com células endoteliais também em sua arquitetura 3D. As etapas críticas do protocolo incluem a formação inicial de esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC. Deve-se ter extrema cautela na alimentação de esferoides epiteliais mamários, pois são facilmente interrompidos da solução matricial. Da mesma forma, os esferoides epiteliais mamários devem ser tratados com cuidado quando são pipetted fora da so...

Modelos de tumores vascularizados in vitro 3D são ferramentas essenciais para o estudo mecanicista do crescimento do câncer e da metástase. Para o câncer de mama em particular, as células epiteliais mamárias cultivadas em Matrigel se organizam em esferoides polarizados que se assemelham mais à arquitetura acinus mamária in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. A cultura epitelial da mama 3D também impacta a função celular, com culturas 3D mostrando diferenças na modulação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF)8,9; função oncogene, incluindo ErbB210; crescimento e apoptose sinalizando11,12; e resistência à quimioterapia13,14. As células endoteliais vasculares respondem de forma semelhante aos estímulos ambientais em 3D vs. cultura 2D tradicional15,16,17,18. No entanto, grande parte da compreensão das interações epiteliais vasculares e mamárias vem da cultura 2D usando pastilhas médias ou transwell condicionadas, ou modelos 3D nos quais os dois tipos de células são fisicamente separados19,20,21,22,23. Esses modelos de cocultura fornecem uma visão fisiológica limitada, uma vez que tanto a cultura 3D quanto o contato celular-célula são fundamentais para a endotelial vascular – interações epiteliais mamárias24,25,26.
Modelos de câncer 3D foram fabricados utilizando uma variedade de técnicas, incluindo formação de spheroid suspensa, bioimpressão, montagem magnética e cultura dentro de hidrogéis ou em andaimes projetados5,27,28,29. Mais recentemente, modelos de tumor 3D foram criados com vários tipos de células dispostos em suas respectivas estruturas 3D. Em um exemplo de uma plataforma tumor-on-a-chip, câncer, células endoteliais e estromais foram misturados em uma matriz e, em seguida, injetados nas três câmaras centrais de tecido em um dispositivo polidimetilsiloxano (PDMS). As câmaras de tecido eram cercadas por dois canais externos que representavam uma artéria e venule. Após 5-7 dias de cultura, as células endoteliais formaram uma rede microvascular e as células cancerígenas proliferaram para formar pequenos tumores perto da vasculatura. Esta plataforma foi então usada para rastrear drogas e combinações de drogas30. Plataformas adicionais de tumor-on-a-chip foram criadas para estudar metástase e tipos de câncer com estímulos mecânicos específicos (por exemplo, tensão mecânica no pulmão)31,32. No entanto, essas plataformas geralmente não incluem vasculatura e câncer em suas respectivas estruturas 3D.
A biofabização mostra grande promessa no avanço de modelos de tumores vascularizados in vitro 3D, uma vez que permite um controle espacial rigoroso sobre a localização celular. Apesar do crescimento da bioimpressão na última década, poucos estudos se concentram especificamente nos tumores33,34. Em um exemplo, a impressão 3D de células HeLa em um hidrogel gelatina/alginato/fibrinogen foi usada para criar um modelo de câncer cervical in vitro. As células tumorais foram bioimpressas como células individuais e, em seguida, autorizadas a formar esferoides, que apresentaram maior taxa de proliferação, aumento da expressão metaloproteinase matricial e maior que a quimiosistência do que as células na cultura 2D35. Nesses estudos, como em muitos outros36,37, as suspensões celulares dissociadas foram bioimpressionadas, e então as culturas celulares foram fornecidas com as sugestões mecânicas e bioquímicas necessárias para permitir que as células formassem uma estrutura 3D. No entanto, a automontagem celular pode levar dias ou semanas, pode exigir pistas ambientais espaciais e temporais complexas, ou pode não ocorrer quando dois tipos de células são co-cultivados. Por exemplo, as células epiteliais mamárias induziram a morte celular em células endoteliais em cocultura 2D, e as células epiteliais de mama dissociadas não formaram esferoides 3D quando bioimpressionadas em hidrogéis de alginato/gelatina38. Células epiteliais de mama dissociadas ou cancerosas formaram esferoides em bioinks à base de alginato somente quando presos em moldes PDMS circulares. Em outros casos, os esferoides foram formados usando gotículas suspensas em placas de poço circular de fixação ultra-baixa e, em seguida, misturados em bioinks à base de alginato39,40.
Descrevemos agora um método alternativo de biomafação de tecido 3D neste protocolo. Em vez de células dissociadas de sementes e esperar que essas células formem as estruturas 3D, descrevemos como criar e bioimpressular spheróides tumorais 3D em uma rede de tubos vasculares para criar um modelo de co-cultura tumoral que pode ser usado quase imediatamente. Os esferoides tumorais podem ser cultivados in vitro ou derivados de tecidos humanos (organoides). Da mesma forma, os tubos vasculares podem ser cultivados ou podem ser derivados de fragmentos microvasculares teciduais adiposos. Os bioinks podem variar de alginato biologicamente inativo ao Matrigel41altamente biologicamente ativo . Uma vez que este modelo de cocultura tumoral 3D pode ser criado com uma variedade de estruturas celulares e bioinks, ele pode incorporar vários tipos de células, matrizes extracelulares e gradientes de quimiocina15,42. Enquanto em sua formulação atual, as redes endoteliais não podem ser perfundidas, futuras iterações poderiam integrar esse método com microfluidos ou sistemas -on-chip. Bioimpressão epitelial 3D em redes endoteliais permite a biofabricação rápida de modelos de mama humana para testes de drogas e medicina de precisão personalizada27.

<table><tbody><tr><td>37&amp;deg;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Cell incubation</td></tr><tr><td>3D Bio printer</td><td>custom-made</td><td>None</td><td>Used for bioprinting</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>for seeding spheroids</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>bioprinting syringe needle</td></tr><tr><td>Absolute ethanol (200 proof )</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>reconsitution of media components</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&amp;prime;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>secondary block - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bovine insulin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blocking agent -Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Remove large or clustered spheroids</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;trade; Red CMTPX Dye</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>pre-stain for HUVEC tubes</td></tr><tr><td>Compact Centrifuge</td><td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td><td>Z206A</td><td>For cell centrifugations</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Conical tubes 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Collecting and resuspending cells</td></tr><tr><td>Countess II-FL Cell counter</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>counting cells</td></tr><tr><td>Glass pipettes (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>cell resuspension</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A basal media</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunofluorescence labelling component</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Nuclei stain immunofluorescence</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td><td>Cell applications, San Diego , CA</td><td>200-05f</td><td>Endothelial cell lines</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td></tr><tr><td>Live Dead assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal microscope</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Used to visualize cells</td></tr><tr><td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Spheroid formation</td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>cell fixative</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Wash buffer for cells before trypsinization</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immunofluorescence mountant medium</td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ assay media component</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Sterile syringe (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>bioprinting process</td></tr><tr><td>Tissue culture dish (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>monolayer cell culture</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>cell counter additive</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>cell detachment</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF&lt;sub&gt;165&lt;/sub&gt;)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tube additive</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cell imaging software</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compresser</td></tr></tbody></table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

A bioimpressão está emergindo como uma ferramenta promissora para fabricar modelos de câncer humano 3D que melhor recapitulem marcas críticas da arquitetura de tecidos in vivo. Na bioimpressão atual de extrusão de camada por camada, as células individuais são extrudadas em um bioink juntamente com pistas espaciais e temporais complexas para promover a auto-montagem do tecido hierárquico. No entanto, essa técnica de biofabricação conta com interações complexas entre células, bioinks e sinais bioquímicos e biofísicos. Assim, a automontagem pode levar dias ou até semanas, pode exigir bioinks específicos, e pode nem sempre ocorrer quando há mais de um tipo de célula envolvida. Desenvolvemos, portanto, uma técnica para bioimpressão pré-formada esferoides epiteliais de mama 3D em uma variedade de bioinks. Os esferoides epiteliais de mama 3D pré-formados bioimpressas sustentaram sua viabilidade e arquitetura polarizada após a impressão. Também imprimimos os esferoides 3D em redes de células endoteliais vasculares para criar um modelo de co-cultura. Assim, a nova técnica de bioimpressão cria rapidamente um modelo de mama humano 3D mais fisiologicamente relevante a um custo menor e com maior flexibilidade do que as técnicas tradicionais de bioimpressão. Esta técnica versátil de bioimpressão pode ser extrapolada para criar modelos 3D de outros tecidos em bioinks adicionais.

As células epiteliais mamárias devem se auto-organizar em esferoides 3D após 5-8 dias de cultura sobre solução matricial e em meio de cultura com solução de matriz de 2%. Epitóides epiteliais não tumorigênicos MCF10A devem aparecer redondos e ter um centro oco, com integrin α6 polarizado à borda externa do esferoide(Figura 1, inset mostra centros ocos). Células epiteliais altamente invasivas MDA-MB-231 formam esferoides irregulares. Os esferoides devem ser usados quando tiverem ...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K visualizações.  Drexel University. O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

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Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Pesquisa do câncer

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioengenharia

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Células estromais heteromulticelulares em culturas 3D sem andaimes de células epiteliais cancerígenas para impulsionar a invasão

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bioimpressão 3D para fabricação rápida de redes vasculares usando vasos em uma placa

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in coronary arteries and impaired function of the blood-brain barrier. Existing fabrication techniques do not adequately replicate the geometrical variation in vascular networks in the human body, which substantially influences disease progression; moreover, these techniques often involve multi-step fabrication procedures that hinder the high-throughput production necessary for pharmacological testing. This paper presents a bioprinting protocol for creating multiple vascular tissues with desired patterns and sizes directly on standard six-well plates, overcoming existing resolution and productivity challenges in bioprinting technology. A simplified fabrication approach was established to construct six hollow, perfusable channels within a hydrogel, which were subsequently lined with human umbilical vein endothelial cells to form a functional and mature endothelium. The computer-controlled nature of 3D bioprinting ensures high reproducibility and requires fewer manual fabrication steps than traditional methods. This highlights VOP's potential as an efficient high-throughput platform for modeling vascular permeability and advancing drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Bioimpressão automatizada para fabricação de modelos vasculares de alto rendimento

We present a protocol for high-throughput production of vascular channels with flexible sizes and desired patterns on a standard six-well plate using 3D bioprinting technology, referred to as vessels-on-a-plate (VOP). This platform has the potential to advance the development of therapeutics for the disorders associated with compromised endothelium.

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...