Name: instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research
Uploaded: 2015-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
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O protocolo seguinte descreve um sistema que funciona bem em 20-35 g ratinhos. O método pode ser facilmente adaptável a ratinhos maiores ou menores simplesmente mudando o tamanho do cateter. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Johns Hopkins University Animal Care e Use. 1. A instilação pulmonar <ol><li> Selecione um comercial de uma polegada de comprimento 20 g cânula intravenosa usar para a intubação. </li><li> Modificar a ponta do cateter dobra-lo manualmente para gerar uma ligeira curvatura na ponta como ilustrado na Figura 1. </li><li> Anestesiar o rato com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), injectada IP, e confirmar a anestesia pela ausência do reflexo do movimento. Aplicar pomada veterinária sobre os olhos imediatamente após a anestesia. Imediatamente após a anestesia aplicar pomada veterinária sobre os olhos e dar carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia pós-operatória e instilação. </li><li> Coloque o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma inclinada. Como mostrado na Figura 2, uma grande ligante escritório com laçadas da sutura gravado em funciona perfeitamente bem. </li><li> Raspar a parte ventral do pescoço e limpar e desinfectar a área do pescoço com álcool 70%. Com as novas luvas de latex e gratuitos a pó, usar instrumentos cirúrgicos desinfetados com álcool a 70%. </li><li> Usando uma tesoura afiada fazer uma pequena incisão cirúrgica no pescoço aproximadamente 12 mm abaixo do incisivo inferior. </li><li> Com uma pinça puxe a pele no pescoço caudalmente até que a parede da traqueia ventral pode ser visto. </li><li> Suavemente retrair a lingueta e inserir a cânula com a ponta dobrada inclinada para a superfície ventral do rato. Como em 1.4, puxe suavemente sobre a pele no pescoço, e inserir a cânula na traquéia. NOTA: Com um pouco de prática, o cateter será visível se movendo para baixo na traquéia. Se ele vai no esófago, então não haverá nenhuma observação visual do movimento do cateter. Não há incisõessão feitos na traqueia. </li><li> Uma vez que o cateter é visto na traqueia no pescoço, avançada que cerca de 5 mm a ser transmitido de forma fiável as cordas vocais, mas ainda bem acima da carina. </li><li> Prepare-se para incutir até 50 l de líquido injectando através do cateter com uma pipeta de ponta de carga gel. Coloque a ponta no hub luer, mas antes de injetar olhar cuidadosamente para observar o movimento do fluido na ponta síncrona com a respiração do mouse. Em seguida, injetar o instilado. </li><li> Com uma seringa de 1 ml, imediatamente fazer uma relativamente rápida inflação de 0,6 ml de ar para os pulmões através do cateter para ajudar a distribuir o líquido no fundo dos pulmões. Remover a cânula. </li><li> Remover a cânula. </li><li> Use uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para fechar a pequena ferida cirúrgica, conforme as instruções bula para Vetbond. Coloque os ratos em gaiolas individuais e monitorá-los visualmente até que acordem e se comportar normalmente, sem qualquer indicação de discomfort. </li></ol> 2. Fixação Lung NOTA: Uma vez que todos os procedimentos experimentais são feitas em um rato, os pulmões pode ser preparado para o processamento histológico pela fixação com formaldeído (ou qualquer outro fixador desejado). <ol><li> Sacrifique o mouse com um procedimento IACUC aceitável. Para o rato representativo mostrado no vídeo, deslocamento cervical de um rato anestesiado é usado. </li><li> Executar uma traqueostomia (se não tiver feito), expondo cirurgicamente o lado ventral da traquéia, fazendo um pequeno corte, e inserindo uma agulha 18 G stub ponta na traquéia, e amarrando-o com fio. </li><li> Cuidadosamente abra o tórax com uma incisão na linha média, cortar o diafragma, e remover as paredes laterais de tórax para expor os pulmões. </li><li> Ligar a extremidade do luer da agulha para um reservatório de um suporte de anel contendo formaldeído. Veja a Figura 3. </li><li> Definir a superfície de topo do formaldeído a 25 cm acima do nível do mouSE. Veja a Figura 3. Em seguida verifique se não há ar na tubulação fixação executando fluido para fora no final de uma torneira. Ligar a extremidade do luer da cânula traqueal para o tubo do reservatório. Abra a torneira para inflar os pulmões com o formaldeído. Deixar os pulmões sob pressão para, pelo menos, 20 min. </li><li> Abra a torneira para inflar os pulmões com o formaldeído. Deixar os pulmões sob pressão para, pelo menos, 20 min. </li><li> Em seguida, amarre a traqueia para além do final da agulha topo. Ela pode ajudar a puxar para trás lentamente na agulha para expor mais da traquéia canulados. Quando amarrado com segurança, remova a torneira. </li><li> Dissecar cuidadosamente para fora dos pulmões. </li><li> Coloque os pulmões em formol durante a noite. Tempos mais longos são bons, e algumas manchas ou procedimentos podem especificar horários específicos. Além disso, quaisquer outros fixadores líquidos, tais como Z-fix pode ser utilizada para a instilação e imersão. </li><li> Antes de mais processamento histológico, mediro volume de pulmão fixo, como descrito a seguir. </li></ol> 3. A medição do volume pulmonar fixa <ol><li> Medir o volume pulmonar utilizando o princípio de Arquimedes, conforme ilustrado na Figura 4. Remover o pulmão fixo a partir do formaldeído e dissecar o coração e qualquer outro tecido não-pulmonar. </li><li> Usar um simples dispositivo de suporte de arame caseiro previamente construído que é usada para manter os pulmões completamente debaixo de água. NOTA: Este dispositivo tem de ser compatível com qualquer saldo está sendo utilizado. Um dispositivo típico mostrado na Figura 5 é feita a partir de pipetas de plástico e finos (20 g) do fio. Este sistema funciona bem com o equilíbrio usado no vídeo, mas pode ser facilmente adaptado à maioria das balanças de laboratório. </li><li> Coloque um copo com ≈200 ml de água sobre o equilíbrio ea tara com a gaiola de apoio no lugar na água. Veja a Figura 6 Retire a gaiola de metal.; coloque o pulmão na superfície da água e pressione sob a águacom a gaiola. </li><li> Grave o peso na balança. Este número reflecte o volume de água deslocado e é assim uma medida directa do volume do pulmão. Tenha cuidado para garantir que o pulmão ou sutura ou qualquer parte da gaiola de arame não toca nos lados ou no fundo do copo. </li><li> Para maior precisão, repetir esta medição. Remover o pulmão a partir da água, e seca sobre um tecido. Convulsionou o copo com gaiola no lugar novamente e repita a medição do volume pulmonar. As duas medições de volume deve então ser calculada a média. NOTA: Se os pulmões são deixados no formalina para mais do que cerca de uma semana, o ar nos pulmões irá ser dissolvido no líquido. Quando isto acontece, o pulmão irá afundar-se, por isso, já não é necessária a utilização de qualquer dispositivo, tal como na Figura 5 para manter o pulmão submerso. Em tais casos, o volume pode ser medido por simplesmente segurando o pulmão por um dos fios de sutura, até que esteja completamente submerso tal como ilustrado na Figura 4. </li></ol>

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	<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice.">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li><li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice.">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li><li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice.">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice.">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li><li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies.">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li><li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice.">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li><li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice.">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li><li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Laryngoscopy+in+Mice.">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li><li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).</li><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li><li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives.">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).</li><li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice.">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li></ol>

Os procedimentos descritos aqui têm várias vantagens. Primeiro, o equipamento necessário é simples e barata. Em segundo lugar, a intubação pode ser feito rapidamente, com poucos erros. Em terceiro lugar, a capacidade de fixar os pulmões a uma pressão constante, e, em seguida, medir o volume pulmonar fixo permite a quantificação adequada das estruturas ou células no pulmão 10. Uma possível desvantagem para a intubação é a pequena cirurgia. Isso pode limitar a capaci...

Por uma série de razões, o câncer de pulmão não tem sido amplamente estudada no mouse. Uma razão para isto é que o acesso ao pulmão é muito difícil in vivo, e a análise quantitativa de pulmão fixo não é normalmente feito. Os métodos descritos neste artigo são projetados para remediar esta situação. Os objetivos aqui são para descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Embora nenhuma dessas abordagens são inteiramente novas, que não tenham sido apresentadas em conjunto como métodos autônomos na forma simplificada, tal como descrito aqui. Tem havido um grande número de manuscritos que foram descritos métodos para a intubação do pulmão do rato principalmente com a finalidade de fazer a função pulmonar de repetição ou lavado bronco-alveolar em camundongos individuais em estudos longitudinais. Desde que o papel original, houve vários outros documentos que descrevem abordagens diferentes para mouse intubação 1 -9. Apesar de todos esses métodos podem ser usados ​​com sucesso, eles geralmente exigem formação considerável, e não são muitas vezes sem uma taxa de falha não trivial. Além disso, a fim de efectuar as medições da função pulmonar, a cânula tem de se encaixar na traqueia força suficiente de modo que não há nenhuma fuga de ar. No entanto, um outro uso prático para a entubação é a entrega de agentes específicos (células de cancro ou outros insultos) ou fármacos terapêuticos directamente para o pulmão. Tal procedimento não requer uma cânula apertadas nem qualquer equipamento sofisticado de função pulmonar. A nova característica deste método mostrado aqui envolve um pequeno procedimento cirúrgico que permite que a intubação sem qualquer possibilidade de a cânula entrar no esófago. Esta abordagem simples permite intubação bem sucedida com relativamente pouco treinamento ou experiência. Como muitos como 30 ratinhos / h pode ser tratada usando esta abordagem com uma taxa de falha próximos de zero. Uma vez que tele ratos estão prontos para serem sacrificados, os pulmões ou feridas cancerosas podem, então, ser removida para análise histológica e patológica. No entanto, a fim de quantificar adequadamente todas as variáveis ​​histológicas para comparação com outros pulmões, é essencial para padronizar os procedimentos de fixação e quantificar correctamente o volume de pulmão fixo 10. Este artigo descreve em detalhes os procedimentos simples que permitem que os processos de fixação padronizados, bem como uma maneira de medir o volume pulmonar fixa. O volume é uma métrica essencial na quantificação da histologia, uma vez que sem um tal determinação do volume, apenas densidades relativas pode ser medida 10. Uma vez que o volume do pulmão é conhecido, no entanto, as medições absolutas de células e outras medidas estruturais no pulmão pode, então, ser quantificada.

<table><tbody><tr><td>Laboratory Balance</td><td>Ohaus</td><td>Adventurer Pro Model AV 313&amp;nbsp;</td><td>Other balances can be used if they have a range of 1-300 g</td></tr><tr><td>20 g Luer intravenous catheter</td><td>Insylte</td><td></td><td>Several other possible vendors, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Jelco Optiva</td></tr><tr><td>500 ml laboratory bottle</td><td>Various</td><td></td><td>Several other possible vendors</td></tr></tbody></table>

instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research

A capacidade de incutir agentes vivos, células ou produtos químicos diretamente para o pulmão sem ferir ou matar os ratos é uma ferramenta importante na investigação do cancro do pulmão. Embora haja um certo número de métodos que foram publicados mostrando como a entubar ratinhos para medição da função pulmonar, nenhum é sem problemas potenciais para instilação traqueal rápida em grandes grupos de ratinhos. No presente trabalho, um método simples e rápida é descrito que permite que um investigador para realizar tais injeções de uma maneira eficiente. O método não requer ferramentas especiais ou de iluminação e pode ser aprendido com muito pouco prática. Trata-se de anestesia de um rato, fazendo uma pequena incisão no pescoço para visualizar a traqueia, e em seguida a inserção de um cateter intravenoso directamente. A pequena incisão é fechada rapidamente com adesivo de tecido, e os ratos são deixados a recuperar. Um estudante qualificado ou técnico pode fazer instillations a uma taxa média de 2 min / mouse. Uma vez que tele câncer é estabelecida, há freqüentemente uma necessidade de análise histológica quantitativa dos pulmões. Tradicionalmente patologistas normalmente não se preocupam em padronizar a inflação do pulmão durante a fixação, e as análises são muitas vezes baseadas em um sistema de pontuação que pode ser bastante subjetiva. Embora isso possa ser suficiente em algum momento adequado para estimativas grosseiras do tamanho de um tumor do pulmão, qualquer quantificação estereologia adequada de estrutura pulmonar ou células requer um procedimento de fixação e reprodutível de medição do volume pulmonar subsequente. Aqui nós descrevemos procedimentos confiáveis ​​simples para ambos, que fixa os pulmões sob pressão e, em seguida, medir com precisão o volume de pulmão fixo. O único requisito é uma balança de laboratório que é preciso ao longo de uma gama de 1 mg-300 g. Os procedimentos aqui apresentados, portanto, poderia melhorar significativamente a capacidade de criar, tratar e analisar os cânceres de pulmão em camundongos.

O procedimento descrever no primeiro protocolo não por si só levar a qualquer resultado generalizadas. Ele descreve somente um meio muito fiáveis ​​para incutir substâncias directamente na traqueia. A Figura 7 mostra um exemplo de um pulmão em que azul de tripano foi instilado com o método descrito aqui. Há ampla distribuição do corante, semelhante ao que foi observado com outros corantes ou marcadores dadas directamente na traqueia ou ratinhos 11,12. Também têm utilizado este ...

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Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

O objetivo deste artigo é descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Nós apresentamos 3 protocolos simples e confiável para realizar injeções de pulmão, fixação e medidas de volume pulmonar.

Instilação e fixação métodos úteis no mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

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28.2K visualizações.  Johns Hopkins University.  O objetivo deste artigo é descrever métodos simples que vai ajudar muito na configuração e análise dos pulmões do rato com câncer de pulmão ou outras patologias. Nós apresentamos 3 protocolos simples e confiável para realizar injeções de pulmão, fixação e medidas de volume pulmonar. 

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Medicina

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform necropsies rapidly and efficiently from studies without sacrificing the quality of the tissues procured. The goal of this protocol is to present a method to rapidly perfuse, inflate, and fix mouse lungs for downstream histological analysis. This method does not standardize lung inflation; thus, it does not require any special procedures or equipment and instead simply instills fixative directly through the trachea following perfusion through the heart. This allows for sufficient estimation of tumor size, histology, and scoring. This also allows for the collection of frozen tissue prior to lung tissue fixation. This method is limited in that it does not allow for later morphometric quantification of the lung; however, it is more than sufficient for lung tumor analysis from genetically engineered mouse models (GEMMs), syngeneic models, as well as xenograft tumor and metastasis studies.

The purpose of this method is to present a simple and efficient method for the perfusion, inflation, and fixation of mouse lungs for the examination of lung tumor pathology and evaluation of metastases to the lung.

Perfusão e Inflação do Pulmão do Rato para Histologia tumoral

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Pesquisa do câncer

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

Instilação traqueal direta de Solutos em pulmão de rato

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Biologia

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

<meta charset="utf8"></head><body>Preservando a localização de esporos fúngicos em pulmões para análise de microscopia fluorescente

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

Imunologia e Infecção

Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role of nicotine, the primary addictive ingredient in cigarettes, in silicosis development is unclear. The mouse model employed in this study was simple and easily controlled, and it effectively simulated the effects of chronic nicotine ingestion and repeated exposure to silica on lung fibrosis through epithelial-mesenchymal transition in human beings. In addition, this model can help in the direct study of the effects of nicotine on silicosis while avoiding the effects of other components in cigarette smoke.
After environmental adaptation, mice were injected subcutaneously with 0.25 mg/kg nicotine solution into the loose skin over the neck every morning and evening at 12 h intervals over 40 days. Additionally, crystalline silica powder (1-5 &#181;m) was suspended in normal saline, diluted to a suspension of 20 mg/mL, and dispersed evenly using an ultrasonic water bath. The isoflurane-anesthetized mice inhaled 50 &#181;L of this silica dust suspension through the nose and were awoken via chest massage. Silica exposure was administrated daily on days 5-19.
The double-exposed mouse model was exposed to nicotine and then silica, which matches the exposure history of workers who are exposed to both harmful factors. In addition, nicotine promoted pulmonary fibrosis through epithelial-mesenchymal transformation (EMT) in mice. This animal model can be used to study the effects of multiple factors on the development of silicosis.

This study describes a mouse model to study the synergistic effect of nicotine on the progression of pulmonary fibrosis in experimental silicosis mice. The dual-exposure mouse model simulates the pathological progression in the lung after simultaneous exposure to nicotine and silica. The methods described are simple and highly reproducible.

Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role ...

Instilação e fixação métodos úteis no mouse Lung Cancer Research

Resumo

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Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

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Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

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Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar