אנו מודים Bryne Ulmschneider על תרומתה הפרוטוקול ואת מספרה דיאן לקבלת הצעות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי מכון הלאומי של בריאות גרנט GM116384 Nystul ת. ג, די. אל הספר.

הערה: כדי למדוד פי בשושלת FSC, לנו לחשב את היחס שבין עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin כדי mCherry, FSCs, pFCs ותאים זקיק בתנאים פיזיולוגיים, ולהמיר את היחס פי ערכים עם תקן עקומות כיול עבור כל תא הקלד 7. הראשון, לחיות ניסויים הדמיה מבוצעות למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית של pHluorin ו mCherry ב germaria גזור לתוך מאגר המכיל NaHCO 3, אשר מחקה בתנאים פיזיולוגיים 1 , 7. הבא, רגיל עקומות מופקים על ידי מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית pHluorin ו- mCherry נה +-K + מאגר המכיל את nigericin ionophore חינם, התרגלו שני ערכי pH שונים, 6.5 ו- 7.5. בנוכחות nigericin, פי equilibrates עם ה-pH של המאגר על פני קרום פלזמה, גורם פי להתאים את ה-pH חוץ-תאית. לבסוף, העיקולים רגילים משמשים כדי להמיר pHluorin mCherry יחסי לערכים פי המשוער.
 1. קדם משפט: הכנה לפני מדידה פי Vivo ב הערה: כדי למדוד פי ויוו, חייב להביע את transgene mCherry::pHluorin בסוג התא עניין. להלן כמה דרכים נפוצות כדי ליצור pHluorin הטרנסגניים זבובים בשושלת FSC. יצירת שיבוטים mCherry::pHluorin שימושי במיוחד לזיהוי FSCs, אשר ממוקמים בקצה הקדמי שיבוט FSC. רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי שימושי למדידת פי על פני הרקמה כולה, והוא גם נוח יותר בעת שילוב עם ביטוי של RNAi או transgene.
<ol><li>דור של pHluorin הטרנסגניים זבובים <ol><li>mCherry::pHluorin-ידי FSC שיבוטים <ol><li>כדי להפוך mCherry::pHluorin FSC שיבוטים, חצו UAS-mCherry::pHluorin 1 flipout Act-Gal4 במלאי או אחרים מניות עם Gal4 inducible Flp/והשפלתם.</li>
			<li>כדי להפוך heatshock inducible שיבוטים, heatshock F1s למבוגרים במשך יומיים לפרסם וגיחתו ב ריקה vials h 1 בתוך אמבט מים 37 ° C, ארבע פעמים כ כל ה 12</li>
			<li>כדי להבטיח צמיחה רגיל שיעור מרבי של oogenesis בתקופה זו, לשמור על זבובים על-ידי מתן שמרים רטובה (בחלקים שווים בקירוב יבש בייקר &#39; s שמרים ומים) מדי יום במשך לפחות 6 ימים לאחר אינדוקציה שיבוט.</li>
		</ol></li> <li>רקמות ספציפיות mCherry::pHluorin ביטוי</li> <li>קרוס UAS-mCherry::pHluorin 1 כדי זקיק תא מנהל ספציפי, 1 w y *; P {GawB} 10930/ארגון הקתולים הצעירים (בלומינגטון מזהה: 7023).</li>
		<li>3 ימים לאחר זבובים להתחיל eclosing, לאסוף ומניחים בקבוקונים המכילים שמרים רטובה, במשך לפחות 24 שעות לפני ניתוח.</li>
	</ol></li> <li>שהופך פתרונות הערה: חשוב להכין המאגרים הבאים ביום של הניסוי, כי ריכוז ה-pH ו ממס במאגר יכולים להשתנות לאורך זמן.
	<ol><li>הכן ביקרבונט, nigericin, ניתוח מאגרי. הוסף הרכיבים לפי הסדר הרשום כדי למנוע היווצרות פוחת משקעים (עיין טבלה 1, בטבלה 2 של טבלה 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. משפט: מדידת פי בשושלת FSC הערה: הקרע, הרכבה והדמיה חי את השלבים עבור המאגר ביקרבונט ותנאי מאגר nigericin שני ייתכן שתצטרך לבצע פעמיים: פעם אחת כדי לקבוע את המיקרוסקופ הגדרות של פעם נוספת כדי לאסוף נתונים ניסיוני. עיין בסעיף 2.2 להלן לקבלת מידע נוסף.
<ol><li>לנתיחה, הרכבה הערה: החומרים הדרושים לביצוע שלב זה עיין באיור 1 ו לטבלה של חומרים. עבור הרכבה מודפס 3D צ'יימברס, ניתנים הקבצים במדפסת תלת-ממד כמו משלימה קובץ 1 ו- 2 קובץ משלים.
	<ol><li>ניתוח: <ol><li>הכן צ'יימברס גובר על-ידי החלת ציפוי דק של גריז ואקום לצד להחמיא של 3D מודפס הרכבה קאמרית. למקם את הצד הזה coverslip 22 x 40 מ מ כדי לאטום את coverslip אל התא הרכבה.</li>
		</ol></li> <li>לנתח השחלות של נקבות הזבוב הבוגר במאגר 500 µL לנתיחה (ביקרבונט או nigericin מאגר, טבלה 3) <ol><li>עזים ומתנגד 3-4 זבובים באמצעות גז 2 CO וזבובים העברה על גבי משטח לטוס perfused עם CO 2 גז-</li>
			<li>להרים של זבוב anesthetized עם מלקחיים ומקום לתוך כלי התקשורת לנתיחה.</li>
			<li>לצבוט את בית החזה של הזבוב עם forcep אחד, בזמן המשוחררים על קצה הבטן שלה עד השחלות שלה חשופים.</li>
			<li>לאחר ניתוק השחלות מן האיברים האחרים, להקניט לגזרים את ovarioles באמצעות 22 1/2 מחטי מזרקים. מעטפת השריר בקפידה נפרד מן השחלות נפרד ovarioles בודדים מהאשכול של ovarioles. טכניקה יעילה כדי לבודד למעטפת השרירים היא להשתמש מחט מזרק אחת כדי להחזיק את האשכול של ovarioles במקום בקצה הקדמי שלו, ולטף כלפי מטה לאורך יחיד ovarioles.</li>
			<li>דגירה את שחלות והטרף בתקשורת לנתיחה בדיוק 10 דקות לפני שתמשיך לשלב הרכבה על כך שאין מספיק זמן פי תאים equilibrate באופן מלא עם ה-pH של התקשורת דיסקציה nigericin. 
			הערה: ודא כי נדן שריר מוסר את ovarioles. שריר נדן עשוי להחליש את האות פלורסצנטיות, מה שהופך את זה קשה לזהות תאים בודדים באמצעות Concanavilin-A, עלול לגרום ovarioles להעביר באופן ספונטני במהלך דימות בשידור חי-</li>
		</ol></li> <li>הרכבה <ol><li>מקום טיפה קטנה של מדיה דיסקציה coverslip זכוכית בתוך החדר הרכבה.</li>
			<li>העברת מופרדים באמצעות מלקחיים ovarioles.</li>
			<li>להפריד תאי ביצה בשלב מאוחר יותר germaria המשויך צ'יימברס ביצה בשלב מוקדם יותר, ולנסות להבטיח germaria גזור ממוקמים במרכז הירידה מדיה לנתיחה.</li>
			<li>להוסיף 2 טיפות קטנות של לק צידי coverslip 12-מ מ עגול, לתת לו אוויר יבש כ-10 ס</li>
			Coverslip <li>מקום בסיבוב על המסירה של דיסקציה המדיה המכילה מופרדים germaria כך את הצד הזה עם לק פונה כלפי מטה ואנשי קשר התקשורת לנתיחה. לחץ כלפי מטה החלקים של הקצה עם לק לשטח ולאבטח את germaria בעמדה. אנו ממליצים על שימוש לק בוגרים כי זה מכפיש פחות על coverslip פני כמו זה המאובטחת במקום.</li>
			<li>למלא תא הרכבה עם מדיה נוספים לנתיחה. מאגר ספציפי תנאי שאינו מכיל צבע Concanavalin-A יכול לשמש כדי למלא התא. 
			הערה: הזמן הכולל בילה לנתח, הרכבה לא יעלה על 15 דקות. זה חשוב למזער את ההשפעות של נזק לרקמות ותא מוות.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>הדמיה בשידור חי: הערה: בשלב זה, קודם לאסוף תמונות מן התנאי ביקרבונט, שני תנאים nigericin כדי לקבוע את הגדרות מיקרוסקופ נכונה; לכוונן את הגדרות מיקרוסקופ לפי הצורך, . ולאחר מכן לאסוף תמונות עבור המידע מהניסוי השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי המסוגל הדמיה 3 ערוצים: GFP (פליטת עירור 475/509), mCherry (575 פליטה עירור/610), ואת מרחיקת אדום (633 עירור/647 פליטה). 
	הערה: ערכת מיקרוסקופ הגדרות: ניתן לכמת עוצמות פיקסל תמונות שנאספו כדי לקבוע את ההערכות של pHi, לכן חשוב כי ערכי העוצמה של האות בערכת כל תמונה היא לא נמוכה מדי ולא רוויים. טווח ממידות ניתן ללכוד תמונה מוגדרת על-ידי עומק הסיביות התמונה. במקרים רבים, תמונות של 8 סיביות נוצרות כברירת מחדל, אך אנו ממליצים על רכישת הנתונים כתמונות 16 סיביות, אשר יש טווח דינאמי רחב יותר. חשוב להבטיח כי crosstalk בין ערוצי פלורסנט ממוזער, אז צריך ניתן להתאים את ההגדרות כך ספקטרום הפליטה שנאסף בכל fluorophore לא חופף. כדי לבדוק את הגדרות אלה, קח תמונה לדוגמה באמצעות הקשת עירור GFP ולאסוף ספקטרום הפליטה של mCherry, ולהיפך. אם ההגדרות הותאמו כהלכה, צריך להיות בלי קליטה בכל מקרה. קבע את הגדרות מיקרוסקופ (כלומר, הגדרות מתח על סריקתה לייזר קונפוקלי, גודל הכוח ואת חריר לייזר) כך פיקסל עוצמות האות כל תמונה שלוש ערכות הם בתוך הטווח הדינמי של קובץ התמונה. עבור כל הניסויים שלנו, השתמשנו לייזר אור לבן מיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד 40 x סורק כדי לרכוש תמונות 16 סיביות בתבנית 1,024 × 1,024, בעוד אנחנו ממוטב מתח הרווח עבור כל ניסוי לפי הצורך. לדוגמה, בניסוי אחד, נוכל להגדיר את הרווח מתח עבור ה-GFP, mCherry, ו מרחיקת אדום כמו 37.8%, 72.9% ו- 260%, בהתאמה.
	<ol><li>התמונה ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 6.5, והתאם את הגדרות כאלה פיקסל עוצמות של תמונות pHluorin ו- mCherry נמוכים, אך לא מתחת לגבולות של זיהוי של המצלמה.</li>
		<li>תמונה קבוצה נוספת של ovarioles במאגר לנתיחה nigericin, ב- pH 7.5 והתאם את ההגדרות כאלה עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry הם גבוהה, אבל לא רוויים.</li>
		<li>השחלות תמונה של ביקרבונט לנתיחה מאגר ולהבטיח כי עוצמות פיקסל תמונות pHluorin ו- mCherry לא רוויים עם ההגדרות שבחרת. אם הפיקסלים רוויים, להתאים את ההגדרות לפי הצורך. 
		הערה: מיקרוסקופ הגדרת פרמטרים עשויות להשתנות בהתבסס על הכיוונון מיקרוסקופ המדויק בשימוש, חייב להיות אופטימיזציה עבור ניסוי. לאחר מיקרוסקופ הוגדרו הגדרות, אל תשנה אותם לאורך כל הניסוי. הגדרות צריכות להיות עקביים על-פני שליטה ומצבים ניסיוני. בניסויים פי הראשונית שלנו, אנחנו שנוצר 2 ו 3 עקומות כיול נקודת nigericin ומצא הבדל משמעותי בין פי מחושב באמצעות כל אחת מהשיטות. עם זאת, באופן כללי, התוספת של יותר נקודות בתוך עקומת כיול יהיה צפוי לשפר את דיוק. לכן, אנו ממליצים להפקת העקומות עם מספר שונה של נקודות כדי לקבוע כמה נדרשים קבוצה נתונה של תנאי הניסוי-</li>
	</ol></li> <li>איסוף נתונים: <ol><li>לבצע ניתוח, הרכבה, והדמיה של הדגימות בתנאים מאגר ביקרבונט ו- nigericin. לאחר ניתוח, הרכבה, הזמן המרבי הדמיה ערכה אחת של דגימות לא יעלה על 45 דקות על מנת להבטיח כי המדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית עשויים ברקמת בשידור חי, בריא.</li>
		<li>עבור כל תנאי, לרכוש תמונות לפחות 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. שלאחר המשפט: ניתוח תמונות <ol><li>למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב FSCs, pFCs, ותאים זקיק <ol><li>רקע חיסור: <ol><li>פתוח לא מעובדת תמונות בפיג'י עם כל ערוץ (בחלון נפרד איור 4C).</li>
			<li>השתמש בכלי מלבן כדי לצייר אזור בעל עניין (ROI) בחלון ערוץ pHluorin בחלק של התמונה ללא האות.</li>
			שלב <li>אופציונלי: להגדיר את הגבול התחתון של הסף כך פיקסלים עם ערכי העוצמה מתחת רקע הם לא נכלל והגדר את הגבול העליון של הסף המרבי. הסף מוגדר באופן זה, האזורים של התמונה ללא האות הם בעיקר כחול, האות הוא נראה בבירור ( איור 4A).</li>
			<li>למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע של רועי. אם הסף הוגדר בשלב 3, הקפד לבדוק &#34; הגבלה על סף &#34; תיבה בתיבת הדו-שיח הגדרת המידות.</li>
			<li>להפחית את עוצמת רקע נמדד מן הערוץ כל פרוסה של התמונה באמצעות הפונקציה הפחת, נמצא בתהליך &#8594; תפריט במתמטיקה-</li>
			<li>חזור על צעדים 3.1.1.2-6 עבור החלון ערוץ mCherry חוץ מזה, בשלב 3.1.1.2, במקום ציור מלבן חדש עם הכלי מלבן, השתמש בפונקציה הבחירה שחזור, נמצאו ערוך &#8594; תפריט הבחירה, כדי להוסיף מלבן עם אותם המידות והמיקום על התמונה.</li>
		</ol></li> <li>FSCs לזהות, pFCs ותאים זקיק: <ol><li>לזהות את FSCs, pFCs ותאים זקיק לפי תאור ומיקום באמצעות ההכתמה Concanavalin-A כדי למצוא תא לגבולות התא ( איור 2).</li>
			<li>FSCs הם תאים משולשים דקים ממוקם על קצה germarium בגבול אזור 2a/2b. אם mCherry::pHluorin מתבטאת של שיבוט FSC, FSC גם ניתן לזהות של התא הקדמי ביותר של השיבוט.</li>
			<li>pFCs הם תאים בצורת לא סדיר ב אזור 2b, מיד בסמוך ויוצאת של FSCs.</li>
			<li>זקיק תאים הם תאים מרובע או טורי המקיפים ציסטה תא הנבט 3 אזור.</li>
		</ol></li> <li>קבלת קרינה פלואורסצנטית יחסי העוצמה <ol><li>בחרו פרוסה אחת או יותר שבו התא של עניין יש עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה בערוץ mCherry ולוודא כי כתמים Concanavalin-A, ראיתי בערוץ מרחיקת אדום, יש foc אותנו בתוך הפרוסה שנבחר.</li>
			<li>לצייר רועי סביב כל FSC ולמדוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע pHluorin ו mCherry כל פרוסות שבחרת למדידות.</li>
			<li>לחלק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע בערוץ pHluorin על ידי עוצמת קרינה פלואורסצנטית אכזרי של הערוץ mCherry כדי לחשב יחס של pHluorin כדי mCherry זריחה.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Derive פי ערכים, ליצור תמונות pseudocolored <ol><li>Derive פי ערכים <ol><li>בכל המקרים, העקומה רגרסיה ליניארית צריך להיווצר באמצעות שימוש השחלות מהזבובים של גנוטיפ באותה לשניהם ניסיוני ולשלוט תנאים. יוצרות עקומה רגרסיה ליניארית לכל סוג התא באמצעות הנתונים nigericin שני מאגר תנאים ( איור 3). ב- Excel, זה יכול להיעשות על-ידי התוויית הנתונים על גרף והוספת קו מגמה ליניארי. לחלופין, לראות:</li> <li>שימוש המדרון וחיתוך y של העקומה רגרסיה ליניארית שמחושבים התנאים nigericin, המשוואה של קו (y = mx + b) כדי להמיר את pHluorin mCherry יחס ערכי שמחושבים דוגמאות ביקרבונט מצב ערכי pH. במשוואה הזו, תחליף את הטופס מדרון (החיתוך-y) b, לשים את הערך יחס עבור x ו לפתור עבור י'</li>
		</ol></li> <li>ליצור תמונת pseudocolored המשקף את ערכי יחס בפיג'י.
		<ol><li>בצע ההליך לעיל על רקע חיסור (שלב 3.1.1 ואיור 4).</li>
			<li>לחלק את הערוץ pHluorin מערוץ mCherry באמצעות הפונקציה תמונת מחשבון, למצוא בתפריט תהליך. ודא &#34; יצירת חלון חדש &#34; ו &#34; 32-bit (float) תוצאה &#34; תיבות סימון מסומנות שתיהן. לשנות את טבלת בדיקת מידע (LUT), נמצאו תחת תפריט תמונה, תרמית או LUT של בחירה. ראה איור 4 אפשרויות מתאימים אחרים.</li>
			<li>כוונון הבהירות והניגודיות בתיבת הדו-שיח (תמונה &#8594; התאם &#8594; בהירות/ניגודיות), לחץ על &#34; להגדיר &#34; לחצן. קבע המינימום מוצג הערך 0 ותוצג המרבי ערך לכל יחס הטובים ביותר לוכדת את הנתונים, בדרך כלל 1.0-2.0 ( איור 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH.">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li><li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling.">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+pH+probes.">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches.">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li><li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+stem+cell+niches:+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation.">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li><li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia:+parallels+and+diversity.">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li><li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells.">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li><li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement.">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה למדידת על פי של תאים בשושלת FSC בתוך רקמת wildtype. פרוטוקול זה פותחה, מעודן בחמש השנים האחרונות, מאז אנחנו הראשונים החלו ללמוד פי ברקמת השחלה דרוזופילה . במהלך זמן זה, הפרוטוקול שימש בהצלחה על ידי מספר חוקרים במעבדה שלנו, על פחות ארבעה דיסק מסתובב שונים ועל סריקת מיקרוסק...

מחקרים שנעשו לאחרונה חשף תפקיד לשינויים בפי פי במהלך תאית התמיינות ו דיספלסיה ויוו1,2. מחקרים אלה מצאו שאת פי מתאים להפליא בתאים מאותו סוג בשלב זהה של בידול, אבל זה היא משתנה תוך תאי מעבר משלב אחד למשנהו. במקרים מסוימים, חוסמת חלקית את השינויים בפי פי משבש בידול, טוען כי השינוי שחל פי היא לא רק תוצאה של שינויים בגורל תא אבל במקום זה מסייע לקדם את השינוי בגורל תא, אולי דרך אפקטים על pH רגיש רגולטוריות חלבונים או התגובות הכימיות הדרושות עבור בידול. מחקרים עתידיים יש פוטנציאל כדי לחשוף עוד תובנות התפקידים השונים רבים של pHi dynamics ויוו. עם זאת, אחד האתגרים של הלומדים פי במהלך התמיינות ויוו הוא קבלת מדידות מדויקות של פי פי. שלא כמו תכונות אחרות של בידול, כגון שינויים מורפולוגיה הסלולר וכן ביטוי גנים, pHi הוא נכס כימי יציב של התא זה אינו נשמר בתאים קבוע, permeabilized בשיטות הרגילות. בנוסף, פי ייתכן יציב בתאים לחוצה או גוסס כתוצאה מניפולציה ניסויית. לכן חשוב לשמור תאים חי ובריא ככל האפשר כאשר מודדים את פי. מספר צבעי חיוני זמינות עבודה טוב עבור מדידה על פי של תאים תרבות3, אבל ברבות המקרים הם אינם מתאימים עבור ויוו מחקרים כי הם לא לחדור הרקמות עמוק או באופן שווה מספיק כדי לספק מדידות מדויקות .
כדי לעקוף את הבעיה של חדירה צבע עניים, אנחנו ואחרים השתמשו בדיקה גנטית מקודד, mCherry::pHluorin4,5,6,7, זה יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בתא סוגים של הדמיה של רקמת חיים ועניין. pHluorin הוא וריאציה של GFP עם pKa גבוה יותר (~ 7.0 לעומת ~ 4.0) זה מתקפל בקלות רבה יותר ב- pH גבוה יותר; אז עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל הנפלטים אוכלוסייה של pHluorin מולקולות בתא עולה עם הגדלת פי8. חשוב, הוא ליניארי בטווח הנורמלי cytosolic פי ערכים. לעומת זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של mCherry (pKa ~ 4.5) חסר רגישות לשינויים pH בטווח cytosolic. אלה שני הכתבים covalently מקושרים ביחד כמו חלבון chimeric יחיד, מקודד על ידי מסגרת קריאה פתוחה יחיד, ולכן הם תמיד נוכחים בכמויות שוות. לכן, היחס בין pHluorin ל mCherry עוצמת קרינה פלואורסצנטית מספק מדידה על פי זה הוא מנורמל לריכוז בדיקה בכל תא. ניתן להמיר את היחס אז הערכות של פי ערכים באמצעות עיקול רגיל שנוצר על ידי השגת את pHluorin אל mCherry יחס רקמות זה יש כבר equilibrated לערכים הידועים pH.
כאן, אנו מתארים את שיטות השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי של שושלת היוחסין FSC אפיתל בשחלה דרוזופילה . רקמת מאופיין היטב זה שימש לדגם היבטים שונים של ביולוגיה אפיתל, כגון תאי גזע התחדשות עצמית ובידול9,10,11, נדידת תאים קולקטיבית12 , ולא פיתוח ותחזוקה של התא קוטביות13,14. האפיתל זקיק מופק על ידי שני FSCs אשר שוכנים בקצה הקדמי של הרקמה במבנה הנקרא ה15,germarium16. תאים אלה לחלק באופן קבוע במהלך הבגרות עצמית לחדש ולייצר רומא, שנקרא prefollicle תאים (pFCs), באפשרותך להזין מחדש את הנישה, הופכים FSC או להבדיל לאחד שלושה סוגי תאים שונים זקיק: קוטב תאים, התאים גבעול, או תאי הגוף הראשי זקיק. הראנו קודם לכן זה ברקמת wildtype, שפי עולה בהתמדה במהלך השלבים הראשונים של בידול, בין פי של 6.8 ב FSCs אל 7.0 ב pFCs, 7.3 התאים זקיק2. חסימת עלייה זו על ידי RNAi נוקאאוט של כאמצעי ביטוי ubiquitously נתרן/פרוטון חילופי, DNhe2, קשות פוגע בידול pFC, ואילו להגדיל פי על ידי ביטוי של DNhe2 גורם מתון הבחנה עודף פנוטיפ. ממצאים אלה מדגימים כי פי נשמרת stably בשושלת FSC מוקדם, כי זה יכול להיות השפעול מוגדל או מוקטן ויוו. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי למדוד את פי wildtype רקמות או צורות שונות של רקמות מוטציה, לרבות RNAi נוקאאוט או ביטוי באמצעות של Gal4 של עניין, mitotic שיבוטים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for Buffer preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and mounting tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23-gauge syringe needles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass dissecting dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D mounting chamber</td><td>custom manufactured</td><td></td><td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&amp;times; objective with a numerical aperture of 1.3</td></tr></tbody></table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

שינויים ב- pH תאיים (פי) תפקיד חשוב בוויסות תאיים רבים, כולל מטבוליזם, התפשטות של בידול. בדרך כלל, דינמיקה פי נקבעים בתאים בתרבית, אשר נתונות מדידה וטיפול השפעול pHi. עם זאת, ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיות וכלים חדשים איפשרה בחקר דינמיקה פי בתוך רקמת ללא פגע, בשידור חי. דרוזופילה מחקר, פיתוח חשוב אחד היה הדור של קו הטרנסגניים נושאת ביוסנסור על פי, mCherry::pHluorin. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול בהם אנו עושים שימוש שגרתי הדמיה ovarioles דרוזופילה בשידור חי כדי למדוד את פי בשושלת זקיק אפיתל תאי גזע (FSC) בקווים הטרנסגניים פראי סוג mCherry::pHluorin; עם זאת, בשיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות בשביל לרקמות אחרות, כולל דיסקים כנף עין האפיתל. אנו מתארים שיטות לביטוי mCherry::pHluorin בשושלת FSC, שמירה על רקמות השחלה במהלך חיים הדמיה, ואת רכישת וניתוח תמונות כדי להשיג פי ערכי.

כאן תארנו את התהליך של מדידת פי בתוך האפיתל זקיק, אשר כרוך במספר שלבים. ראשית, השחלות הן גזור מהזבובים של גנוטיפ המתאים באמצעות כלים לנתח, הרכבה (איור 1). Ovarioles ואז הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות כמותית, הדימויים מנותחות לקבל מדידות של פי פי. עבור כל ?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכי העוצמה פלורסצנטיות ערכי pH.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K Views.  University of California, San Francisco. אנו מספקים פרוטוקול הדמיה רמת החומציות תאיים של שושלת היוחסין תאי אפיתל ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי. אנו מתארים שיטות כדי ליצור זבובים הטרנסגניים לבטא ביוסנסור pH, mCherry::pHluorin, התמונה החיישן באמצעות הדמיה פלורסצנטיות כמותית, ליצור עקומות רגיל ו להמיר ערכ?...

Video: Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neuroscience

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetics

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Biology

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי<em&gt; תסיסנית</em&gt; שחלות

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video