I dati generati utilizzando questa tecnica favoriscono la comprensione dei modelli murini autoimmuni, così come dei topi umanizzati, che possono essere utilizzati per terapie generali di vita anticorpale o anticorpale. La disponibilità di reagenti con una gamma sempre più ampia di fluorofori, consente l'analisi simultanea di più parametri su singole cellule e consente la valutazione dell'eterogeneità delle cellule B. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di fenotipizzare topi geneticamente modificati.
per determinare se la manipolazione genetica altererebbe lo sviluppo delle cellule B. Ciao, sono Faith Harris. Oggi dimostrerò la procedura.
Inizia aliquotando un milione di ogni tipo di cellula da ciascun animale in una piastra a U a 96 pozzetti. Assicurarsi che siano disponibili pozzi sufficienti per tutti i campioni e i controlli, inclusi campioni di macchia completa, fluorescenza meno uno e campioni non macchiati per ciascun fluoroforo. Per il pannello di maturazione del midollo osseo e il pannello di maturazione della milza, le cellule aliquote in due pozzetti, 1 milione di cellule per pozzetto per ogni campione di macchia completa.
Per i controlli di vitalità della compensazione del colore singolo, aggiungere due milioni di celle ciascuna di ciascun tipo di cella ai singoli pozzetti. Centrifugare la piastra a 845 x g per due minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.
Lavare le celle due volte in 200 microlitri di DPBS. Centrifugare e decantare il surnatante dopo ogni lavaggio. Risospese le cellule in 100 microlitri di colorante di vitalità diluito in DPBS con un rapporto di uno a 1000, evitando le celle utilizzate per la compensazione del singolo colore.
Per ogni set di macchie, lasciare diversi pozzetti non macchiati per un campione completamente non macchiato e altri controlli di cui potresti aver bisogno, nonché un ulteriore pozzo non macchiato per il controllo FMO di fattibilità. Aggiungi PBS a questi pozzi. Sospendere le celle dei controlli di vitalità di compensazione del colore singolo in 200 microlitri di colorante di vitalità diluito.
Trasferire 100 microlitri di queste cellule in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e riscaldarlo per cinque minuti a 65 gradi Celsius, quindi trasferire le celle riscaldate al pozzo originale con le cellule vive rimanenti. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule e decantare il surnatante facendo scorrere o invertire la piastra senza contaminare gli altri pozzetti.
Lavare le cellule rieseguendo in 200 microlitri di DPBS, quindi centrifugare e decantare il surnatante come prima. Ripetere nuovamente il lavaggio DPBS. Aggiungere microlitri di blocco FC diluiti con tampone antimacchia in un rapporto da uno a 50 per ottenere una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.
Per le cellule peritoneali, aggiungere cinque microlitri di bloccante dei monociti per ridurre la colorazione non specifica. Quindi, incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 15 minuti, al riparo dalla luce. Preparare miscele complete di master di macchie e FMO nel tampone di colorazione per un volume finale di 100 microlitri per milione di cellule utilizzando le tabelle degli anticorpi nel manoscritto di testo.
Senza rimuovere il blocco FC, aggiungere 100 microlitri di miscele di macchie complete e FMO ai pozzetti selezionati. Preparare controlli di compensazione del colore singolo per ogni anticorpo e un set di macchie. Seguire le istruzioni del produttore se si utilizzano perline di compensazione.
Incubare le cellule e le perline a quattro gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce. Quindi, centrifugare e decantare il surnatante invertendo e facendo scorrere la piastra. Lavare le cellule e le perline in 200 microlitri di tampone antimacchia tre volte, centrifugando e decantando il surnatante ogni volta.
Risospesere le cellule e le perline in 200 microlitri di paraformaldeide al 2% in DPBS per fissare i campioni per l'analisi. Incubare la cellula e le perline a quattro gradi Celsius per 30 minuti, al riparo dalla luce, quindi centrifugare e decantare il surnatante invertendo o facendo scorrere la piastra. Risospesere le cellule e le perline in 200 microlitri di tampone antimacchia.
Posizionare una piastra filtrante su una piastra a U pulita a 96 pozzetti e trasferire ogni campione in un pozzetto della piastra filtrante utilizzando una pipetta multipla. Centrifugare la piastra filtrante e decantare il surnatante. Per i pannelli di maturazione del midollo osseo e della milza, risospese le cellule completamente colorate in 100 microlitri di tampone antimacchia.
Unire i due pozzetti per ogni animale in un unico pozzo. Risospendere i pannelli rimanenti, FMO e controlli in 200 microlitri di tampone antimacchia. Incubare cellule fisse e perline a quattro gradi Celsius durante la notte, al riparo dalla luce.
Registrare i controlli di compensazione per ciascun pannello di macchia utilizzando le compensazioni a singola macchia preparate e impostare cancelli positivi e negativi per ciascun campione. Calcola la matrice di compensazione utilizzando il software. Inizia ad acquisire il primo campione, assicurandoti che i cancelli siano impostati in modo appropriato.
Impostare la macchina per l'esecuzione e registrare i vari eventi di cella per ogni campione come menzionato nel manoscritto di testo. Procedere con l'analisi dei dati utilizzando un software di analisi della citometria a flusso, seguendo le strategie di gating nel manoscritto di testo. L'analisi citometrica a flusso per la caratterizzazione delle cellule B peritoneali nel peritoneo mostra le frequenze delle cellule peritoneali vitali, delle cellule B totali, dei sottoinsiemi B-1 e B-2, nonché delle cellule B-1a e B-1b nei topi.
Quando sono state analizzate le cellule B del midollo osseo, sono state determinate le frequenze delle cellule vitali, delle cellule B totali, della frazione A, delle cellule pre-pro-B, della frazione B, della frazione C, della frazione C'D, della frazione immatura E, della frazione transitoria E e della frazione F B nei topi. L'analisi delle cellule B della milza mostra le frequenze delle cellule vitali della milza, delle cellule B totali, delle cellule B di transizione, delle cellule T1, T2, T3, delle cellule B mature, delle cellule follicolari I, delle cellule follicolari II, delle cellule precursori e mature della zona marginale e delle cellule B-1 nei topi. Le frequenze delle cellule B di immunoglobuline kappa e immunoglobuline lambda nei topi sono state determinate con l'analisi citometrica a flusso della milza.
Quando si esegue questo protocollo, è necessario risolvere il segnale da un rilevatore di sanguinamento al successivo utilizzando i controlli di compensazione. Questi controlli potrebbero essere macchiati singolarmente o con perle di compensazione disponibili in commercio. Ulteriori saggi possono essere utilizzati in combinazione con la citometria a flusso, come l'immunoistochimica per visualizzare la localizzazione cellulare all'interno degli organi linfoidi, nonché due microscopia fotonica per analizzare le risposte delle cellule B nello spazio e nel tempo reali.
L'analisi citometrica a flusso dei compartimenti delle cellule B consente la caratterizzazione dei fenotipi associati alla BCR e alle relative carenze, perturbazioni delle molecole di segnalazione BCR o interruzione delle citochine che modulano la sopravvivenza delle cellule B.
