Los datos generados utilizando esta técnica promueven una comprensión de los modelos de ratones propensos a la autoinmunidad, así como de los ratones humanizados, que se pueden utilizar para generalizar anticuerpos o terapias de vida de anticuerpos. La disponibilidad de reactivos con una gama cada vez mayor de fluoróforos permite el análisis simultáneo de múltiples parámetros en células individuales y permite la evaluación de la heterogeneidad de las células B. Este protocolo fue desarrollado con el propósito de fenotipar ratones genéticamente modificados.
para determinar si la manipulación genética alteraría el desarrollo de las células B. Hola, soy Faith Harris. Voy a demostrar el procedimiento hoy.
Comience por alícuar un millón de cada tipo de célula de cada animal en una placa de fondo en U de 96 pocillos. Asegúrese de que haya suficientes pozos disponibles para todas las muestras y controles, incluidas las muestras de tinción completa, fluorescencia menos uno y muestras no teñidas para cada fluoróforo. Para el panel de maduración de la médula ósea y el panel de maduración del bazo, alícuotas las células en dos pocillos, 1 millón de células por pocillo por cada muestra de tinción completa.
Para los controles de viabilidad de compensación de color único, agregue dos millones de células cada una de cada tipo de célula a los pozos individuales. Centrifugar la placa a 845 x g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante invirtiendo rápidamente y moviendo la placa sobre un fregadero, teniendo cuidado de no contaminar los pozos.
Lave las células dos veces en 200 microlitros de DPBS. Centrifugar y decantar el sobrenadante después de cada lavado. Resuspend las células en 100 microlitros de colorante de viabilidad diluido en DPBS en la proporción de uno a 1000, evitando las células utilizadas para la compensación de un solo color.
Para cada juego de manchas, deje varios pozos sin teñir para una muestra completamente sin manchar y otros controles que pueda necesitar, así como un pozo adicional sin teñir para el control fmO de viabilidad. Agregue PBS a estos pozos. Resuspendir las células de los controles de viabilidad de compensación de un solo color en 200 microlitros de colorante de viabilidad diluido.
Transfiera 100 microlitros de estas células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y caliéntelo durante cinco minutos a 65 grados centígrados, luego transfiera las células calentadas al pozo original con las células vivas restantes. Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos protegidos de la luz. Después de la incubación, centrífuga las células y decanta el sobrenadante moviendo o invirtiendo la placa sin contaminar los otros pozos.
Lave las células resuspiendo en 200 microlitros de DPBS, luego centrífuga y decante el sobrenadante como antes. Repita de nuevo el lavado DPBS. Agregue microlitros de bloque FC diluido con tampón de manchas en una proporción de uno a 50 para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro.
Para las células peritoneales, agregue cinco microlitros de bloqueador de monocitos para reducir la tinción inespecífica. Luego, incuba las células a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, protegidas de la luz. Prepare mezclas maestras de tinción completas y FMO en el tampón de manchas para un volumen final de 100 microlitros por millón de células utilizando las tablas de anticuerpos en el manuscrito de texto.
Sin eliminar el bloque FC, agregue 100 microlitros de mezclas de manchas completas y FMO a los pozos seleccionados. Prepare controles de compensación de color único para cada anticuerpo y un juego de manchas. Siga las instrucciones del fabricante si usa perlas de compensación.
Incubar las células y las cuentas a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, protegidos de la luz. Luego, centrifuga y decanta el sobrenadante invirtiendo y moviendo la placa. Lave las células y las perlas en 200 microlitros de tampón de manchas tres veces, centrifugando y decantando el sobrenadante cada vez.
Resuspend las células y perlas en 200 microlitros de paraformaldehído al 2% en DPBS para fijar las muestras para su análisis. Incubar la célula y las perlas a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, protegidos de la luz, luego centrifugar y decantar el sobrenadante invirtiendo o moviendo la placa. Resuspend las células y cuentas en 200 microlitros de tampón de manchas.
Coloque una placa de filtro sobre una placa limpia de 96 pocillos con fondo en U y transfiera cada muestra a un pozo de la placa de filtro utilizando una pipeta múltiple. Centrifugar la placa filtrante y decantar el sobrenadante. Para los paneles de maduración de la médula ósea y el bazo, resuspenda las células completamente teñidas en 100 microlitros de tampón de manchas.
Combine los dos pozos para cada animal en un solo pozo. Resuspender los paneles, FMO y controles restantes en 200 microlitros de tampón de manchas. Incuba células fijas y cuentas a cuatro grados centígrados durante la noche, protegidos de la luz.
Registre los controles de compensación para cada panel de manchas utilizando las compensaciones de manchas individuales preparadas y establezca puertas positivas y negativas para cada muestra. Calcule la matriz de compensación utilizando el software. Comience a adquirir la primera muestra, asegurándose de que las puertas estén configuradas adecuadamente.
Configure la máquina para que funcione y registre los diversos eventos de celda para cada muestra como se menciona en el manuscrito de texto. Proceda con el análisis de datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo, siguiendo las estrategias de cierre en el manuscrito de texto. El análisis citométrico de flujo para la caracterización de células B peritoneales en el peritoneo muestra las frecuencias de células peritoneales viables, células B totales, subconjuntos B-1 y B-2, así como células B-1a y B-1b en ratones.
Cuando se analizaron las células B de la médula ósea, se determinaron las frecuencias de las células viables, las células B totales, la fracción A, las células pre-pro-B, la fracción B, la fracción C, la fracción C'fracción D, la fracción E inmadura, la fracción E de transición y las células B de la fracción F en ratones. El análisis de las células B esplénicas muestra las frecuencias de las células viables del bazo, las células B totales, las células B de transición, las células T1, T2, T3, las células B maduras, las células foliculares I, las células foliculares II, las células precursoras y maduras de la zona marginal y las células B-1 en ratones. Las frecuencias de inmunoglobulina kappa e inmunoglobulina lambda células B en ratones se determinaron con análisis citométrico de flujo del bazo.
Al realizar este protocolo, debe resolver la señal de un detector sangrando al siguiente utilizando controles de compensación. Estos controles podrían ser de células teñidas individualmente o con cuentas de compensación disponibles comercialmente. Se pueden usar ensayos adicionales junto con la citometría de flujo, como la inmunohistoquímica para visualizar la localización celular dentro de los órganos linfoides, así como la microscopía de dos fotones para analizar las respuestas de las células B en el espacio y el tiempo reales.
El análisis de citometría de flujo de los compartimentos de células B permite la caracterización de fenotipos asociados con BCR y deficiencias relacionadas, perturbaciones de moléculas de señalización de BCR o interrupción de citoquinas que modulan la supervivencia de las células B.
