Questa ricerca è stata finanziata da NIH 1R01HL140239-01 ad AMC. Ringraziamo il Cell Imaging Center della Drexel University.

1. Crescita delle cellule epiteliali del seno e mezzi di dosaggio
<ol><li>Cellule epiteliali del seno MCF10A NOTA: La linea cellulare epiteliale del seno immortalato non tumorigenica è derivata da un paziente con malattia fibrocistica43. Le cellule non esprimono il recettore degli estrogeni.<ol>
<li>Per preparare 20 μg/mL di fattore di crescita epidermico (FEG), sciogliere 100 μg di FEG liofilizzato in 500 μL di dHsterile 2O per fare 200 μg/mL FEG. Aggiungere 500 μL di 200 μg/mL FEG in 4,5 mL di BSA sterile 0,1% in dH2O per fare una soluzione stock EGF da 20 μg/mL. Conservare le aliquote EGF da 20 μg/mL preparate a -20 °C per un massimo di 12 mesi.</li>
		<li>Per preparare 500 μg/mL idrocortisone, diluire 1 mg di idrocortisone in 1 mL di etanolo assoluto (dimostrazione 200). Aggiungere 1 mL di DMEM F:12 sterile a questa miscela per fare una soluzione di stock di idrocortisone da 500 μg/mL. Conservare le aliquote di stock di idrocortisone a -80 °C per un massimo di 12 mesi.</li>
		<li>Per preparare una tossina colera da 10 μg/mL, sciogliere 1 mg di polvere liofilizzata di tossine colera in 1 mL di dH2O sterile per fare una soluzione di 1 mg/mL di stock di tossine colera. Conservare le aliquote delle scorte di tossina colera a -80 °C per un massimo di 12 mesi.</li>
		<li>Per preparare il terreno di crescita, aggiungere 500 μL di EGF (20 μg/mL), 500 μL di idrocortisone (500 μg/mL), 5 μL di tossina colera (1 mg/mL), 500 μL di insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL di penicillina e streptomicina, e da 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM F:12 per una concentrazione finale di 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL idrocortisone, 10 ng/mL tossina colera, 10 ng/mL di insulina bovina, 2% di penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v. La concentrazione di antibiotici è stata aumentata al 2% per tenere conto della diminuzione della sterilità nel processo di biostamgrafia; tuttavia, la concentrazione di antibiotici può essere abbassata all'1%.</li>
		<li>Per preparare il mezzo di dosaggio, aggiungere 500 μL di idrocortisone (500 μg/mL), 5 μL di tossina colera (1 mg/mL), 500 μL di insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL di penicillina e streptomicina, e da 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM F:12 per una concentrazione finale di idrocortisone da 500 ng/mL, tossina colera 10 ng/mL, insulina bovina 10 ng/mL, 2% v/v penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOTA: La linea cellulare epiteliale del cancro al seno tripla-negativa (priva di recettore degli estrogeni, recettore del progesterone e recettore del fattore di crescita epidermico 2) è creata dall'effusione pleurica di una paziente con adenocarcinoma mammario metastatico44. Le cellule rappresentano un cancro al seno aggressivo, invasivo e scarsamente differenziato.<ol>
<li>Per preparare il terreno di crescita e di dosaggio, aggiungere 50 mL di siero bovino fetale, 10 mL di penicillina e streptomicina e 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM per una concentrazione finale 10% v/v siero bovino fetale, 2% v/v penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coltura cellulare epiteliale del seno
<ol><li>Semina 500.000 cellule MCF10A o MDA-MB-231 in un piatto di coltura tissutale da 10 cm (P100) con 10 mL di supporti di crescita MCF10A o MDA-MB-231. Le celle MCF10A e MDA-MB-231 raggiungono la confluenza del 90% in 48 ore.</li>
	<li>Per passare le cellule epiteliali del seno, lavare prima le cellule con 10 mL di PBS caldo.</li>
	<li>Staccare le cellule epiteliali del seno aggiungendo 2 mL dello 0,05% di tripina-EDTA al piatto. Mettere il piatto in un incubatore di CO2 da 37 °C per 20-25 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium alle celle tripsinziate per neutralizzare la tripina. Pipettare la miscela cella-supporto su e giù per rimospendare le cellule e rompere i cluster di celle.</li>
	<li>Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium.</li>
	<li>Piatto 1 mL di sospensione cellulare in 5 nuovi piatti di coltura tissutale da 10 cm insieme a MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium. Posizionare i piatti in un incubatore di CO 2 a 37 °C,5%. Le cellule saranno pronte per essere di nuovo passaggio in 2-3 giorni. Le cellule MCF10A possono essere mantenute al passaggio numero 35, dopo di che mostrano cambiamenti morfologici. Le cellule MDA-MB-231 possono essere mantenute al passaggio numero 24, dopo di che mostrano cambiamenti morfologici.</li>
</ol>3. Formazione epiteliale dello sferoide del seno
<ol><li>Congelare le punte della pipetta da 200 μL per 30 minuti prima di iniziare il saggio. Mantenere la soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita (ad esempio Matrigel) (10 mg/mL) sul ghiaccio per l'intero processo.</li>
	<li>Pipettare lentamente 30 μL di soluzione a matrice ghiacciata utilizzando punte di pipetta ghiacciate da 200 μL in ogni pozzo di uno scivolo a camera da 8 pozzi. Iniziare dai lati e trascinare la punta della pipetta lungo gli angoli, aggiungendo una goccia finale al centro del pozzo per garantire un rivestimento uniforme di ogni pozzo. Evitare bolle d'aria durante questo passaggio per garantire uno strato di soluzione a matrice uniforme. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare i vetrini della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C per 15-20 minuti per polimerizzare la soluzione matriciale.</li>
	<li>Cellule MCF10A risuspend tripsinziate in MCF10A Assay Medium a 200.000 celle/mL o cellule MDA-MB-231 risospese in MDA-MB-231 Growth Medium a 200.000 celle/mL.</li>
	<li>Se si utilizzano cellule MCF10A, preparare un mezzo di crescita sferoide MCF10A fresco aggiungendo 5 μL di EGF (20 μg/mL) e 100 μL di soluzione matriciale a 5 mL di mezzo di dosaggio per una concentrazione finale di soluzione a matrice del 2%.</li>
	<li>Rimuovere lo scivolo della camera prerivestito con soluzione a matrice dall'incubatore. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare MCF10A o MDA-MB-231 (10.000 celle) a ciascun pozzo. Se si utilizzano cellule MCF10A, aggiungere 450 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium. Se si utilizzano celle MDA-MB-231, aggiungere 450 μL di MDA-MB-231 Growth Medium premiscelato con soluzione a matrice del 2% (9 μL). Posizionare immediatamente lo scivolo della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C, al 5%.</li>
	<li>Sostituire il mezzo ogni 4 quattro giorni. Pipettare con cura 200 μL di vecchi supporti da un angolo di ciascun pozzo utilizzando una punta di pipetta da 200 μL. Durante questo processo, inclinare lo scivolo della camera a 45° per assicurarsi che gli sferoidi non siano disturbati. Aggiungere 200 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium appena preparato o MDA-MB-231 Growth Medium precedentemente miscelato con soluzione a matrice del 2% ad ogni pozzo all'angolo in gocce per garantire che gli sferoidi rimangano attaccati allo strato della matrice. Solo circa il 50% del supporto viene sostituito in modo che tutte le citochine prodotte dagli sferoidi non siano completamente esaurite. NOTA: Gli sferoidi epiteliali del seno MCF10A ci tano fino a 8 giorni per polarizzare e formare centri cavi. Gli sferoidi epiteliali del seno MDA-MB-231 richiedere fino a 5 giorni per formarsi e non hanno centri cavi.</li>
</ol>4. Formazione della rete cellulare endoteliale
<ol><li>Cultura della cellula endoteliale della vena ombelicale umana (HUVEC)<ol>
<li>Aggiungere il contenuto di un singolo kit di crescita endoteliale medium-2 contenente fattore di crescita dell'insulina, fattore di crescita dei fibroblasti, fattore di crescita endoteliale vascolare, acido ascorbico, fattore di crescita epidermico, eparina e gentamicina-ampotericina B, insieme a 50 mL di siero bovino fetale, 5 mL penicillina-streptomicina e 5 mL di glutammina da 200 mM a 500 mL di Basale Medio-2 Endoteliale (EBM-2) per creare un mezzo di crescita endoteliale completo (EGM-2).</li>
		<li>Semina 500.000 cellule endoteliali in un piatto di coltura tissutale di 10 cm in 10 mL di EGM-2. Posizionare le cellule in un incubatore di CO2 da 37 °C, 5% fino a raggiungere la confluenza >80% (circa 48 ore).</li>
		<li>Per passare le cellule, lavare le cellule endoteliali con 10 mL di PBS caldo. Staccare HUVEC aggiungendo 2 mL dello 0,05% di Tripina-EDTA al piatto di coltura tissutale da 10 cm. Monitorare da vicino le cellule mediante microscopia a contrasto di fase. Le cellule sono pronte quando vengono ballate verso l'alto ma rimangono attaccate al piatto.</li>
		<li>Aspirare con cura la triptina dal piatto. Aggiungere 8 mL di EGM-2 al piatto. Lavare le celle dal piatto pipettando l'EGM-2 su e giù su tutta la superficie del piatto.</li>
		<li>In alternativa, aggiungere 5 mL di EGM-2 alle cellule tripsinziate per neutralizzare la tripside. Pipettare la miscela cella-supporto su e giù per rimospendare le cellule e rompere i cluster di celle. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 mL di EGM-2.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a 9 mL di EGM-2 in un piatto di coltura tissutale da 10 cm. Posizionare i piatti in un incubatore di CO 2 a 37 °C,5%. Scambia 2/3 del mezzo con EGM-2 fresco ogni 2 giorni. Le cellule saranno pronte per il passaggio in 3-5 giorni. HUVEC può essere mantenuto fino al passaggio 8 dopo di che non riescono a formare reti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formazione di rete huvec (Endothelial Cell)</li>
	<li>Congelare le punte della pipetta da 200 μL per 30 minuti prima di iniziare il saggio. Mantenere la soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita (10 mg/mL) sul ghiaccio per l'intero processo.</li>
	<li>Pipettare lentamente 30 μL di soluzione a matrice ghiacciata utilizzando punte di pipetta ghiacciate da 200 μL in ogni pozzo di uno scivolo a camera da 8 pozzi. Iniziare dai lati e trascinare la punta della pipetta lungo gli angoli, aggiungendo una goccia finale al centro del pozzo per garantire un rivestimento uniforme di ogni pozzo. Evitare bolle d'aria durante questo passaggio per garantire uno strato di soluzione a matrice uniforme. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare gli scivoli della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C per 15-20 minuti per polimerizzare Matrigel.<ol>
<li>Pre-macchiare un piatto di 10 cm di HUVEC con 10 μL di tracker di globuli rossi (1:1000) per 30 minuti in 37 °C, 5% di incubatrice di CO2.</li>
		<li>Lavare le cellule endoteliali con 10 mL di PBS caldo. Staccare HUVEC aggiungendo 2 mL dello 0,05% di Tripina-EDTA al piatto di coltura tissutale da 10 cm. Mettere il piatto in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 5 minuti per staccare completamente le cellule.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di EGM-2 al piatto per neutralizzare la tripina. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo conico da 25 ml. Centrifuga HUVEC a 1.200 x g per 5 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di EBM-2 senza siero.</li>
		<li>Contare le celle usando Trypan blue per determinare le celle vitali. Creare una soluzione a 1 x10 6 celle/mL.</li>
		<li>Aggiungere 100.000 HUVEC ad ogni pozzo con 200 μL di EBM-2 senza siero. Se vengono aggiunte più celle, creeranno un monostrato di superficie piuttosto che una rete di tubi.</li>
		<li>Incubare HUVEC in un incubatore di 37 °C, 5% CO2. Dopo 6 ore, immagine reti HUVEC per microscopia a contrasto di fase. Le reti sono ora pronte per la cocultura con sferoidi del seno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biostampa Sferoidi epiteliali del seno su reti HUVEC pre-formate
NOTA: Per il processo di biofabbricazione deve essere utilizzato un sistema di biodeposizione a doppio ugello. In questo caso, il sistema aveva tre bracci di movimento per consentire il controllo spaziale su scala micron della deposizione del materiale e due motori azionati a vite per depositare bioink da siringhe da 10 ml. Il sistema deve essere funzionalizzato con un sistema di filtrazione dell'aria di particolato ad alta efficienza e capacità di sterilizzazione UV per mantenere un ambiente sterile durante la biostampa. Il biostampatore viene sterilizzato ai raggi UV per un'ora prima del processo di stampa.
<ol><li>Creare sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC come descritto in precedenza. Stimare il numero di sferoidi epiteliali del seno in ogni pozzo contando gli sferoidi nelle immagini rappresentative della microscopia a contrasto di fase.</li>
	<li>Tagliare 0,5 cm dall'estremità di una punta della pipetta da 1000 μL. Utilizzare la punta della pipetta tagliata per pipettare con cura tutti gli sferoidi fuori dal vetrino da camera a 8 pozza e in un tubo da 50 ml. Sferoidi resuspendi nel bioink selezionato a 100 sferoidi/100 μL. NOTA: Concentrazioni più elevate di sferoidi possono causare il clustering degli sferoidi e impedire la visualizzazione delle interazioni tra gli sferoidi e le reti endoteliali.</li>
	<li>Passare la miscela di sferoidi attraverso un colino cellulare da 70 μm per rimuovere eventuali sferoidi grandi o raggruppati.</li>
	<li>Caricare gli sferoidi raggruppati in una siringa sterile da 10 ml e cappuccio con un ago sterile calibro 25. Attaccare la siringa al sistema di bio-deposizione.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dalle reti HUVEC nello scivolo da camera a 8 pozzi.</li>
	<li>Estrudere 100 μL di sferoidi epiteliali del seno su 6 pozzi di reti HUVEC ad una portata di 1 mL/min. Mantenere 2 pozzi di reti HUVEC come controlli.</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium se si utilizzano sferoidi MCF10A stampati su reti HUVEC o aggiungere 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium precedentemente miscelato con soluzione a matrice del 2% se si utilizzano sferoidi MDA-MB-231 stampati su reti HUVEC. Il rispettivo mezzo di crescita dello sferoide deve essere utilizzato nei pozzi di controllo HUVEC.</li>
	<li>Incubare le co-colture in un incubatore di CO2 a 37 °C, 5% per 24 - 96 ore senza un cambiamento mediatico. Le co-culture rimarranno vitali nel mezzo originale per un massimo di quattro giorni.</li>
</ol>6. Microscopia confocale
<ol><li>Immunofluorescenza e preparazione tampone lavaggio PBS-glicina<ol>
<li>Preparare la soluzione tampone di immunofluorescenza (IF) 10x aggiungendo 2,5 g di azide di sodio, 5 g di albumina di siero bovino, 10 mL di Tritone X-100 e 2,05 mL di Tween-20 in 500 mL di 10x PBS. Regolare il pH a 7,4. Conservare la soluzione stock fino a un anno a 4 °C per evitare la sedimentazione.</li>
		<li>Creare un tampone IF funzionante diluire 50 mL di tampone IF 10x in 450 mL di acqua deionizzata sterile. Conservare la soluzione di lavoro a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.</li>
		<li>Preparare 10x soluzione di scorta tampone PBS-Glicina aggiungendo 37,5 g di glicina a 500 mL di 10x PBS. Regolare il pH a 7,4. Conservare la soluzione stock fino a 6 mesi a 4 °C per evitare la sedimentazione.</li>
		<li>Creare una soluzione pbs-glicina funzionante diluire 50 mL di tampone PBS-Glicina 10x in 450 mL di acqua deionizzata sterile. Conservare la soluzione di lavoro a 4 °C per un massimo di una settimana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etichetta campioni biostampati e immagine per microscopia confocale<ol>
<li>Aspirare il mezzo dalle co-colture 3D biostampate e risciacquare 3 volte con PBS caldo. Fissare co-colture 3D biostampate con paraformaldeide al 4% per 1 h a temperatura ambiente. Risciacquare i campioni 3 volte per 20 minuti con 1 pbs-glicina.</li>
		<li>Blocca i campioni con tampone IF mescolato con il 10% di siero di capra per 90 minuti (blocco primario), seguito da 40 minuti con buffer IF più il 10% di siero di capra e frammento affinipure fab (1:100, blocco secondario).</li>
		<li>Se si utilizzano sferoidi MCF10A, etichettare campioni con un anticorpo primario per l'integrina α6 (1:100) in tampone di blocco secondario durante la notte a 4 °C, seguiti da un anticorpo secondario Alexa Fluor 488 (1:200) e Hoescht 33342 (1:1000) per 1 h a temperatura ambiente protetto dalla luce. Le linee cellulari MCF10A esprimono alti livelli di integrina α6, che è essenziale per mostrare polarizzazione e morfologia dello sferoide.</li>
		<li>Se si utilizzano sferoidi MDA-MB-231, che esprimono bassi livelli di integrina α6, etichettare i campioni con Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) e Hoescht 33342 (1:1000) nel buffer di blocco secondario per 4 ore a temperatura ambiente protetta dalla luce. La phalloidina consente la visualizzazione del filamento di actina in modo da poter valutare la morfologia amorfa e invasiva dello sferoide.</li>
		<li>Lavare i campioni con 1X PBS-glicina 3 volte per 20 minuti.</li>
		<li>Preparare i campioni per il montaggio rimuovendo lo scivolo della camera utilizzando lo strumento del produttore. Aggiungere una piccola goccia di soluzione antifade ad ogni pozzo. Posizionare un coverslip da 22 mm x 60 mm su ogni scivolo della camera e sigillare accuratamente i bordi con smalto chiaro.</li>
		<li>Campioni di immagini che utilizzano un microscopio confocale come pile Z di ~10 fette in passaggi da 5 μm. Se lo si desidera, comprimere i piani Z in un singolo piano utilizzando il comando Messa a fuoco estesa nel software di imaging cellulare.</li>
		<li>Quantificare l'adesione dello sferoide alle reti endoteliali usando Image J. Il numero di sferoidi aderenti può essere quantificato utilizzando il plugin di analisi con la dimensione e la circolarità delle particelle appropriate. Normalizzare il numero di sferoidi collegati all'area dell'immagine.</li>
		<li>Per garantire la riproducibilità, quantificare il numero di sferoidi aderenti in 4 x 4 immagini piastrellate di co-culture. Se il numero di sferoidi è statisticamente significativamente inferiore rispetto ad altri esperimenti, l'esperimento deve essere ripetuto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è il primo del suo genere a biostampare sferoidi nella loro architettura 3D per la co-coltura con cellule endoteliali anche nella loro architettura 3D. I passaggi critici del protocollo includono la formazione iniziale di sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC. Estrema cautela deve essere presa nell'alimentazione degli sferoidi epiteliali del seno, in quanto sono facilmente interrotti dalla soluzione matriciale. Allo stesso modo, gli sferoidi epiteliali del seno devono essere trattati con cura quand...

I modelli tumorali vascolarizzati in vitro 3D sono strumenti essenziali per lo studio meccanicistico della crescita e della metastasi del cancro. Per il cancro al seno in particolare, le cellule epiteliali del seno coltivate a Matrigel si organizzano in sferoidi polarizzati che assomigliano più da vicino all'architettura in vivo dell'acinomammario 1,2,3,4,5,6,7,8. La coltura cellulare epiteliale del seno 3D influisce anche sulla funzione cellulare, con colture 3D che mostrano differenze nella modulazione del recettore del fattore di crescita epidermica (EGF)8,9; funzione oncogene, compreso ErbB210; crescita e apoptosi segnalando11,12; e resistenza allachemioterapia 13,14. Le cellule endoteliali vascolari rispondono in modo diverso agli stimoli ambientali in 3D rispetto alla coltura 2Dtradizionale 15,16,17,18. Tuttavia, gran parte della comprensione delle interazioni endoteliali vascolari e epiteliali del seno proviene da coltura 2D utilizzando inserti condizionati di mezzo o Transwell, o modelli 3D in cui i due tipi di cellule sono fisicamenteseparati 19,20,21,22,23. Questi modelli di co-coltura forniscono una visione fisiologica limitata, poiché sia la coltura 3D che il contatto cellulare-cellulare sono fondamentali per le interazioni endoteliali vascolari - cellule epiteliali del seno24,25,26.
I modelli di cancro 3D sono stati fabbricati utilizzando una varietà di tecniche, tra cui la formazione di sferoidi a goccia appesa, la biostamce, l'assemblaggio magnetico e la coltura all'interno di idrogel osu impalcature ingegnerizzate 5,27,28,29. Più recentemente, i modelli di tumore 3D sono stati creati con più tipi di cellule disposte nelle rispettive strutture 3D. In un esempio di piattaforma tumorale su chip, il cancro, le cellule endoteliali e stromali sono state mescolate in una matrice e quindi iniettate nelle tre camere del tessuto centrale in un dispositivo polidimetilossano (PDMS). Le camere tissutali erano delimitate da due canali esterni che rappresentavano un'arteria e una venula. Dopo 5-7 giorni di coltura, le cellule endoteliali formarono una rete microvascolare e le cellule tumorali proliferarono per formare piccoli tumori vicino alla vascolarizzazione. Questa piattaforma è stata quindi utilizzata per migliorare le combinazioni di farmacie farmaci 30. Ulteriori piattaforme tumorali su chip sono state create per studiare metastasi e tipi di cancro con stimoli meccanici specifici (ad esempio, ceppo meccanico nel polmone)31,32. Tuttavia, queste piattaforme generalmente non includono sia la vascucolatura che il cancro nelle rispettive strutture 3D.
La biofabbricazione mostra grandi promesse nell'avanzamento dei modelli di tumore vascolarizzato 3D in vitro, poiché consente uno stretto controllo spaziale sulla posizione delle cellule. Nonostante la crescita della biostampa nell'ultimo decennio, pochi studi si concentrano specificamente sui tumori33,34. In un esempio, la stampa 3D di cellule HeLa in un idrogel gelatinoso/alginato/fibrinogeno è stata utilizzata per creare un modello di cancro cervicale in vitro. Le cellule tumorali sono state biostampate come singole cellule e quindi hanno permesso di formare sferoidi, che hanno mostrato un più alto tasso di proliferazione, un aumento dell'espressione metalloproteinasi della matrice e una maggiore chemioresistenza rispetto alle cellule nella coltura 2D35. In questi studi, come in molti altri36,37, le sospensioni cellulari dissociate sono state biostampate, e poi alle colture cellulari sono stati forniti i segnali meccanici e biochimici necessari per consentire alle cellule di formare una struttura 3D. Tuttavia, l'auto-assemblaggio cellulare può richiedere giorni o settimane, può richiedere segnali ambientali spaziali e temporali complessi o non può verificarsi quando due tipi di cellule sono co-coltivati. Ad esempio, le cellule epiteliali del seno hanno indotto la morte cellulare nelle cellule endoteliali in co-coltura 2D e le cellule epiteliali del seno dissociate non hanno formato sferoidi 3D quando biostampate in idrogel di alginato / gelatina38. Le cellule epiteliali o tumorali del seno dissociate formavano sferoidi in bioinchiostri a base di alginato solo quando intrappolati in stampi PDMS circolari. In altri casi, gli sferoidi sono stati formati utilizzando goccioline sospese in piastre circolari ad attacco ultra-basso e quindi mescolati in bioinchiostri a base di alginato39,40.
In questo protocollo descriviamo ora un metodo alternativo di biofabbricazione dei tessuti 3D. Piuttosto che seminare cellule dissociate e aspettare che queste cellule formino le strutture 3D, descriviamo come creare e biostampare sferoidi tumorali 3D su una rete di tubi vascolari per creare un modello di co-coltura tumorale che può essere utilizzato quasi immediatamente. Gli sferoidi tumorali possono essere coltivati in vitro o derivati da tessuti umani (organoidi). Allo stesso modo, i tubi vascolari possono essere coltivati o possono essere derivati da frammenti microvascolari del tessuto adiposo. I bioinchiaci possono variare dall'alginato biologicamente inattivo al Matrigel41 altamente biologicamente attivo. Poiché questo modello di co-coltura tumorale 3D può essere creato con una varietà di strutture cellulari e bioinchiostri, può incorporare più tipi di cellule, matrici extracellulari e gradienti di chemiochina15,42. Mentre nella sua formulazione attuale, le reti endoteliali non possono essere perfuse, le iterazioni future potrebbero integrare questo metodo con microfluidi o sistemi -on-chip. La biostampa di sferoidi epiteliali del seno 3D su reti endoteliali consente una rapida biofabbricazione dei modelli mammari umani per il test dei farmaci e la medicina diprecisione personalizzata 27.

<table><tbody><tr><td>37&amp;deg;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Cell incubation</td></tr><tr><td>3D Bio printer</td><td>custom-made</td><td>None</td><td>Used for bioprinting</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>for seeding spheroids</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>bioprinting syringe needle</td></tr><tr><td>Absolute ethanol (200 proof )</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>reconsitution of media components</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&amp;prime;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>secondary block - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bovine insulin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blocking agent -Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Remove large or clustered spheroids</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;trade; Red CMTPX Dye</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>pre-stain for HUVEC tubes</td></tr><tr><td>Compact Centrifuge</td><td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td><td>Z206A</td><td>For cell centrifugations</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Conical tubes 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Collecting and resuspending cells</td></tr><tr><td>Countess II-FL Cell counter</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>counting cells</td></tr><tr><td>Glass pipettes (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>cell resuspension</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A basal media</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunofluorescence labelling component</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Nuclei stain immunofluorescence</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td><td>Cell applications, San Diego , CA</td><td>200-05f</td><td>Endothelial cell lines</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td></tr><tr><td>Live Dead assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal microscope</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Used to visualize cells</td></tr><tr><td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Spheroid formation</td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>cell fixative</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Wash buffer for cells before trypsinization</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immunofluorescence mountant medium</td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ assay media component</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Sterile syringe (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>bioprinting process</td></tr><tr><td>Tissue culture dish (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>monolayer cell culture</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>cell counter additive</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>cell detachment</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF&lt;sub&gt;165&lt;/sub&gt;)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tube additive</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cell imaging software</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compresser</td></tr></tbody></table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

La biostampa sta emergendo come uno strumento promettente per fabbricare modelli di cancro umano 3D che ricapitolano meglio i tratti distintivi critici dell'architettura tissutale in vivo. Nell'attuale biostamma di estrusione strato per strato, le singole cellule vengono estruse in un bioink insieme a complessi segnali spaziali e temporali per promuovere l'auto-assemblaggio gerarchico dei tessuti. Tuttavia, questa tecnica di biofabbricazione si basa su interazioni complesse tra cellule, bioinchiostri e segnali biochimici e biofisici. Pertanto, l'auto-assemblaggio può richiedere giorni o addirittura settimane, può richiedere bioinchiostri specifici e potrebbe non verificarsi sempre quando è coinvolto più di un tipo di cellula. Abbiamo quindi sviluppato una tecnica per biostampare direttamente sferoidi epiteliali del seno 3D pre-formati in una varietà di bioinchiostri. Gli sferoidi epiteliali del seno 3D prestampati biostampati hanno sostenuto la loro vitalità e l'architettura polarizzata dopo la stampa. Abbiamo inoltre stampato gli sferoidi 3D su reti cellulari endoteliali vascolari per creare un modello di co-coltura. Pertanto, la nuova tecnica di biostamgrafia crea rapidamente un modello di seno umano 3D più fisiologicamente rilevante a costi inferiori e con una maggiore flessibilità rispetto alle tradizionali tecniche di biostamgrafia. Questa versatile tecnica di biostamce può essere estrapolata per creare modelli 3D di altri tessuti in bioinchiostri aggiuntivi.

Le cellule epiteliali del seno dovrebbero auto-organizzarsi in sferoidi 3D dopo 5-8 giorni di coltura su soluzione matriciale e in mezzo di coltura con soluzione matriciale al 2%. Gli sferoidi epiteliali al seno MCF10A non cancerogeni dovrebbero apparire rotondi e avere un centro cavo, con l'integrina α6 polarizzata al bordo esterno dello sferoide(Figura 1, l'interno mostra centri cavi). Le cellule epiteliali del cancro al seno MDA-MB-231 altamente invasive formano sferoidi irregolari. Gli ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K Views.  Drexel University. L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Video: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioingegneria

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

Fabbricazione di lembi vascolari ingegnerizzati utilizzando tecnologie di stampa 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bioprinting 3D per la fabbricazione rapida di reti vascolari utilizzando vasi su piastra

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in coronary arteries and impaired function of the blood-brain barrier. Existing fabrication techniques do not adequately replicate the geometrical variation in vascular networks in the human body, which substantially influences disease progression; moreover, these techniques often involve multi-step fabrication procedures that hinder the high-throughput production necessary for pharmacological testing. This paper presents a bioprinting protocol for creating multiple vascular tissues with desired patterns and sizes directly on standard six-well plates, overcoming existing resolution and productivity challenges in bioprinting technology. A simplified fabrication approach was established to construct six hollow, perfusable channels within a hydrogel, which were subsequently lined with human umbilical vein endothelial cells to form a functional and mature endothelium. The computer-controlled nature of 3D bioprinting ensures high reproducibility and requires fewer manual fabrication steps than traditional methods. This highlights VOP's potential as an efficient high-throughput platform for modeling vascular permeability and advancing drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Bioprinting automatizzato per la fabbricazione di modelli vascolari ad alta produttività

We present a protocol for high-throughput production of vascular channels with flexible sizes and desired patterns on a standard six-well plate using 3D bioprinting technology, referred to as vessels-on-a-plate (VOP). This platform has the potential to advance the development of therapeutics for the disorders associated with compromised endothelium.

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...