Para pacientes diagnosticados com tumores sólidos de mama ou pâncreas, há uma forte correlação entre eventos de progressão da doença, como metástase ou resistência à terapia, e resultados ruins. Sabe-se que os mecanismos moleculares celulares que governam a homeostase e a fibrose tecidual também controlam a progressão do tumor sólido. Meu laboratório está interessado em entender esses mecanismos para que possamos desenvolver melhor terapias e medidas diagnósticas para ajudar os pacientes.
Um dos principais desafios experimentais é que há uma necessidade crítica de modelos 3D de câncer que possam capturar interações intercelulares durante processos fisiológicos e fisiopatológicos e, ao entender essas interações, insights adicionais sobre as doenças podem ser entendidos para desenvolver novas estratégias de tratamento. Nosso protocolo fornecerá um método de cultura de células 3D econômico e reprodutível que replica as características do microambiente do tecido in vivo. Nosso protocolo fornecerá métodos fáceis e rápidos de cultura de células 3D sem andaimes e baseados em andaimes nos quais podemos quantificar interações celulares heterogêneas.
Descobrimos uma maneira eficiente de formular culturas de esferóides 3D que podem ser usadas com modelos sem andaimes, mas também podem ser mescladas com sistemas baseados em andaimes para medir a invasão e o comportamento celular. Para começar, acenda a luz ultravioleta para higienizar o interior do gabinete de biossegurança por 15 minutos. Abra o caixilho da janela do gabinete de biossegurança para estabilizar o fluxo de ar e ligue o sistema de aspiração a vácuo.
Limpe a superfície interna do capô e a tubulação do sistema de aspiração a vácuo com etanol 70%. Aqueça o meio de cultura de células, PBS e 0,25% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius em um banho de contas. Agora, examine as células ao microscópio para confirmar 70 a 80% de confluência.
Usando um aspirador a vácuo, aspire e descarte o meio de cultura das células plaqueadas. Lave o meio restante uma vez com dois mililitros de PBS, aspire e descarte o PBS após a lavagem. Em seguida, usando uma micropipeta, adicione um mililitro de tripsina à placa de cultura de células e coloque a placa dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Agora, adicione um mililitro de inibidor de tripsina de soja em PBS à placa para inativar a tripsina. Para dispersar os aglomerados de células, pipetar a mistura líquida usando uma micropipeta P-1000. Recolher a suspensão celular do fundo da placa e transferi-la para um tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar o tubo a 100 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante com o aspirador de vácuo. Deixe as sondas fluorescentes moleculares aquecerem à temperatura ambiente por 15 minutos em um banho de esferas temperado a 37 graus Celsius. Usando uma micropipeta, ressuspenda as células em dois mililitros das respectivas soluções de mídia de corante rastreador de células em funcionamento.
Incube os tubos a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Após 30 minutos de incubação, centrifugar os tubos a 100 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, use um aspirador a vácuo para aspirar e descartar o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet completamente em um mililitro de DMEM contendo 10% FBS usando uma micropipeta. Agora, colete 10 microlitros da suspensão celular e transfira-os para um microtubo contendo um volume igual de azul de tripano. Depois de misturar as células, adicione 20 microlitros da solução de tripano celular a uma lâmina de câmara de contagem de células.
Insira o slide em um contador de células automatizado para determinar o número da célula. Calcule o número médio total de células vivas a partir de duas leituras. Preparar estoques de células de trabalho para cada tipo de célula em uma concentração de 6,67 vezes 10 elevado a três células por mililitro, equivalente a 2.000 células por 300 microlitros.
Usando uma micropipeta, transfira o volume necessário para três réplicas técnicas mais um extra para um microtubo. Depois de misturar bem com uma pipeta, transfira 300 microlitros da amostra para um poço de uma microplaca de 96 poços de fixação ultrabaixa em forma de U. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora a 37 graus Celsius.
Imagem do crescimento e morfologia do esferóide a cada 24 horas, até 96 horas, usando um microscópio de contraste de fase. Ligue os dispositivos de imagem e incubadora automatizada. Crie um novo protocolo de imagem no gerenciador de tarefas do software de imagem para capturar o crescimento de 48 horas de esferoides BT-474 co-cultivados com fibroblastos BJ-5ta e células endoteliais EA.hy926 coradas com os corantes rastreadores de células azuis, laranja e vermelho escuro, respectivamente.
Encha um balde de gelo com gelo para manter a solução de extrato da membrana basal fria e coloque a solução no gelo. Usando uma pipeta multicanal, aspire aproximadamente 170 microlitros de meio da placa de cultura. Obtenha uma lupa e uma mini caixa de luz para observar de perto os pequenos esferóides.
Coloque a placa esferóide de 96 poços sobre a caixa de luz e posicione a lupa acima da cabeça. Defina uma pipeta P-200 para 30 microlitros e colete o extrato da membrana basal para criar três microgotículas. Certifique-se de que a placa de 96 poços esteja plana e posicione a pipeta verticalmente acima do esferoide.
Agora, solte a gota sem tocar no fundo do poço. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, cubra os esferóides com mais 50 microlitros da solução de extrato de membrana basal por poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, usando uma micropipeta, adicione 100 microlitros de meio de cultura celular a cada poço. Às 72 horas após o plaqueamento, as células MCF-10A, MCF-10Ca1H e BT-474 co-cultivadas com EA.hy926 e THP-1 ou com BJ5-ta e THP-1 exibiram um aumento significativo na área esferoide em comparação com os esferoides epiteliais de monocultura. Em contraste, as células MDA-MB-468 co-cultivadas mostraram uma diminuição significativa na área esferóide em comparação com a monocultura.
A aplicação de corante rastreador celular a células epiteliais tumorigênicas BT-474 e células estromais antes do estabelecimento do esferóide demonstrou que as células estromais, incluindo EA.hy926 e BJ-5ta, formaram as estruturas de brotamento no perímetro dos esferoides centrais do BT-474. Às 24 horas após o plaqueamento, uma membrana basal foi sobreposta em células epiteliais tumorigênicas BT-474 co-cultivadas com células estromais, demonstrando a formação de estruturas invasivas.
