מחקר זה מומן על ידי NIH 1R01HL140239-01 ל- AMC. ברצוננו להודות למרכז להדמיית תאים באוניברסיטת דרקסל.

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו להדפסה ביולוגית של ספרואידים בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם לתרבות משותפת עם תאי אנדותל גם בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם. צעדי פרוטוקול קריטיים כוללים היווצרות ראשונית של ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC. יש לנקוט משנה זהירות בהאכלת ספירואידים אפיתל, שכן הם מופרעים בקלו?...

מודלים של גידולים במבחנה במבחנה הם כלים חיוניים למחקר מכני של צמיחת סרטן וגרורות. עבור סרטן השד בפרט, תאי אפיתל השד בתרבית Matrigel לארגן לתוך ספרואידים מקוטבים הדומים יותר לארכיטקטורה acinus ממארי in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. 3D תרבית תאי אפיתל השד משפיע גם על תפקוד התא, עם תרביות 3D מראה הבדלים אפנון קולטן אפידרמיס (EGF)8,9; פונקציית אונקוגן, כולל ErbB210; צמיחה ואפופטוזיס איתות11,12; והתנגדותכימותרפית 13,14. תאי אנדותל כלי דם מגיבים באופן דומה באופן שונה לגירויים סביבתיים בתלת מימד לעומת תרבות דו מימדית מסורתית15,16,17,18. עם זאת, רוב ההבנה של אינטראקציות אנדותל ושד כלי הדם אפיתל מגיע תרבות 2D באמצעות בינוני מותנה או Transwell מוסיף, או מודלים 3D שבו שני סוגי התאים מופרדים פיזית19,20,21,22,23. מודלים אלה של תרבות משותפת מספקים תובנה פיזיולוגית מוגבלת, שכן הן תרבות 3D והן מגע תאים הם קריטיים אנדותל כלי הדם – אינטראקציות תא אפיתל השד24,25,26.
מודלים סרטן 3D כבר מפוברק באמצעות מגוון רחב של טכניקות, כולל היווצרות ספירואיד טיפה תלויה, bioprinting, הרכבה מגנטית, ותרבות בתוך הידרוג'לים או על פיגומים מהונדסים5,27,28,29. לאחרונה, מודלים גידול 3D נוצרו עם סוגי תאים מרובים מסודרים במבנים 3D בהתאמה שלהם. בדוגמה אחת של פלטפורמת גידול על שבב, סרטן, אנדותל, תאים סטרומה היו מעורבבים לתוך מטריצה ולאחר מכן מוזרק לתוך שלושת תאי הרקמה המרכזיים במכשיר polydimethylsiloxane (PDMS). תאי הרקמה היו גובלים בשני ערוצים חוץים שייצגו עורק ונוזל. לאחר 5-7 ימים של תרבות, תאי אנדותל יצרו רשת microvascular ותאי סרטן התפשטו כדי ליצור גידולים קטנים ליד כלי הדם. פלטפורמה זו שימשה אז כדי לסנן סמים ושילובי סמים30. פלטפורמות נוספות לגידול על שבב נוצרו כדי לחקור גרורות וסוגי סרטן עם גירויים מכניים ספציפיים (למשל, זן מכני בריאה)31,32. עם זאת, פלטפורמות אלה בדרך כלל אינן כוללות הן כלי דם וסרטן במבנים 3D בהתאמה שלהם.
Biofabrication מראה הבטחה גדולה בקידום 3D במודלים גידולים במבחנה כלי דם, שכן הוא מאפשר שליטה מרחבית הדוקה על מיקום התא. למרות הצמיחה של bioprinting בעשור האחרון, מחקרים מעטים להתמקד במיוחד על גידולים33,34. בדוגמה אחת, הדפסה תלת מימדית של תאי HeLa בהידרוגל ג'לטין/אלגינט/פיברינוגן שימשה ליצירת מודל סרטן צוואר הרחם במבחנה. תאים סרטניים הודפסו ביולוגית כתאים בודדים ולאחר מכן הורשו ליצור ספרואידים, אשר הראו קצב התפשטות גבוה יותר, ביטוי מטאלופרוטאינאז מטריצה מוגברת, ו chemoresistance גבוה יותר מאשר תאים בתרבות 2D35. במחקרים אלה, כמו רבים אחרים36,37, השעיות תאים מנותקים הודפסו ביולוגית, ולאחר מכן תרביות התא סופקו עם רמזים מכניים וביוכימיים הנדרשים כדי לאפשר לתאים ליצור מבנה 3D. עם זאת, הרכבה עצמית תאית עשויה להימשך ימים או שבועות, עשויה לדרוש רמזים סביבתיים מרחביים וטמפורליים מורכבים, או לא להתרחש כאשר שני סוגי תאים הם תרבית משותפת. לדוגמה, תאי אפיתל השד גרמו למוות תאי בתאי אנדותל בתרבית דו-ממדית, ותאי אפיתל שד מנותקים לא נוצרו כדוריות תלת-ממדיות כאשר הודפסו ביולוגית באלגינאט/ג'לטין הידרוג'ל38. אפיתל שד מנותק או תאים סרטניים יצרו ספרואידים בביוינקים מבוססי אלגינט רק כאשר נלכדו בתבניות PDMS עגולות. במקרים אחרים, spheroids נוצרו באמצעות טיפות מושעה בלוחות באר עגולים מצורף אולטרה נמוך ולאחר מכן מעורבב לתוך bioinks מבוסס אלגינט39,40.
כעת אנו מתארים שיטה חלופית 3D רקמה biomanufacturing בפרוטוקול זה. במקום לזרוע תאים מנותקים ולחכות שתאים אלה ייצרו את המבנים תלת-ממדיים, אנו מתארים כיצד ליצור ולהדפיס ביולוגית ספרואידים של גידולים תלת-ממדיים ברשת צינור כלי דם כדי ליצור מודל תרבות-שיתוף גידולים שניתן להשתמש בו כמעט מיד. ניתן לגדל ספרואידים של גידולים במבחנה או להפיקם מרקמות אנושיות (אורגנואידים). באופן דומה, צינורות כלי דם ניתן לגדל או יכול להיגזר שברים microvascular רקמת שומן. Bioinks יכול לנוע בין אלגינט פעיל ביולוגית כדי Matrigel פעיל מאוד ביולוגית41. מאז מודל זה 3D גידול שיתוף תרבות יכול להיווצר עם מגוון רחב של מבני תאים bioinks, זה יכול לשלב סוגי תאים מרובים, מטריצות חוץ תאיות, ומדרגי כימוקין15,42. בעוד בניסוח הנוכחי שלה, רשתות אנדותל לא ניתן לחדור, איטרציות עתידיות יכול לשלב שיטה זו עם microfluids או על שבב מערכות. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל שד תלת מימדי על רשתות אנדותל מאפשרת ביופבריציה מהירה של מודלים של השד האנושי לבדיקות סמים ורפואה מדויקת מותאמת אישית27.

<table><tbody><tr><td>37&amp;deg;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Cell incubation</td></tr><tr><td>3D Bio printer</td><td>custom-made</td><td>None</td><td>Used for bioprinting</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>for seeding spheroids</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>bioprinting syringe needle</td></tr><tr><td>Absolute ethanol (200 proof )</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>reconsitution of media components</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&amp;prime;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>secondary block - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bovine insulin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blocking agent -Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Remove large or clustered spheroids</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;trade; Red CMTPX Dye</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>pre-stain for HUVEC tubes</td></tr><tr><td>Compact Centrifuge</td><td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td><td>Z206A</td><td>For cell centrifugations</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Conical tubes 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Collecting and resuspending cells</td></tr><tr><td>Countess II-FL Cell counter</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>counting cells</td></tr><tr><td>Glass pipettes (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>cell resuspension</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A basal media</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunofluorescence labelling component</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Nuclei stain immunofluorescence</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td><td>Cell applications, San Diego , CA</td><td>200-05f</td><td>Endothelial cell lines</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td></tr><tr><td>Live Dead assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal microscope</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Used to visualize cells</td></tr><tr><td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Spheroid formation</td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>cell fixative</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Wash buffer for cells before trypsinization</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immunofluorescence mountant medium</td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ assay media component</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Sterile syringe (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>bioprinting process</td></tr><tr><td>Tissue culture dish (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>monolayer cell culture</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>cell counter additive</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>cell detachment</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF&lt;sub&gt;165&lt;/sub&gt;)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tube additive</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cell imaging software</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compresser</td></tr></tbody></table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting מתגלה ככלי מבטיח לפברק מודלים של סרטן אנושי 3D כי טוב יותר לסכם סימני ההיכר הקריטיים של ארכיטקטורת רקמת vivo. בהדפסה ביולוגית של שחול שכבה אחר שכבה, תאים בודדים מובלטים בביו-ינק יחד עם רמזים מרחביים וטמפורליים מורכבים לקידום הרכבה עצמית של רקמות היררכיות. עם זאת, טכניקה זו biofabrication מסתמך על אינטראקציות מורכבות בין תאים, bioinks ורמזים ביוכימיים וביופיזיים. לכן, הרכבה עצמית עשויה להימשך ימים או אפילו שבועות, עשויה לדרוש bioinks ספציפי, ולא תמיד יכול להתרחש כאשר יש יותר מסוג תא אחד מעורב. לכן פיתחנו טכניקה להדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידים אפיתל שד תלת-ממדיים שנוצרו מראש במגוון ביו-לינקים. ספירואידים אפיתל שד 3D מעוצבים מראש קיימו את הכדאיות שלהם ואת הארכיטקטורה המקוטבת לאחר ההדפסה. בנוסף הדפסנו את הכדורואידים בתלת-ממד על רשתות תאי אנדותל של כלי הדם כדי ליצור מודל של תרבות משותפת. לכן, טכניקת ההדפסה הביולוגית החדשה יוצרת במהירות מודל שד אנושי תלת מימדי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בעלות נמוכה יותר ועם גמישות גבוהה יותר מאשר טכניקות הדפסה ביולוגית מסורתיות. טכניקת ביו-הדפסה רב-תכליתית זו ניתנת להדפסה כדי ליצור מודלים תלת-ממדיים של רקמות אחרות בביו-ינקים נוספים.

תאי אפיתל השד צריך להתארגן עצמית לתוך 3D spheroids לאחר 5-8 ימים של תרבות על פתרון מטריצה במדיום תרבות עם 2% פתרון מטריצה. כדורי אפיתל שאינם גידוליים של שד MCF10A צריכים להופיע עגולים ויש להם מרכז חלול, עם אינגרין α6 מקוטב לקצה החיצוני של הספרואיד(איור 1,inset מראה מרכזים חלולים). תאי אפית?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Views.  Drexel University. המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.

Video: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Cancer Research

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדפסה ביולוגית תלת-ממדית לייצור מהיר של רשתות כלי דם באמצעות כלי דם על צלחת

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in coronary arteries and impaired function of the blood-brain barrier. Existing fabrication techniques do not adequately replicate the geometrical variation in vascular networks in the human body, which substantially influences disease progression; moreover, these techniques often involve multi-step fabrication procedures that hinder the high-throughput production necessary for pharmacological testing. This paper presents a bioprinting protocol for creating multiple vascular tissues with desired patterns and sizes directly on standard six-well plates, overcoming existing resolution and productivity challenges in bioprinting technology. A simplified fabrication approach was established to construct six hollow, perfusable channels within a hydrogel, which were subsequently lined with human umbilical vein endothelial cells to form a functional and mature endothelium. The computer-controlled nature of 3D bioprinting ensures high reproducibility and requires fewer manual fabrication steps than traditional methods. This highlights VOP's potential as an efficient high-throughput platform for modeling vascular permeability and advancing drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: הדפסה ביולוגית אוטומטית לייצור מודלים וסקולריים בעלי תפוקה גבוהה

We present a protocol for high-throughput production of vascular channels with flexible sizes and desired patterns on a standard six-well plate using 3D bioprinting technology, referred to as vessels-on-a-plate (VOP). This platform has the potential to advance the development of therapeutics for the disorders associated with compromised endothelium.

שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...