נתונים הנוצרים באמצעות טכניקה זו מקדמים הבנה של מודלים של עכבר נוטה אוטואימוניות, כמו גם עכברים אנושיים, שניתן להשתמש בהם לטיפולים כלליים בנוגדנים או בנוגדנים. הזמינות של ריאגנטים עם מגוון הולך וגדל של פלואורופורים, מאפשרת ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים על תאים בודדים ומאפשרת הערכה של הטרוגניות תאי B. פרוטוקול זה פותח במטרה פנוטיפינג עכברים מהונדסים גנטית.
כדי לקבוע אם מניפולציה גנטית תשנה את התפתחות תאי B. היי, אני פיית' האריס. אני אדגים את ההליך היום.
התחל על ידי aliquoting מיליון של כל סוג תא מכל חיה לתוך צלחת 96 טוב U-התחתון. ודאו שמספיק בארות זמינות עבור כל הדגימות והפקדים, כולל כתם מלא, דגימות פלואורסצנטיות-מינוס-אחת ודגימות לא מוכתמות עבור כל פלואורופור. עבור לוח ההתבגרות של מח העצם ולוח ההתבגרות של הטחול, תאי aliquot לשתי בארות, 1 מיליון תאים לבאר עבור כל דגימת כתמים מלאה.
עבור פקדי הכדאיות של פיצוי צבע יחיד, הוסף שני מיליון תאים בכל סוג תא לבארות בודדות. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x g במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, תוך דאגה לא לזהם את הבארות.
לשטוף את התאים פעמיים ב 200 microliters של DPBS. צנטריפוגה ו decant סופרנט לאחר כל לשטוף. Resuspend התאים ב 100 microliters של צביעת הכדאיות מדולל DPBS ביחס של אחד ל 1000, הימנעות התאים המשמשים לפיצוי צבע יחיד.
עבור כל ערכת כתמים, להשאיר כמה בארות לא נגועות עבור מדגם נגוע לחלוטין פקדים אחרים ייתכן שיהיה עליך, כמו גם באר נוספת לא נגועה עבור בקרת FMO קיימא. הוסף PBS לבארות אלה. Resuspend התאים של בקרת הכדאיות פיצוי צבע יחיד ב 200 microliters של צבע קיימא מדולל.
העבר 100 מיקרוליטרים של תאים אלה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לחמם אותו במשך חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את התאים המחוממים בחזרה לבאר המקורית עם התאים החיים הנותרים. לדגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מוגן מפני אור. לאחר הדגירה, צנטריפוגות התאים decant supernatant על ידי הבהוב או היפוך הצלחת מבלי לזהם את הבארות האחרות.
לשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר ב 200 microliters של DPBS, אז צנטריפוגה decant סופרננט כמו קודם. חזור שוב על שטיפת ה- DPBS. הוסף microliters של בלוק FC מדולל עם חוצץ כתמים ביחס של אחד עד 50 כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר.
עבור תאים צפקיים, להוסיף חמישה microliters של חוסם מונוציטים כדי להפחית את הכתמים הלא-זעירים. לאחר מכן, לדגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מוגן מפני אור. הכן תערובות מאסטר לכתמים מלאות ו- FMOs במאגר הכתמים לנפח סופי של 100 מיקרוליטרים למיליון תאים באמצעות טבלאות הנוגדנים בכתב היד של הטקסט.
מבלי להסיר בלוק FC, הוסף 100 מיקרוליטרים של תערובות כתמים מלאות ו- FMOs לבארות נבחרות. הכן פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור כל נוגדן וקבוע כתמים. פעל בהתאם להוראות היצרן אם אתה משתמש חרוזי פיצוי.
לדגור על התאים והחרוזים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר מכן, צנטריפוגה ו decant סופר-טבעי על ידי היפוך והבהוב הצלחת. לשטוף את התאים והחרוזים ב 200 microliters של חוצץ כתמים שלוש פעמים, centrifuging ו decanting supernatant בכל פעם.
resuspend התאים והחרוזים ב 200 microliters של 2%paraformaldehyde ב DPBS כדי לתקן את הדגימות לניתוח. לדגור על התא והחרוזים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מוגן מפני אור, ואז צנטריפוגה ו decant supernatant על ידי היפוך או הבהוב הצלחת. resuspend התאים והחרוזים ב 200 microliters של חוצץ כתמים.
מניחים צלחת מסנן על צלחת U-bottom נקייה של 96 באר ומעבירים כל דגימה לבאר של צלחת המסנן באמצעות פיפטה מרובה. צנטריפוגות צלחת המסנן ו decant סופרנטנט. עבור מח העצם ולוחות ההתבגרות של הטחול, יש להדק מחדש את התאים המוכתמים במלואם ב-100 מיקרוליטרים של חיץ כתמים.
מערבבים את שתי בארות עבור כל חיה לתוך באר אחת. יש תגדיל מחדש את הלוחות, ה-FMOs והפקדים הנותרים ב-200 מיקרו-לייטרים של מאגר כתמים. דגירה של תאים קבועים וחרוזים בארבע מעלות צלזיוס בן לילה, מוגנים מפני אור.
הקלט פקדי פיצוי עבור כל לוח כתמים באמצעות פיצויי כתם יחיד מוכנים ולהגדיר שערים חיוביים ושליליים עבור כל מדגם. חשב את מטריצת הפיצוי באמצעות התוכנה. התחל לרכוש את המדגם הראשון, ודא שהשערים מוגדרים כראוי.
הגדר את המכונה לפעול ולתעד את אירועי התא השונים עבור כל מדגם כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט. המשך בניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה, בעקבות אסטרטגיות הגינג בכתב היד של הטקסט. ניתוח ציטומטרי זרימה לאפיון תאי B צפק בצפק מראה את התדרים של תאים צפק קיימא, תאי B הכוללים, קבוצות B-1 ו- B-2, כמו גם תאי B-1a ו- B-1b בעכברים.
כאשר תאי מח העצם B נותחו, נקבעו תדרים של תאים בני קיימא, תאי B כוללים, שבר A, תאים לפני-B, שבר B, שבר C, שבר C'Fraction D, שבר E לא בוגר, שבר מעבר E, ותאי שבר F B בעכברים. ניתוח של תאי טחול B מראה את התדרים של תאי טחול קיימא, תאי B כוללים, תאי B מעבר, T1, T2, תאי T3, תאי B בוגרים, תאי זקיקים I, תאי זקיקים II, תאי אזור שוליים מבשרים ובוגרים ותאי B-1 בעכברים. התדרים של אימונוגלובולין קאפה ואימונוגלובולין לאמבדה B בעכברים נקבעו עם ניתוח ציטומטרי של הטחול.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, עליך לפתור אות מגלאי אחד מדמם אל הבא באמצעות פקדי פיצוי. פקדים אלה יכולים להיות מוכתמים באופן בל יתד או עם חרוזי פיצוי זמינים מסחרית. בדיקות נוספות ניתן להשתמש בשילוב עם ציטומטריית זרימה, כמו אימונוהיסטוכימיה כדי לדמיין לוקליזציה של תאים בתוך איברי הלימפה, כמו גם שני מיקרוסקופיה פוטון לנתח תגובות תאי B במרחב ובזמן אמיתיים.
ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי תאי B מאפשר אפיון של פנוטיפים הקשורים ל- BCR ולליקויים קשורים, הפרעות של מולקולות איתות BCR, או הפרעה של ציטוקינים המווסתים את הישרדות תאי B.
