Name: methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Agradecemos Bryne Ulmschneider contribuições para o protocolo e Diane Barber para sugestões sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Instituto Nacional de subvenção de saúde GM116384 ao Nystul de T.G. e D.L. Barber.

Nota: para medir pHi na linhagem FSC, podemos calcular a relação das intensidades de fluorescência da pHluorin para mCherry em células de folículo em condições fisiológicas, pFCs e FSCs e converter os rácios em valores de pHi com padrão as curvas de calibração para cada célula tipo 7. Primeiras, viver experiências de imagem são realizadas para medir intensidades de fluorescência de pHluorin e mCherry em germaria dissecado em um buffer que contém NaHCO 3, que imita condições fisiológicas 1 , 7. curvas padrão, próxima são geradas por medir intensidades de fluorescência pHluorin e mCherry em um at +-livre, K + tampão contendo o ionóforo nigericin ajustado para dois valores de pH diferentes, 6,5 e 7,5. Na presença de nigericin, pHi se equilibra o pH da reserva através da membrana de plasma, causando pHi coincidir com o pH extracelular. Por último, as curvas padrão são usadas para converter pHluorin para mCherry rácios para valores estimados pHi.
 1. pré-julgamento: preparação antes de medição pHi In Vivo Nota: para medir pHi na vivo, o transgene mCherry::pHluorin deve ser expressos no tipo de célula de interesse. Abaixo estão algumas maneiras comuns para gerar pHluorin transgénico voa na linhagem do FSC. A geração de clones mCherry::pHluorin é particularmente útil para identificar FSCs, que estão localizados na extremidade anterior de um clone do FSC. Tecido mCherry::pHluorin específicos expressão é útil para medir pHi em todo o tecido inteiro e também é mais conveniente quando se combina com a expressão de um RNAi ou transgene.
<ol><li>Geração de transgênico pHluorin voa <ol><li>mCherry::pHluorin-rotulados FSC clones <ol><li>tornar mCherry::pHluorin FSC clones, cruzar UAS-mCherry::pHluorin 1 para um ato-Gal4 flipout ações ou outro o estoque com um Gal4 inducible Flp/FRT.</li>
			<li>Para fazer heatshock clones inducible, heatshock adultos F1s para 2 dias pós eclosão em frascos vazios para 1 h em um banho de água de 37 ° C, quatro vezes aproximadamente cada 12 h.</li>
			<li>Para garantir o crescimento normal e taxas máximas de oogénese durante este período, manter moscas fornecendo molhado de fermento fresco (aproximadamente partes iguais secar padeiro &#39; s fermento e água) diariamente pelo menos 6 dias após a indução de clone.</li>
		</ol></li> <li>Expressão de mCherry::pHluorin específicas de tecido</li> <li>Cruz UAS-mCherry::pHluorin 1 de um folículo celular driver específico, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).</li>
		<li>3 dias depois que moscas começam eclosing, coletar e colocá-los em frascos contendo fermento molhado, pelo menos 24 h antes da dissecação.</li>
	</ol></li> <li>Fazendo soluções Nota: é importante preparar os buffers de seguintes no dia do experimento, porque as concentrações de pH e soluto no buffer podem mudar ao longo do tempo.
	<ol><li>Buffers de bicarbonato, nigericin e dissecação de preparar. Adicione os componentes na ordem listada para evitar formação de precipitados (consulte a tabela 1, tabela 2 e tabela 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Julgamento: Medição pHi na linhagem FSC Nota: A dissecação, montagem e ao vivo de imagens as etapas para o tampão de bicarbonato e as condições de reserva de nigericin dois talvez precise ser executada duas vezes: uma vez para determinar o microscópio configurações e uma segunda vez para coletar dados experimentais. Consulte a seção 2.2 abaixo para obter mais informações.
<ol><li>, Dissecção e montagem Nota: para materiais necessários para executar este passo, consulte a Figura 1 e Tabela de materiais. Para câmaras 3D montagem de impressos, arquivos de impressora 3D são fornecidos como arquivo suplementar 1 e 2 de arquivo suplementar.
	<ol><li>Dissecação: <ol><li>câmaras de montagem Prepare aplicando uma fina camada de graxa de vácuo para o lado mais liso da 3D impresso câmara de montagem. Coloque esse lado sobre uma lamela de 22 x 40 mM para selar a lamela para a câmara de montagem.</li>
		</ol></li> <li>Dissecar os ovários da fêmeas adultas moscas no buffer de dissecação 500 µ l (tampão bicarbonato ou nigericin, tabela 3) <ol><li>anestesiar moscas de 3-4 usando gás de CO 2 e transferência voa sobre uma placa mosca perfundida com CO 2 gás.</li>
			<li>Pegar uma mosca anestesiada com pinça e coloque na mídia dissecação.</li>
			<li>Beliscar o tórax de uma mosca com uma pinça, enquanto puxando a ponta de seu abdômen até que seus ovários estão expostos.</li>
			<li>Depois de descolar os ovários de outros órgãos, arreliar distante o ovarioles usando 22 1/2 agulhas de seringa. Cuidadosamente separada do músculo da bainha dos ovários e ovarioles individuais separadas do cluster de ovarioles. Uma técnica eficiente para isolar a bainha do músculo é usar uma agulha de seringa para segurar o cluster de ovarioles no lugar em sua extremidade anterior e curso para baixo ao longo do comprimento do único ovarioles.</li>
			<li>Incubar os ovários dissecados na mídia de dissecação por exatamente 10 min antes de prosseguir para a etapa de montagem, para que haja tempo suficiente para o pHi de células totalmente equilibrar o pH dos meios de comunicação dissecação nigericin. 
			Nota: Certifique-se que a bainha do músculo é removida o ovarioles. A bainha do músculo pode atenuar o sinal de fluorescência, o que torna difícil identificar células individuais usando Concanavilin-A e pode causar ovarioles mover-se espontaneamente durante a geração de imagens ao vivo.</li>
		</ol></li> <li>De montagem <ol><li>colocar uma pequena gota de mídia de dissecação no sentido da lamela de vidro no interior da câmara de montagem.</li>
			<li>Transferência separada ovarioles usando fórceps.</li>
			<li>Separar câmaras de ovo de fase posteriores do germaria associado com câmaras de ovo de fase anteriores e tentar garantir que o germaria dissecado são colocados no centro da gota mídia dissecação.</li>
			<li>Adicionar duas pequenas gotas de esmalte para lados opostos de uma lamela de 12mm redonda e deixe secar por cerca de 10 s.</li>
			<li>Lugar a rodada lamela sobre a entrega de mídia de dissecação contendo separados germaria tal que daquele lado com esmaltes virado para baixo e entra em contato com a mídia de dissecação. Pressione as partes da borda com os esmaltes para achatar e fixar o germaria em posição. Nós recomendamos usar esmaltes mais velho porque ele mancha menos sobre a superfície da lamela como está sendo segura no lugar.</li>
			<li>Encha a câmara de montagem com meios adicionais de dissecação. Buffer de condição específica que não contenha Concanavalina-A tintura pode ser usado para encher a câmara de. 
			Nota: O tempo total gasto dissecando e montagem não deve exceder 15 min. Isto é importante para minimizar os efeitos do dano tecidual e morte da pilha.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imagens ao vivo: Nota: nesta etapa, primeiro recolher imagens da condição de bicarbonato e as duas condições de nigericin para determinar as configurações de microscópio apropriado; ajustar as configurações de microscópio, se necessário, e coletar imagens para os dados experimentais. Usar um microscópio confocal capaz de imagem em 3 canais: GFP (emissão de excitação 475/509), mCherry (emissão de excitação/610 575) e far-red (633 emissão de excitação/647). 
	Nota: Definir configurações de microscópio: as intensidades pixel das imagens coletadas irão ser quantificadas para determinar as estimativas de pHi, por isso é importante que os valores de intensidade do sinal em cada conjunto de imagem é muito baixa nem saturados. A gama de intensidades que podem ser capturados em uma imagem é definida pela profundidade de bits da imagem. Em muitos casos, imagens de 8 bits são geradas por padrão, mas recomendamos adquirir os dados como imagens de 16 bits, que têm um alcance dinâmico mais amplo. É importante assegurar que a interferência entre canais fluorescentes é minimizada, então as configurações devem ser ajustadas para que o espectro de emissão coletados de cada fluoróforo não se sobreponha. Para testar essas configurações, pegue uma imagem de amostra utilizando o espectro de excitação para as boas práticas agrícolas e recolher no espectro de emissão para mCherry e vice versa. Se as configurações foram ajustadas corretamente, não deve haver nenhum sinal em ambos os casos. Defina as configurações de microscópio (i.e., configurações de tensão em uma varredura a laser confocal, tamanho poder e pinhole de laser) para que as intensidades de pixel do sinal em todos os conjuntos de três imagens estão dentro da faixa dinâmica do arquivo de imagem. Para todas as nossas experiências, foi utilizado um laser de luz branco microscópio confocal com um objectivo de 40x para adquirir imagens de 16 bits em formato de × 1.024 1.024, enquanto nós aperfeiçoamos o ganho de tensão para cada experimento, conforme necessário. Por exemplo, em um experimento, podemos definir o ganho de tensão de GFP, mCherry e far-red como 37,8% 72,9% e 260%, respectivamente.
	<ol><li>Imagem ovarioles no buffer de dissecação nigericin a pH 6,5 e ajustar as configurações, tais que as intensidades pixel das imagens pHluorin e mCherry são baixas, mas não abaixo os limites de detecção da câmera.</li>
		<li>Imagem um outro conjunto de ovarioles no buffer de dissecação nigericin a pH 7,5 e ajustar as configurações de tal forma que as intensidades de pixel das imagens pHluorin e mCherry são altas, mas não saturados.</li>
		Ovários de imagem <li>na dissecação de bicarbonato buffer e certifique-se de que as intensidades de pixel das imagens pHluorin e mCherry não estão saturadas com as configurações escolhidas. Se os pixels são saturados, ajuste as configurações conforme necessário. 
		Nota: Microscópio parâmetros de configuração podem diferir com base na configuração do microscópio exata sendo usada e deve ser otimizado para cada experimento. Depois de microscópio configurações foram definidas, não alterá-los para o restante do experimento. As configurações devem coadunar-se através de controle e condições experimentais. Em nossos experimentos iniciais pHi, geramos 2 e 3 curvas de calibração de ponto nigericin e não encontrada nenhuma diferença significativa entre pHi calculado usando qualquer método. No entanto, em geral, a adição de mais pontos na curva de calibração seria esperada para melhorar a precisão. Portanto, é recomendável gerar curvas com diferentes números de pontos para determinar quantas são necessárias para um determinado conjunto de condições experimentais.</li>
	</ol></li> <li>Coleta de dados: <ol><li>faz dissecação, montagem e a imagem das amostras nas condições tampão bicarbonato e nigericin. Depois de dissecção e montagem, o tempo máximo de um conjunto de amostras de imagens não devem exceder 45 min para garantir que as medições de intensidade de fluorescência são feitas em tecido vivo, saudável.</li>
		<li>Para cada condição, adquirir imagens pelo menos 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Pós-julgamento: Análise de imagem <ol><li>intensidades de fluorescência medida em células de folículo, PFC e FSCs <ol><li>fundo subtração: <ol><li>Open in natura imagens em FIJI com cada canal em uma janela separada ( a Figura 4).</li>
			<li>Usar a ferramenta retângulo para desenhar uma região de interesse (ROI) na janela do canal pHluorin em uma parte da imagem sem sinal.</li>
			<li>Opcional passo: definir o limite inferior do limiar para que os pixels com valores de intensidade abaixo de fundo são excluídas e definir o limite superior do limiar máximo. Quando o limite é definido desta forma, as áreas da imagem sem sinal em sua maioria são azuis e o sinal é claramente visível ( Figura 4A).</li>
			<li>Medir a intensidade de fluorescência média no ROI. Se o limite foi definido na etapa 3, certifique-se de verificar o &#34; limite de limiar &#34; caixa na caixa de diálogo Definir medições.</li>
			<li>Subtrair a intensidade de fundo medido de cada canal e fatia da imagem usando a função Subtract, encontrada no processo de &#8594; menu matemática.</li>
			<li>3.1.1.2-6 passos de repetição para a janela de canal mCherry exceto que, na etapa 3.1.1.2, em vez de desenhar um novo retângulo com a ferramenta retângulo, use a função de seleção de restauração, encontrado no editar &#8594; menu de seleção, adicionar um retângulo com o mesmo dimensões e posição na imagem.</li>
		</ol></li> <li>FSCs identificar, pFCs e células de folículo: <ol><li>identificar a FSCs, pFCs e células do folículo por morfologia e localização usando o Concanavalina-A coloração para encontrar os limites da célula ( Figura 2).</li>
			<li>FSCs são finas células triangulares localizadas na borda do germarium na fronteira região 2a/2b. Se o mCherry::pHluorin é expresso em um clone do FSC, FSC também pode ser identificado como a célula mais anterior do clone.</li>
			<li>PFC é células de forma irregulares na região 2b, imediatamente adjacente e a jusante da FSCs.</li>
			<li>Folículo são células quadradas ou colunares que cercam o cisto de células germinativas na região 3.</li>
		</ol></li> <li>Obtenção rácios de intensidade de fluorescência <ol><li>escolher uma ou mais fatias no qual a célula de interesse tem maior intensidade de fluorescência no canal de mCherry e certifique-se que a coloração Concanavalina-A, vi no canal de far-red, é em foc Nós dentro da fatia selecionada.</li>
			<li>Desenhar ROI em torno de cada medida a intensidade de fluorescência média de pHluorin e mCherry em todos os gomos escolhida para medições e FSC.</li>
			<li>Dividir a intensidade média de fluorescência do canal pHluorin pela intensidade média de fluorescência do canal mCherry para calcular a proporção de pHluorin para mCherry fluorescência.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>PHi derivar valores e gerar imagens pseudocolored <ol><li>derivar valores de pHi <ol><li>em todos os casos, a curva de regressão linear deve ser gerada usando ovários de moscas com o mesmo genótipo para ambos experimental e controlar as condições. Gere uma curva de regressão linear para cada tipo de célula, usando os dados de duas condições de reserva nigericin ( Figura 3). No Excel, isso pode ser feito plotando os dados em um gráfico e adicionando uma linha de tendência linear. Como alternativa, consulte:</li> <li>uso a inclinação e a interseção y da curva de regressão linear calculados a partir das condições de nigericin e a equação de uma linha (y = mx + b) converter o pHluorin de mCherry relação valores calculados das amostras no bicarbonato de condição para valores de pH. Nesta equação, substituir a forma de inclinação (a intercepção de y) para b, colocar o valor em relação x e resolver para y.</li>
		</ol></li> <li>Gerar uma imagem pseudocolored, refletindo os valores de relação em FIJI.
		<ol><li>, Siga o procedimento acima para subtração de fundo (etapa 3.1.1 e Figura 4).</li>
			<li>Dividir o canal de pHluorin do canal mCherry usando a função de calculadora de imagem, no menu processo. Certifique-se o &#34; criar nova janela &#34; e &#34; resultado de 32-bit (flutuar) &#34; as caixas de seleção são ambos verificadas. Alterar a tabela de pesquisa (LUT), encontrado no menu imagem, térmica ou LUT de escolha. Consulte a Figura 4 para outras opções apropriadas.</li>
			<li>Na caixa de diálogo ajustar brilho e contraste (imagem &#8594; ajuste &#8594; brilho/contraste), clique o &#34; definido &#34; botão. Conjunto o mínimo exibido o valor como 0 e o máximo exibido valor para uma relação que melhor capta os dados, geralmente 1.0-2.0 ( Figura 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um método para medir o pHi de células na linhagem FSC dentro sua tecido. Este protocolo foi desenvolvido e refinado nos últimos cinco anos, desde que primeiro começamos a estudar pHi em tecido ovariano de Drosophila . Durante esse tempo, o protocolo tem sido usado com sucesso por vários investigadores em nosso laboratório e em pelo menos quatro diferentes girando disco e microscópios de exploração do laser. Reprodutibilidade da nossa observação original, que aumenta de pHi como célu...

Estudos recentes revelaram um papel para alterações em pHi durante celular diferenciação e displasia na vivo1,2. Estes estudos encontraram que pHi é notavelmente consistente nas células do mesmo tipo na mesma fase de diferenciação, mas que muda como células de transição de uma fase para outra. Em alguns casos, bloquear as mudanças na pHi parcialmente interrompe a diferenciação, sugerindo que a mudança na pHi não é apenas uma consequência de alterações no destino da célula, mas em vez disso, ajuda a promover a mudança no destino da célula, talvez através de efeitos no pH sensíveis à regulamentação proteínas ou reações químicas necessárias para diferenciação. Futuros estudos têm o potencial para revelar mais a introspecção as muitos papéis diferentes do pHi dinâmica na vivo. No entanto, um dos desafios de estudar pHi durante a diferenciação na vivo é a obtenção de medições precisas de pHi. Ao contrário de outras características de diferenciação, tais como alterações na morfologia celular e expressão gênica, pHi é uma propriedade química lábil da célula que não é preservada em células que foram fixadas e permeabilizadas com métodos padrão. Além disso, pHi pode não ser estável em células que estão estressadas ou morrendo como resultado de manipulação experimental. Assim, é importante manter as células viva e mais saudável possível quando se mede o pHi. Vários corantes vitais estão disponíveis que funcionam bem para medir o pHi de células em cultura3, mas em muitos casos eles não são adequados na vivo estuda porque eles não penetram o tecido profundamente ou uniformemente o suficiente para fornecer medições precisas .
Para contornar o problema da penetração de corantes pobre, nós e os outros usaram uma sonda geneticamente codificada, mCherry::pHluorin4,5,6,7, que pode ser expressa especificamente na célula tipos de interesse e imagem em tecido vivo. pHluorin é uma variante do GFP com uma mais elevada pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) que dobra mais facilmente em um pH mais elevado; Então, a intensidade de fluorescência total emitida por uma população de moléculas de pHluorin na célula aumenta com o aumento de pHi8. Importante, a fluorescência é linear dentro da normalidade citosólica dos valores de pHi. Em contraste, a fluorescência de mCherry (pKa ~ 4.5) é insensível a mudanças de pH dentro do intervalo citosólica. Estes dois repórteres estão covalentemente ligados juntos como uma única proteína quimérico, codificada por um frame de leitura aberto único, para que eles sempre estão presentes em quantidades iguais. Portanto, a relação de pHluorin para mCherry intensidade de fluorescência fornece uma medida da pHi que é normalizado para a concentração de sonda em cada célula. Os rácios podem ser então convertidos a estimativas de valores de pHi usando uma curva padrão que é gerada, obtendo o pHluorin mCherry rácios de tecidos que tenham sido incubados para valores de pH conhecido.
Aqui, descrevemos os métodos para usar o mCherry::pHluorin para medir o pHi da linhagem epitelial de FSC no ovário drosófila . Este tecido bem caracterizado tem sido usado para modelar diversos aspectos da biologia epitelial, tais como células-tronco auto-renovação e diferenciação9,10,11, migração celular coletiva12 , o desenvolvimento e a manutenção da célula polaridade13,14. O epitélio do folículo é produzido por dois FSCs que residem na borda anterior do tecido em uma estrutura chamada de15,o germarium16. Estas células se dividem regularmente durante a vida adulta para auto renovar e produzir descendência, chamadas células prefollicle (PFC), que podem re-introduzir o nicho e se tornar um FSC ou se diferenciar em um dos três tipos de células do folículo diferentes: as células polares, células do caule, ou células do folículo do corpo principal. Mostramos anteriormente que no tecido de sua, o pHi aumenta progressivamente durante os primeiros estágios de diferenciação, de um pHi de aproximadamente 6,8 na FSCs para 7.0 no PFC, para 7,3 em células de folículo2. Bloquear este aumento por RNAi nocaute de um trocador de sódio/próton ubiquitously expressa, DNhe2, severamente prejudica a diferenciação de pFC, Considerando que aumentando pHi superexpressão de DNhe2 provoca uma leve diferenciação em excesso fenótipo. Estes resultados demonstram que pHi estàvel é mantida na linhagem precoce do FSC e experimentalmente que pode ser aumentado ou diminuído na vivo. Os métodos descritos aqui podem ser usados para medir pHi em sua tecido ou várias formas de tecidos mutantes, incluindo knockdown RNAi ou superexpressão usando um Gal4 de interesse e clones mitóticas.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for Buffer preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and mounting tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23-gauge syringe needles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass dissecting dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D mounting chamber</td><td>custom manufactured</td><td></td><td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&amp;times; objective with a numerical aperture of 1.3</td></tr></tbody></table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

Mudanças no pH intracelular (pHi) desempenham um papel importante na regulação de muitas funções celulares, incluindo o metabolismo, proliferação e diferenciação. Normalmente, pHi dinâmica é determinada em culturas de células, que são passíveis de medição e manipular experimentalmente pHi. No entanto, o recente desenvolvimento de novas ferramentas e metodologias tornou possível estudar a dinâmica de pHi no tecido intacto, ao vivo. Para a investigação de Drosophila , um desenvolvimento importante foi a geração de uma linha de transgénica carregando um biossensor pHi, mCherry::pHluorin. Aqui, descrevemos um protocolo que usamos rotineiramente para imagem ao vivo Drosophila ovarioles para medir pHi na linhagem de células-tronco (FSC) folículo epiteliais em linhas transgénicas tipo selvagem de mCherry::pHluorin; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para outros tecidos, incluindo os discos de asa e o epitélio do olho. Descrevemos técnicas para expressar mCherry::pHluorin na linhagem FSC, mantendo o tecido ovariano durante a imagem latente, ao vivo e aquisição e analisando imagens para obter valores de pHi.

Aqui descrevemos o processo de medição pHi no epitélio do folículo, que envolve várias etapas. Primeiro, os ovários são dissecados de moscas do genótipo apropriado usando ferramentas para dissecar e montagem (Figura 1). Os ovarioles são então fotografadas usando microscopia de fluorescência quantitativa e as imagens são analisadas para obter medições de pHi. Para cada imagem, os tipos de células de interesse são identificados conforme descrito...

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Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K visualizações.  University of California, San Francisco. Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.

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Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neurociência

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Uso de células de Drosophila S2 para imagens ao vivo da divisão celular

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genética

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualizando os efeitos do dano oxidativo nas câmaras de ovos de Drosophila usando imagens ao vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Biologia do Desenvolvimento

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

Migração Nuclear no Oócito de Drosophila

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Biologia

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Estudar mitocondrial estrutura e função em<em&gt; Drosophila</em&gt; ovários

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

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