Questi protocolli sono significativi perché forniscono passaggi dettagliati per la convalida della potenza e della selettività dei nuovi inibitori hat, che sono importanti strumenti di ricerca e potenziali terapie. Le tecniche dimostrate in questo video sono facili da eseguire e forniscono informazioni sugli effetti degli inibitori hat sull'acetilazione istono globale e regionale. Rendono possibile comprendere la regolazione epigenetica dell'espressione genica.
L'attenzione ai dettagli è fondamentale. È importante seguire i protocolli passo dopo passo. Inizia preparando la reazione enzimatica in un volume di 10 microlitri all'interno di un tubo PCR da 0,2 millilitri secondo le indicazioni manoscritte.
Quindi incubare la miscela di reazione completa a 30 gradi Celsius per un'ora in un ciclore termico PCR. Nel frattempo, aggiungere due mercaptoetanolo con un rapporto uno a 10 al tampone campione 6X SDS. Rimuovere i campioni dal ciclore termico PCR e aggiungere due microlitri del tampone campione SDS preparato a ciascuna miscela di reazione.
Scaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti su un blocco di calore, quindi raffreddarli sul ghiaccio. Conservare i campioni a meno 20 o meno 80 gradi Celsius o procedere con elettroforesi gel e immunoblotting. Semina 100.000 cellule MCF-7 in un millilitro di mezzo di coltura cellulare in ogni pozzo di una piastra da 12 pozzetto e consente alle cellule di crescere fino all'80-90% di confluenza.
Quando le cellule raggiungono la confluenza desiderata, aspirare il mezzo di coltura cellulare da pozzi quattro, cinque e sei e pipettare un millilitro di tre micromolare MS275 in mezzo in ogni pozzo. Quindi aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi uno, due e tre, e pipettare un millilitro di DMSO diluito in ogni pozzo. Riportare le cellule nell'incubatrice per quattro ore per consentire l'accumulo di istoni acetilati nelle cellule esposte all'MS275.
Mentre le cellule stanno incubando, preparare diluizioni di A-485 in DMSO secondo le indicazioni manoscritte. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo dai pozzi e aggiungere le diluizioni. Riportare le cellule nell'incubatrice e culturerle per 20 ore, quindi aspirare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi e lavare le cellule con un millilitro di PBS.
Aspirare il PBS e aggiungere 100 microlitri di tampone dilisi passiva. Conservare la piastra a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Pipetta 100 microlitri di cromatina sonicata da celle trattate con DMSO in due tubi da 1,5 millilitri, quindi pipettare 400 microlitri di tampone di diluizione ChIP in ogni tubo per portare il volume totale fino a 500 microlitri.
Rimuovere cinque microlitri della soluzione da uno dei tubi e conservarla a meno 20 gradi Celsius come ingresso DMSO. Preparare due tubi con cromatina sonicata da cellule trattate con A-485 allo stesso modo. Utilizzare una pipetta per aggiungere gli anticorpi acetil IgG e H3K27 ai campioni DMSO e A-485.
Quindi aggiungere 20 microlitri di proteine A perline magnetiche ad ogni tubo, assicurandosi che le perline siano ben rimorsi. Ruotare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius. Pellettare la proteina A perline magnetiche utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il supernatante senza disturbare le perline.
Lavare le perline con 500 microlitri in un millilitro di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale e ruotarle per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eseguire uno spin down rapido, pelletare le perline con un separatore magnetico e rimuovere il supernatante. Ripetere la procedura di lavaggio con tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale, tampone di lavaggio al cloruro di litio e tampone TE.
Dopo il lavaggio con tampone TE, rimuovere i campioni di ingresso dal congelatore e metterli sul ghiaccio. Scongelare un'aliquota di proteinasi K, quindi pelletare le perline utilizzando un separatore magnetico e rimuovere il tampone TE dalle perline. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione ChIP e un microlitro di proteinasi K a ogni campione, compresi i campioni di input, e incubarli con tremori a 62 gradi Celsius per due ore utilizzando un termociclo.
Dopo l'incubazione, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti, quindi raffreddarli a temperatura ambiente. Pellet le perline magnetiche con un separatore magnetico e trasferire il supernatante contenente DNA in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Purificare il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR standard ed eseguire qPCR.
Il saggio istonico in vitro acetiltransferasi è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'acido anacardico sull'attività del HAT p300 verso un substrato istonico. È stato testato un intervallo di concentrazione e l'acetil-CoA non è stato aggiunto alla reazione di controllo negativo. I risultati dell'immunoblot sono stati quantificati con ImageJ, mostrando una chiara riduzione dell'acetil H3K18 e dell'acetil H3K9 a 100 acido anacardico micromolare rispetto al controllo DMSO.
Nel saggio di inibizione dell'iper-acetilazione della cromatina, trattamento delle cellule MCF-7 con HDACi MS275 acetilazione fortemente upregolata dell'istone 3 su diversi residui di lisina. I livelli basali di acetil H3K18 e acetil H3K27 erano bassi, mostrando i vantaggi dell'aggiunta di un HDACi nel saggio ChHAI. L'aggiunta di A-485 in cellule pretrattate con MS275 attenua l'aumento dell'acetilazione istono a H3K18 e H3K27, ma non H3K9.
I risultati dell'immunoblot sono stati quantificati anche con ImageJ. ChIP qPCR è stato utilizzato per indagare gli effetti degli inibitori hat sugli elementi regolatori genici che controllano l'espressione oncogene. Nel campione DMSO, il DNA precipitato dall'anticorpo di controllo IgG ha prodotto un valore Ct superiore rispetto all'anticorpo acetil H3K27 nella reazione qPCR per il promotore cyclin D1, indicando che il controllo IgG non specifico ha precipitato meno complessi istonali di DNA rispetto all'anticorpo specifico acetil H3K27 al promotore.
Rispetto al controllo DMSO, L'A-485 ha ridotto l'arricchimento dell'acetil H3K27 presso il promotore cyclin D1. È importante sottolineare che L'A-485 è noto per ridurre significativamente l'acetil H3K27 nella coltura cellulare. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che le fasi di pre-incubazione dei saggi HAT e ChHAI in vitro sono essenziali e non devono essere dimenticate.
È anche importante ricordare di salvare i campioni di input ed evitare la perdita delle perline durante il ChIP. Dopo aver eseguito queste procedure, ChIP-seq è un metodo aggiuntivo che può essere eseguito per ottenere informazioni globali sull'acetilazione dell'istono agli elementi normativi per l'intero genoma. Questi protocolli sono utili per gli scienziati per convalidare attentamente nuovi inibitori hat e per evitare di pubblicare sonde chimiche di bassa qualità in letteratura.
Gli inibitori del HAT convalidati possono subire un ulteriore sviluppo come potenziali terapie.
