Esses protocolos são significativos porque fornecem etapas detalhadas para validação da potência e seletividade de novos inibidores do HAT, que são importantes ferramentas de pesquisa e potenciais terapêuticas. As técnicas demonstradas neste vídeo são fáceis de executar e fornecem informações sobre os efeitos dos inibidores do HAT na acetilação histona global e regional. Eles tornam possível entender a regulação epigenética da expressão genética.
Atenção aos detalhes é fundamental. É importante seguir os protocolos passo a passo. Comece preparando a reação enzimática em um volume de 10 microliter dentro de um tubo PCR de 0,2 mililitro de acordo com as instruções do manuscrito.
Em seguida, incubar a mistura de reação completa a 30 graus Celsius durante uma hora em um ciclor térmico PCR. Enquanto isso, adicione dois mercaptoetanol em uma proporção de um a 10 para o buffer de amostra SDS 6X. Remova amostras do ciclor térmico PCR e adicione dois microliters do buffer de amostra SDS preparado a cada mix de reação.
Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos em um bloco de calor, depois esfrie-as no gelo. Armazene as amostras a menos 20 ou menos 80 graus Celsius ou proceda com eletroforese gel e imunoblotting. Sementes 100.000 células MCF-7 em um mililitro de cultura celular média em cada poço de uma placa de 12 poços e permitem que as células cresçam de 80 a 90% de confluência.
Quando as células atingem a confluência desejada, aspirar o meio de cultura celular dos poços quatro, cinco e seis, e pipeta um mililitro de três ms275 micromolar em média em cada poço. Em seguida, aspire o meio de cultura celular dos poços um, dois e três, e pipeta um mililitro de DMSO diluído em cada poço. Devolva as células à incubadora por quatro horas para permitir o acúmulo de histonas acetiladas em células expostas ao MS275.
Enquanto as células estão incubando, prepare diluições de A-485 em DMSO de acordo com as instruções do manuscrito. Quando a incubação estiver concluída, aspire o meio dos poços e adicione as diluições. Devolva as células à incubadora e as cultue por 20 horas, depois aspire o meio de cultura celular dos poços e lave as células com um mililitro de PBS.
Aspire o PBS e adicione 100 microliters de tampão de lise passiva. Armazene a placa a menos 80 graus Celsius durante a noite. Pipeta 100 microliters de cromatina sônica de células tratadas com DMSO em dois tubos de 1,5 mililitros, em seguida, pipeta 400 microliters de tampão de diluição ChIP para cada tubo para trazer o volume total até 500 microliters.
Remova cinco microliters da solução de um dos tubos e armazene-a a menos 20 graus Celsius como entrada DMSO. Prepare dois tubos com cromatina sônica de células tratadas com A-485 da mesma forma. Use uma pipeta para adicionar os anticorpos de acetil IgG e H3K27 às amostras de DMSO e A-485.
Em seguida, adicione 20 microliters de proteína A contas magnéticas a cada tubo, certificando-se de que as contas estão bem resuspended. Gire as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. Pellte a proteína Uma conta magnética usando um separador magnético e remova o supernatante sem perturbar as contas.
Lave as contas com 500 microliters a um mililitro de tampão de lavagem de sal baixo e gire-as por cinco minutos a quatro graus Celsius. Faça um giro rápido para baixo, pelota as contas com um separador magnético e remova o supernatante. Repita o procedimento de lavagem com tampão de lavagem de sal alto, tampão de lavagem de cloreto de lítio e tampão de TE.
Após a lavagem com tampão de TE, retire as amostras de entrada do congelador e coloque-as no gelo. Descongele uma alíquota de proteinase K, em seguida, pelota as contas usando um separador magnético e remova o tampão TE das contas. Adicione 100 microliters de tampão de elução ChIP e um microliter de proteinase K a cada amostra, incluindo as amostras de entrada e incuba-los com agitação a 62 graus Celsius por duas horas usando um termociclador.
Após a incubação, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos e esfrie-as à temperatura ambiente. Pellule as contas magnéticas com um separador magnético e transfira o supernante contendo DNA para um novo tubo de 1,5 mililitro. Purifique o DNA usando um kit de limpeza PCR padrão e execute qPCR.
O ensaio de acetiltransferase de histona in vitro foi usado para investigar o efeito do ácido anacárico na atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. Um intervalo de concentração foi testado e acetil-CoA não foi adicionado à reação de controle negativo. Os resultados do imunoblot foram quantificados com ImageJ, mostrando uma clara redução no acetil H3K18 e acetil H3K9 em 100 ácido anacáclico micromolar em comparação com o controle DMSO.
No ensaio de inibição da hiper acetilação da cromatina, o tratamento de células MCF-7 com HDACi MS275 fortemente regulada acetilação de histone 3 em vários resíduos de liseina. Os níveis basais de acetil H3K18 e acetil H3K27 foram baixos, mostrando os benefícios de adicionar um HDACi no ensaio ChHAI. A adição de A-485 em células pré-tratadas com MS275 atenua o aumento da acetilação histona em H3K18 e H3K27, mas não H3K9.
Os resultados do imunoblot também foram quantificados com ImageJ. O chIP qPCR foi usado para investigar os efeitos dos inibidores do HAT em elementos de regulação genética que controlam a expressão oncogene. Na amostra DMSO, o DNA precipitado pelo anticorpo de controle IgG produziu um valor ct maior do que o anticorpo acetil H3K27 na reação qPCR para o promotor cyclin D1, indicando que o controle IgG não específico precipitou menos complexos de histona de DNA do que o anticorpo específico acetil H3K27 no promotor.
Comparado com o controle DMSO, o A-485 reduziu o enriquecimento do acetil H3K27 no promotor cyclin D1. É importante ressaltar que o A-485 é conhecido por reduzir significativamente o acetil H3K27 na cultura celular. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que os passos de pré-incubação dos ensaios in vitro HAT e ChHAI são essenciais e não devem ser esquecidos.
Também é importante lembrar de salvar as amostras de entrada e evitar a perda das contas durante o ChIP. Após a realização desses procedimentos, o ChIP-seq é um método adicional que pode ser executado para obter informações globais sobre acetilação de histona em elementos regulatórios para todo o genoma. Esses protocolos são úteis para os cientistas validarem cuidadosamente novos inibidores do HAT e evitar a publicação de sondas químicas de baixa qualidade na literatura.
Os inibidores de HAT validados podem ser submetidos a um desenvolvimento adicional como potenciais terapêuticos.
