这些协议之所以重要，是因为它们为验证新型 HAT 抑制剂的功效和选择性提供了详细的步骤，而新型 HAT 抑制剂是重要的研究工具和潜在的治疗方法。本视频中演示的技术易于执行，并提供有关 HAT 抑制剂对全局和区域组蛋白乙酰化的影响的信息。它们使得理解基因表达的表观遗传调控成为可能。
关注细节至关重要。逐步遵循协议非常重要。首先根据手稿方向，在 0.2 毫升 PCR 管内制备 10 微升体积的酶反应。
然后在PCR热循环器中孵育30摄氏度下的完整反应混合物一小时。同时，在 6X SDS 样品缓冲液中，以 1 比 10 的比例添加两个甲醇。从 PCR 热循环器中去除样品，并将制备的 SDS 样品缓冲液的两微升添加到每个反应混合物中。
将样品加热到95摄氏度，在热块上加热5分钟，然后在冰上冷却。将样品储存在零下20或零下80摄氏度，或进行凝胶电泳和免疫印迹。将10万个MCF-7细胞在一毫升细胞培养培养中放入12井板的每个井中，使细胞生长到80至90%的汇合。
当细胞达到所需的汇合时，从孔四、五和六吸出细胞培养，将移液器一毫升的三微摩尔MS275以中等进入每口井。然后从井一、二、三中吸出细胞培养基，将一毫升稀释的DMSO移液器吸入每口井中。将细胞返回到培养箱4小时，以在暴露于MS275的细胞中积累乙酰基细胞。
当细胞孵育时，根据手稿指示在DMSO中准备稀释的 A-485。孵育完成后，从井中吸出介质并添加稀释剂。将细胞返回培养箱并培养20小时，然后从孔中吸出细胞培养培养，然后用一毫升PBS清洗细胞。
吸气PBS，并添加100微升无源解液缓冲液。将盘子存放在零下80摄氏度的一夜之间。移液100微升的声波染色质从用DMSO处理的细胞放入两个1.5毫升管，然后移液器400微升的ChIP稀释缓冲液到每个管，使总体积达到500微升。
从其中一个管中取出溶液的五微升，并将其储存在零下 20 摄氏度，作为 DMSO 输入。从用A-485治疗的细胞中，用声波染色质准备两个管子。使用移液器将IgG和H3K27乙酰抗体添加到DMSO和 A-485样品中。
然后在每个管中加入20微升蛋白质 A 磁珠，确保珠子重新悬浮良好。在四摄氏度下将样品旋转一夜。使用磁性分离器将蛋白质分解为磁性珠，在不干扰磁珠的情况下去除上清液。
用500微升将珠子洗至1毫升低盐洗涤缓冲液，并在4摄氏度下旋转5分钟。快速旋转下来，用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后取出上流水线。使用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和TE缓冲液重复洗涤过程。
使用 TE 缓冲液清洗后，从冰柜中取出输入样品并将其放在冰上。解冻蛋白酶K的等分，然后用磁性分离器对珠子进行颗粒化，然后从珠子上取出TE缓冲液。在每个样品（包括输入样品）中加入100微升ChIP洗脱缓冲液和1微升蛋白酶K，并使用热循环器在62摄氏度下摇动2小时。
孵育后，将样品加热至95摄氏度10分钟，然后冷却至室温。用磁性分离器将磁珠混合，将含有DNA的上能液转移到新的1.5毫升管中。使用标准 PCR 清理套件净化 DNA 并运行 qPCR。
体外组蛋白乙酰转移酶测定用于研究甲酸对p300 HAT活性对组蛋白基质的影响。测试了浓度范围，乙酰-CoA没有添加到阴性控制反应中。与DMSO控制相比，100微摩尔甲酸的乙酰H3K18和乙酰H3K9的免疫布洛特结果被量化。
在染色质超乙酰化抑制测定中，用HDACi MS275对MCF-7细胞进行强调节组蛋白3的乙酰化，对几种莱辛残留物进行调节。乙酰H3K18和乙酰H3K27的基底水平较低，显示了在ChHAI测定中添加HDACi的好处。在MS275预处理的细胞中添加的 A-485 会衰减 H3K18 和 H3K27 中增加的组蛋白乙酰化，但不是 H3K9。
免疫布洛特结果也用 ImageJ 进行量化。ChIP qPCR 用于研究 HAT 抑制剂对控制基因表达的基因调控元素的影响。在DMSO样品中，IgG控制抗体沉淀的DNA在环素D1促进剂的qPCR反应中产生的CT值高于乙酰H3K27抗体，表明非特异性IgG控制沉淀的DNA组蛋白复合物比反应器中的乙酰H3K27特异性抗体少。
与DMSO控制相比，A-485降低了环素D1启动子的乙酰H3K27浓缩量。重要的是，A-485已知可以显著减少细胞培养中的乙酰H3K27。尝试此协议时，请记住，体外 HAT 和 ChHAI 检测的预孵化步骤至关重要，不应被遗忘。
同样重要的是要记住保存输入样本，并避免在 ChIP 期间丢失珠子。执行这些程序后，ChIP-seq 是一种额外的方法，可以执行，以获得有关整个基因组调控元素的组蛋白乙酰化的全局信息。这些协议有助于科学家仔细验证新的 HAT 抑制剂，并避免在文献中发布低质量的化学探针。
经过验证的 HAT 抑制剂可以作为潜在的治疗方法进行进一步开发。
