Os dados gerados com essa técnica promoveram a compreensão de modelos de camundongos propensos a autoimunes, bem como camundongos humanizados, que podem ser usados para terapêutica geral de anticorpos ou anticorpos. A disponibilidade de reagentes com uma gama cada vez maior de fluoroforos, permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros em células individuais e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados.
para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. Oi, sou Faith Harris. Vou demonstrar o procedimento hoje.
Comece aliquoting um milhão de cada tipo de célula de cada animal em uma placa de fundo U de 96 poços. Certifique-se de que poços suficientes estejam disponíveis para todas as amostras e controles, incluindo manchas completas, amostras de fluorescência-menos-uma e amostras não manchadas para cada fluoróforo. Para o painel de maturação da medula óssea e o painel de maturação do baço, as células de alíquota em dois poços, 1 milhão de células por poço para cada amostra completa de manchas.
Para os controles de viabilidade de compensação de cores únicas, adicione dois milhões de células cada um de cada tipo de célula a poços individuais. Centrifugar a placa a 845 x g por dois minutos a quatro graus Celsius. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar os poços.
Lave as células duas vezes em 200 microliters de DPBS. Centrifugar e decantar o sobrenante após cada lavagem. Resuspensar as células em 100 microliters de diluído em DPBS na proporção de um a 1000, evitando as células utilizadas para compensação de cor única.
Para cada conjunto de manchas, deixe vários poços não manchados para uma amostra completamente não manchada e outros controles que você pode precisar, bem como um poço adicional não manchado para o controle fmo de viabilidade. Adicione PBS a esses poços. Resuspend as células de controles de viabilidade de compensação de cores únicas em 200 microliters de corante de viabilidade diluída.
Transfira 100 microliters dessas células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e aqueça-o por cinco minutos a 65 graus Celsius, em seguida, transfira as células aquecidas de volta para o poço original com as células vivas restantes. Incubar as células a quatro graus Celsius por 30 minutos protegidos da luz. Após a incubação, centrifugar as células e decantar o supernante, piscando ou invertendo a placa sem contaminar os outros poços.
Lave as células reutilizando em 200 microlitres de DPBS, depois centrífugas e decantam o supernatante como antes. Repita a lavagem dpbs novamente. Adicione microliters de bloco FC diluídos com tampão de manchas em uma proporção de 1 a 50 para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro.
Para células peritoneal, adicione cinco microliters de bloqueador de monócitos para reduzir a coloração inespecífica. Em seguida, incubar as células a quatro graus Celsius por 15 minutos, protegidas da luz. Prepare misturas completas de mestre de manchas e FMOs no tampão de manchas para um volume final de 100 microliters por milhão de células usando as tabelas de anticorpos no manuscrito do texto.
Sem remover o bloco FC, adicione 100 microliters de misturas completas de manchas e FMOs aos poços selecionados. Prepare controles de compensação de cores únicas para cada anticorpo e um conjunto de manchas. Siga as instruções do fabricante se usar contas de compensação.
Incubar as células e as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos, protegidas da luz. Em seguida, centrífugas e decantar o supernatante invertendo e sacudindo a placa. Lave as células e as contas em 200 microliters de tampão de manchas três vezes, centrifugando e decantando o supernatante todas as vezes.
Resuspende as células e contas em 200 microlitres de 2% paraformaldeído em DPBS para fixar as amostras para análise. Incubar a célula e as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos, protegidos da luz, depois centrífugas e decantar o supernatante invertendo ou sacudindo a placa. Resuspenja as células e contas em 200 microliters de tampão de manchas.
Coloque uma placa de filtro sobre uma placa de fundo U limpa de 96 poços e transfira cada amostra para um poço da placa do filtro usando uma multi-pipeta. Centrifugar a placa do filtro e decantar o supernante. Para os painéis de maturação de medula óssea e baço, resuspenja as células totalmente manchadas em 100 microliters de tampão de manchas.
Combine os dois poços para cada animal em um poço. Resuspenque os painéis restantes, FMOs e controles em 200 microliters de tampão de manchas. Incubar células fixas e contas a quatro graus Celsius durante a noite, protegidas da luz.
Regiscões de compensação recorde para cada painel de manchas usando as compensações de manchas únicas preparadas e definir portões positivos e negativos para cada amostra. Calcule a matriz de compensação usando o software. Comece a adquirir a primeira amostra, certificando-se de que os portões estejam definidos adequadamente.
Defina a máquina para executar e registrar os vários eventos celulares para cada amostra, conforme mencionado no manuscrito do texto. Proceder com a análise de dados utilizando o software de análise de citometria de fluxo, seguindo as estratégias de gating no manuscrito do texto. A análise citométrica de fluxo para caracterização de células B peritônios no peritônio mostra as frequências de células peritoneais viáveis, células B totais, subconjuntos B-1 e B-2, bem como células B-1a e B-1b em camundongos.
Quando as células B da medula óssea foram analisadas, foram determinadas frequências de células viáveis, células B totais, fração A, células pré-pró-B, Fração B, Fração C, Fração C'Fração D, Fração Imatura E, Fração E transitória e fração F B em camundongos. A análise das células B esplênicas mostra as frequências de células de baço viáveis, células B totais, células B transitórias, células T1, T2, T3, células B maduras, células I foliculares, células foliculares II, células precursoras e maduras da zona marginal, e células B-1 em camundongos. As frequências de células kappa de imunoglobulina e imunoglobulina lambda B em camundongos foram determinadas com análise citométrica de fluxo do baço.
Ao executar este protocolo, você precisa resolver o sinal de um detector sangrando para o próximo usando controles de compensação. Esses controles podem ser manchados de células ou com contas de compensação disponíveis comercialmente. Ensaios adicionais podem ser usados em conjunto com a citometria de fluxo, como a imunohistoquímica para visualizar a localização celular dentro de órgãos linfoides, bem como duas microscopia de fótons para analisar as respostas das células B em espaço e tempo reais.
A análise da citometria de fluxo dos compartimentos celulares B permite a caracterização de fenótipos associados à RBC e deficiências relacionadas, perturbações de moléculas de sinalização BCR ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular B.
