Este protocolo demonstra que é possível incutir material de pesquisa sobre a traqueia de filhotes de ratos neonatais, de cinco dias de idade, por visualização direta. Este método melhora a confiabilidade da administração de material de pesquisa ou droga na traqueia por visualização direta. Ao evitar a injeção na traqueia, este método reduz a dor e, mais importante, o sangramento na traqueia, permitindo uma melhor sobrevida.
O desenvolvimento de habilidades finas é necessário para realizar este protocolo, incluindo posicionamento adequado do animal, uso correto do autoscópio operacional para visualizar as cordas vocais e eficácia da administração nos pulmões. Demonstrando o procedimento estarão Tara Sudhadevi, pós-doutoranda do meu laboratório, e Alison Ha, uma estudante de pós-graduação. Antes de iniciar o experimento, confirme a perda do reflexo da cauda e do pedal em um filhote de rato de cinco dias de idade anestesiado e use fita de rotulagem de laboratório para conter o filhote na posição supina em uma plataforma plana inclinada a 45 graus.
Use fórceps contundentes para puxar suavemente a língua para um lado, e com a ajuda de um especulo otoscópio de dois milímetros de diâmetro, segure suavemente a língua no lugar para que a laringe seja visível. Usando o otoscópio operacional com o espéculo de tamanho correto, localize as cordas vocais através da lente de ampliação do otoscópio. Para instillação intratracheal, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma ponta de pipeta de longo ângulo e carregamento de gel com 0,9 centímetros cúbicos de ar, seguida por 30 a 50 microlitros da substância de interesse.
Dobre a ponta da pipeta para um ângulo de 30 graus e insira a ponta de pipeta carregada através do espéculo para cerca de dois milímetros além das cordas vocais. Empurre o pistão da seringa para administrar a substância de interesse e o ar através do espéculo nas cordas vocais. Quando toda a substância tiver sido entregue, coloque o filhote em uma almofada de aquecimento de fluido circulante integrado de 38 graus Celsius com monitoramento até a respiração regular, antes de reunir o filhote com a represa.
Para avaliar a distribuição da substância dentro de uma amostra de tecido pulmonar, limpe o tórax e o abdômen dos filhotes de rato eutanizados com álcool etílico de 70% e use técnica estéril para remover os pulmões de acordo com protocolos padrão para sua avaliação visual. Neste estudo, a eficácia da técnica de instilação intra-traqueal foi avaliada pelo exame visual do tecido pulmonar coletado de um filhote de rato de cinco dias de idade instilado com corante azul Evans. A instilação foi quase 100% eficiente, pois o corante se espalhou para o pulmão imediatamente após a administração e distribuído por todos os lóbulos do tecido pulmonar.
O corante não foi observado dentro de nenhum tecido fora dos pulmões, confirmando a capacidade da técnica de ser utilizada para a entrega seletiva de um terapêutico de interesse para os pulmões. Colocar o animal inicialmente no ângulo correto sobre uma superfície firme é essencial para o sucesso do próximo passo de visualização das cordas vocais usando o autosscópio operacional.
