Ringraziamo Bryne Ulmschneider per i contributi per il protocollo e Diane Barber per suggerimenti sul manoscritto. Quest'opera è stata finanziata da un Istituto nazionale di sovvenzione di salute GM116384 a T.G. Nystul e D.L. Barber.

Nota: per misurare pHi del lignaggio di FSC, noi calcolare il rapporto di intensità di fluorescenza di pHluorin a mCherry in FSCs, PFC e le cellule del follicolo in condizioni fisiologiche e convertire i rapporti in valori di pHi con standard curve di calibrazione per ogni cella tipo 7. Primi, live imaging esperimenti sono effettuati per misurare l'intensità di fluorescenza di pHluorin e mCherry in germaria dissecato in un tampone contenente NaHCO 3, che simula condizioni fisiologiche 1 , 7. prossime, standard curve sono generate dalla misura pHluorin e mCherry intensità di fluorescenza in un Na +-libero, K + tampone contenente la Nigericina ionoforo regolato a due valori di pH diversi, 6.5 e 7.5. In presenza di Nigericina, pHi equilibra con il pH del tampone attraverso la membrana plasmatica, causando pHi abbinare il pH extracellulare. Infine, le curve standard vengono utilizzate per convertire pHluorin ai rapporti mCherry ai valori stimati pHi.
 1. pre-Trial: pHi preparazione prima di misurare In Vivo Nota: per misurare pHi in vivo, il transgene mCherry::pHluorin deve essere espresso nel tipo di cella di interesse. Di seguito sono alcuni dei modi comuni per generare transgenici pHluorin mosche del lignaggio di FSC. Generazione di cloni di mCherry::pHluorin è particolarmente utile per identificare FSCs, che si trovano sul bordo anteriore di un clone FSC. Espressione tessuto specifica mCherry::pHluorin è utile per misurare pHi attraverso l'intero tessuto ed è anche più conveniente quando si combinano con l'espressione di un RNAi o transgene.
<ol><li>Voli della generazione di transgenici pHluorin <ol><li>mCherry::pHluorin-etichettati FSC cloni <ol><li>fare mCherry::pHluorin FSC cloni, attraversare UAS-mCherry::pHluorin 1 a un atto-Gal4 flipout o di altro magazzino con un Flp/FRT viscoelastica Gal4.</li>
			<li>Per rendere heatshock cloni inducibili, heatshock F1s adulti per 2 giorni post eclosion in flaconcini vuoti per 1 h a bagnomaria a 37 ° C, quattro volte circa ogni 12 h.</li>
			<li>Per garantire la normale crescita e tassi massimi di oogenesi durante questo periodo, mantenere mosche fornendo lievito fresco bagnato (parti approssimativamente uguali a secco baker &#39; s lievito e acqua) al giorno per almeno 6 giorni dopo l'induzione di clone.</li>
		</ol></li> <li>Espressione tessuto specifica mCherry::pHluorin</li> <li>Cross UAS-mCherry::pHluorin 1 a un follicolo cella driver specifico, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).</li>
		<li>3 giorni dopo mosche avviato schiusura, raccogliere e metterli in flaconcini contenenti lievito bagnato, per almeno 24 h prima della dissezione.</li>
	</ol></li> <li>Rendendo le soluzioni Nota: è importante preparare i buffer seguenti il giorno dell'esperimento, perché le concentrazioni di pH e soluto nel buffer possono cambiare nel tempo.
	<ol><li>Preparare buffer bicarbonato, Nigericina e dissezione. Aggiungere i componenti nell'ordine elencato per evitare la formazione di precipitati (vedere tabella 1, tabella 2 e tabella 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Trial: Misurazione pHi del lignaggio di FSC Nota: la dissezione, montaggio e dal vivo imaging passaggi per la soluzione tampone del bicarbonato e le due condizioni di buffer Nigericina potrebbe essere necessario essere eseguita due volte: una volta per determinare il microscopio impostazioni e una seconda volta per raccogliere i dati sperimentali. Vedere la sezione 2.2 qui sotto per ulteriori informazioni.
<ol><li>Dissezione e montaggio Nota: per i materiali necessari per eseguire questa operazione fare riferimento alla Figura 1 e Tabella materiali. Per le camere di montaggio stampato 3D, stampante 3D file vengono forniti come supplementare File 1 e 2 File supplementari.
	<ol><li>Dissezione: <ol><li>chambers montaggio Prepare applicando un sottile strato di grasso per vuoto al lato più piatto del 3D stampato camera di montaggio. Collocare quel lato su un vetrino coprioggetti 22 x 40 mM per sigillare il coprioggetto alla camera montaggio.</li>
		</ol></li> <li>Sezionare le ovaie da mosche adulte femminile in 500 µ l di tampone di dissezione (buffer di bicarbonato o Nigericina, tabella 3) <ol><li>anestetizzare 3-4 mosche usando gas di CO 2 e trasferimento vola su un blocchetto di volare irrorato con CO 2 gas.</li>
			<li>Pick up una Mosca anestetizzata con forcipe e posto nel supporto di dissezione.</li>
			<li>Pizzicare il torace della Mosca con una pinza, mentre tirando sulla punta del suo addome, fino a quando le ovaie sono esposti.</li>
			<li>Dopo aver scollegato le ovaie da altri organi, prendono in giro a pezzi il ovarioles utilizzando 22 1/2 aghi di siringhe. Accuratamente separato il muscolo guaina da ovaie e ovarioles individuale separato dal cluster di ovarioles. Una tecnica efficace per isolare la guaina del muscolo è quello di utilizzare una siringa per tenere il cluster di ovarioles posto alla sua estremità anteriore e corsa verso il basso lungo la lunghezza del singolo ovarioles.</li>
			<li>Incubare le ovaie dissecate nei media di dissezione per esattamente 10 min prima di procedere con il passo di montaggio affinché ci sia tempo sufficiente per il pHi di cellule completamente equilibrare con il pH dei media dissezione Nigericina. 
			Nota: Assicurarsi che la guaina del muscolo viene rimosso dall'ovarioles. La guaina del muscolo può attenuare il segnale di fluorescenza, che lo rende difficile identificare singole celle utilizzando Concanavilin-A e può causare ovarioles muoversi spontaneamente durante la formazione immagine live.</li>
		</ol></li> <li>Di montaggio <ol><li>mettere una piccola goccia di media di dissezione sul vetrino coprioggetti all'interno della camera di montaggio.</li>
			<li>Trasferimento separati usando il forcipe ovarioles.</li>
			<li>Separare più tardi chambers di uovo di fase da germaria associato con gli alloggiamenti di uovo fase precedente e cercare di garantire che il germaria dissecata sono collocati al centro della goccia media dissezione.</li>
			<li>Aggiungere due piccole gocce di smalto ai lati opposti di un tondo 12mm vetrino coprioggetto e lasciarlo asciugare per circa 10 s.</li>
			<li>Posto al turno coprioggetto sul drop di file multimediali di dissezione contenenti separati germaria tale che quel lato con smalto rivolto verso il basso e contatta il supporto di dissezione. Premere verso il basso sulle parti del bordo con smalto per unghie per appiattire e garantire la germaria in posizione. Si consiglia di utilizzare il vecchio smalto perché esso strisci meno sopra la superficie del coprivetrino come è stato fissato in luogo.</li>
			<li>Riempire la camera di montaggio con supporto di ulteriori dissezione. Buffer specifico a condizione che non contenga concanavalina-un colorante può essere utilizzato per riempire la camera. 
			Nota: Il tempo totale trascorso da dissezione e montaggio non deve superare i 15 min. Questo è importante per ridurre al minimo gli effetti del danno tissutale e morte cellulare.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Live imaging: Nota: In questo passaggio, prima di raccogliere immagini dalla condizione di bicarbonato e le due condizioni di Nigericina per determinare le impostazioni di microscopio corretto; regolare le impostazioni di microscopio come necessario, e poi raccogliere immagini per i dati sperimentali. Utilizzare un microscopio confocale capace di imaging a 3 canali: GFP (475 eccitazione/509 emissione), mCherry (575 emissione di eccitazione/610) e da' (633 eccitazione/647 emissione). 
	Nota: Le impostazioni del microscopio Set: le intensità di pixel delle immagini raccolte saranno quantificate per determinare le stime di pHi, quindi è importante che i valori di intensità del segnale in ogni set di immagine è né troppo basso né saturo. La gamma di intensità che può essere catturata in un'immagine è definita dalla profondità di bit di immagine. In molti casi, immagini a 8 bit vengono generati per impostazione predefinita, ma si consiglia di acquisire i dati come immagini a 16 bit, che hanno una gamma dinamica più ampia. È importante garantire che la diafonia tra i canali fluorescente è ridotto al minimo, quindi le impostazioni dovrebbero essere regolate in modo che lo spettro di emissione raccolti da ogni fluoroforo non si sovrappongono. Per verificare queste impostazioni, prendere un'immagine di esempio utilizzando lo spettro di eccitazione per GFP e raccogliere nello spettro di emissione per mCherry e viceversa. Se le impostazioni sono state regolate correttamente, non ci dovrebbe essere nessun segnale in entrambi i casi. Impostare le impostazioni di microscopio (cioè, le impostazioni di tensione su una scansione laser confocale, laser potenza e pinhole dimensioni) affinché le intensità di pixel del segnale in tutti gli insiemi di tre immagini sono all'interno della gamma dinamica del file immagine. Per tutti i nostri esperimenti, abbiamo utilizzato un laser luce bianco microscopio confocale con un obiettivo 40x di acquisire immagini a 16 bit in 1.024 × 1.024 formato, mentre abbiamo ottimizzato il guadagno di tensione per ogni esperimento come necessario. Ad esempio, in un esperimento, abbiamo impostato il guadagno di tensione per GFP, mCherry e da' come 37,8% 72.9% e 260%, rispettivamente.
	<ol><li>Immagine ovarioles nel buffer di dissezione Nigericina a pH 6,5 e regolare le impostazioni di tale intensità di pixel delle immagini pHluorin e mCherry sono basse, ma non sotto i limiti di rilevazione della fotocamera.</li>
		<li>Un altro set di ovarioles nel buffer di dissezione Nigericina a pH 7.5 di immagine e regolare le impostazioni in modo che le intensità di pixel delle immagini pHluorin e mCherry sono alti, ma non saturo.</li>
		Ovaie di immagine <li>nella dissezione di bicarbonato nel buffer e garantiscono che le intensità di pixel delle immagini pHluorin e mCherry non sono saturi con le impostazioni scelte. Se i pixel sono saturi, regolare le impostazioni come necessario. 
		Nota: Microscopio impostazione parametri possono differire basato sulla messa a punto esatta microscopio utilizzato e deve essere ottimizzata per ogni esperimento. Dopo aver impostate le impostazioni microscopio, non cambiare per il resto dell'esperimento. Le impostazioni dovrebbero essere coerenti tra controllo e condizioni sperimentali. Nei nostri esperimenti iniziali pHi, abbiamo generato le curve di calibrazione Nigericina punto 2 e 3 e abbiamo trovato alcuna differenza significativa tra pHi calcolata utilizzando entrambi i metodi. Tuttavia, in generale, l'aggiunta di ulteriori punti della curva di calibrazione dovrebbe migliorare l'accuratezza. Si consiglia pertanto, generando curve con un diverso numero di punti per determinare quanti sono necessari per un determinato insieme di condizioni sperimentali.</li>
	</ol></li> <li>Raccolta dei dati: <ol><li>eseguire la dissezione, montaggio e imaging dei campioni nelle condizioni di buffer bicarbonato e Nigericina. Dopo dissezione e montaggio, il tempo massimo trascorso un set di campioni di imaging non deve superare 45 min per garantire che le misure di intensità di fluorescenza sono realizzate in tessuto sano, live.</li>
		<li>Per ogni condizione, acquisizione di immagini per almeno 5 germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Post-trial: Analisi delle immagini <ol><li>intensità di fluorescenza di misura in FSCs, PFC e le cellule del follicolo <ol><li>sfondo sottrazione: <ol><li>Open non trasformati immagini in FIJI con ogni canale in una finestra separata ( Figura 4).</li>
			<li>Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare un'area di interesse (ROI) nella finestra del canale pHluorin in una parte dell'immagine senza segnale.</li>
			Passo <li>opzionale: impostare il limite inferiore della soglia in modo che i pixel con valori di intensità sotto sfondo sono esclusi e impostare il limite massimo della soglia massima. Quando la soglia è impostata in questo modo, le aree dell'immagine senza segnale sono per lo più blue e il segnale è chiaramente visibile ( Figura 4A).</li>
			<li>Misura l'intensità media di fluorescenza nel ROI. Se la soglia è stata impostata nel passaggio 3, assicuratevi di controllare il &#34; limite di soglia &#34; casella nella finestra di dialogo impostare misure.</li>
			<li>Sottrarre l'intensità di fondo misurata da ogni canale e la fetta dell'immagine utilizzando la funzione Subtract, trovata nel processo &#8594; menu di Math.</li>
			<li>Ripetere passaggi 3.1.1.2-6 per la finestra del canale mCherry tranne che, nel passaggio 3.1.1.2, invece di disegnare un nuovo rettangolo con lo strumento rettangolo, utilizzare la funzione di selezione di ripristino, trovato nella finestra modifica &#8594; menu di selezione, per aggiungere un rettangolo con lo stesso dimensioni e posizione sull'immagine.</li>
		</ol></li> <li>Identificare FSCs, PFC e le cellule del follicolo: <ol><li>identificare il FSCs, PFC e le cellule del follicolo di morfologia e posizione utilizzando la macchiatura della concanavalina-A trovare limiti di cella ( Figura 2).</li>
			<li>FSCs sono sottili celle triangolari situate sul bordo del germarium al confine di regione 2a/2b. Se mCherry::pHluorin è espresso in un clone FSC, FSC può essere identificata anche come la maggior parte delle cella anteriore del clone.</li>
			<li>PFC sono cellule a forma irregolare nella regione 2b, immediatamente adiacente e a valle del FSCs.</li>
			<li>Le cellule del follicolo sono quadrate o colonnare cellule che circondano la ciste delle cellule di germe in regione 3.</li>
		</ol></li> <li>Ottenuto fluorescenza intensità quozienti <ol><li>scegliere una o più sezioni in cui la cella di interesse ha la più alta intensità di fluorescenza nel canale mCherry e assicurarsi che la concanavalina-A colorazione, visto nel canale da', sia nel foc noi all'interno della slice selezionata.</li>
			<li>ROI disegnare intorno ogni FSC e misura l'intensità media di fluorescenza di pHluorin e mCherry in tutte le fette selezionata per misurazioni.</li>
			<li>Dividere l'intensità media di fluorescenza del canale pHluorin dall'intensità media di fluorescenza del canale mCherry per calcolare un rapporto di pHluorin a fluorescenza mCherry.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>PHi derivare valori e generare immagini pseudocolored <ol><li>valori pHi Derive <ol><li>In tutti i casi, la curva di regressione lineare deve essere generata utilizzando ovaie da mosche dello stesso genotipo per entrambi sperimentale e condizioni di controllo. Generare una curva di regressione lineare per ogni tipo di cellula utilizzando i dati da due condizioni di buffer Nigericina ( Figura 3). In Excel, questo può essere fatto tracciare i dati in un grafico e aggiungendo una linea di tendenza lineare. In alternativa, vedere:</li> <li>uso la pendenza e l'intercetta y della curva di regressione lineare calcolate dalle condizioni Nigericina e l'equazione di una retta (y = mx + b) per convertire il pHluorin mCherry rapporto valori calcolati dai campioni nel bicarbonato condizione per valori di pH. In questa equazione, sostituire il modulo di pendenza (l'intercetta y) per b, immettere il valore rapporto per x e risolvere per y.</li>
		</ol></li> <li>Generare un'immagine pseudocolored che riflette i valori di rapporto in FIJI.
		<ol><li>Seguire la procedura descritta sopra per sottrazione di sfondo (passaggio 3.1.1 e Figura 4).</li>
			<li>Divide il canale di pHluorin dal canale mCherry utilizzando la funzione di immagine calcolatrice, trovata nel menu processo. Essere sicuro che il &#34; finestra Crea nuovo &#34; e &#34; risultato a 32 bit (float) &#34; caselle di controllo siano entrambe selezionate. Modificare la tabella di ricerca (LUT), trova nel menu immagine, termico o LUT di scelta. Vedere la Figura 4 per altre opzioni adatte.</li>
			<li>Nella finestra di dialogo Regola luminosità e contrasto (immagine &#8594; regolare &#8594; luminosità/contrasto), fare clic il &#34; Set &#34; pulsante. Set minimo visualizzato valore su 0 e il massimo valore visualizzato in un rapporto che meglio cattura i dati, solitamente 1.0-2.0 ( Figura 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo un metodo per misurare il pHi di cellule del lignaggio di FSC all'interno del tessuto wildtype. Questo protocollo è stato sviluppato e perfezionato negli ultimi cinque anni, da quando abbiamo iniziato a studiare pHi in tessuto ovarico di Drosophila . Durante quel tempo, il protocollo è stato utilizzato con successo da più ricercatori nel nostro laboratorio e su almeno quattro diversi filatura disc e microscopi a scansione laser. La riproducibilità della nostra osservazione originale, che pHi...

Studi recenti hanno rivelato un ruolo per le modifiche a pHi durante cellulari displasia e differenziazione in vivo1,2. Questi studi hanno trovato che pHi è notevolmente coerenti in cellule dello stesso tipo nella stessa fase di differenziazione, ma che cambia come le cellule di transizione da una fase a altra. In alcuni casi, bloccando le modifiche a pHi parzialmente sconvolge la differenziazione, suggerendo che il cambiamento a pHi non è solo una conseguenza di cambiamenti nel destino della cellula ma invece aiuta a promuovere il cambiamento nel destino della cellula, magari attraverso effetti sulla regolamentazione sensibili al pH proteine o reazioni chimiche necessarie per la differenziazione. Gli studi futuri hanno il potenziale per rivelare più comprensione nei molti ruoli diversi di pHi dynamics in vivo. Tuttavia, una delle sfide di studiare pHi durante il differenziamento in vivo è ottenere misurazioni accurate di pHi. A differenza di altre caratteristiche di differenziazione, quali i cambiamenti nella morfologia cellulare e l'espressione genica, pHi è una proprietà chimica labile della cella che non viene mantenuta in cellule che sono stati corretti e permeabilizzate con metodi standard. Inoltre, pHi può non essere stabile in cellule che sono stressate o morente a seguito di manipolazione sperimentale. Pertanto, è importante mantenere le cellule in vivo e sano come possibile durante la misurazione pHi. Diversi coloranti vitali sono disponibili che funzionano bene per misurare il pHi di cellule in cultura3, ma in molti casi essi non sono adatti per in vivo studi perché non penetrano il tessuto profondamente o uniformemente abbastanza per fornire misurazioni accurate .
Per aggirare il problema della penetrazione del colorante scadente, noi ed altri abbiamo usato una sonda codificata geneticamente, mCherry::pHluorin4,5,6,7, che può essere espressa in particolare nella cella tipi di interesse e imaged in tessuto vivo. pHluorin è una variante del GFP con un pKa più alto (~ 7.0 vs ~ 4.0) che si piega più facilmente a pH più alto; così l'intensità di fluorescenza totale emessa da una popolazione di molecole di pHluorin nella cella aumenta con l'aumentare di pHi8. D'importanza, la fluorescenza è lineare nel range di normalità citosolico di valori di pHi. In contrasto, la fluorescenza della mCherry (pKa ~ 4.5) è insensibile ai cambiamenti di pH all'interno della gamma citosolica. Questi due giornalisti sono covalentemente insieme come una singola proteina chimerica, codificata da un telaio di sola lettura aperta, in modo che sempre sono presenti in quantità uguali. Di conseguenza, il rapporto di pHluorin per l'intensità di fluorescenza mCherry fornisce una misura del pHi che è normalizzato per la concentrazione di sonda in ogni cella. I rapporti possono quindi essere convertiti alle stime dei valori di pHi utilizzando una curva standard che viene generata ottenendo il pHluorin ai rapporti mCherry da tessuti che sono stati equilibrati a valori di pH noto.
Qui, descriviamo i metodi per l'utilizzo di mCherry::pHluorin per misurare il pHi del lignaggio FSC epiteliale nell'ovaia di Drosophila . Questo tessuto ben caratterizzato è stato utilizzato per modellare i diversi aspetti della biologia, epiteliale, quali cellule staminali auto-rinnovamento e differenziazione9,10,11, migrazione cellulare collettiva12 , lo sviluppo e la manutenzione del cellulare polarità13,14. L'epitelio del follicolo è prodotto da due FSCs che risiedono al bordo anteriore del tessuto in una struttura denominata il germarium15,16. Queste cellule si dividono regolarmente durante l'età adulta di auto-rinnovarsi e produrre prole, chiamate cellule prefollicle (PFC), che possono immettere nuovamente la nicchia e diventare un FSC o differenziarsi in uno dei tre tipi di cellule del follicolo diversi: polare cellule, cellule di gambo, o cellule del follicolo di corpo principale. Abbiamo indicato precedentemente che nel tessuto wildtype, il pHi aumenta costantemente durante le prime fasi di differenziazione, da un pHi di circa 6.8 in FSCs a 7.0 in PFC, a 7,3 nel follicolo celle2. Bloccando questo aumento di RNAi atterramento di uno scambiatore sodio/protone espressa ubiquitariamente, DNhe2, severamente altera la differenziazione di pFC, considerando che l'aumento di pHi di sovraespressione di DNhe2 provoca una lieve differenziazione in eccesso fenotipo. Questi risultati dimostrano che pHi è mantenuto stabile nel lignaggio FSC precoce e che può essere sperimentalmente aumentata o diminuita in vivo. I metodi descritti qui possono essere utilizzati per misurare pHi in tessuto wildtype o varie forme di tessuti mutante, compreso atterramento di RNAi o sovraespressione utilizzando un Gal4 di interesse e cloni mitotici.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for Buffer preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and mounting tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23-gauge syringe needles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass dissecting dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D mounting chamber</td><td>custom manufactured</td><td></td><td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&amp;times; objective with a numerical aperture of 1.3</td></tr></tbody></table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

Variazioni di pH intracellulare (pHi) svolgono i ruoli importanti nella regolazione di molte funzioni cellulari, compreso il metabolismo, proliferazione e differenziazione. In genere, pHi dinamiche sono determinati in cellule coltivate, suscettibili di misurazione e manipolando sperimentalmente pHi. Tuttavia, il recente sviluppo di nuovi strumenti e metodologie ha permesso di studiare pHi dinamica all'interno del tessuto intatto, vivo. Per la ricerca di Drosophila , uno sviluppo importante è stata la generazione di una linea transgenica che trasportano un biosensore pHi, mCherry::pHluorin. Qui, descriviamo un protocollo che usiamo abitualmente per formazione immagine dal vivo della drosofila ovarioles per misurare pHi del lignaggio di cellule staminali (FSC) epiteliali del follicolo in mCherry::pHluorin linee transgeniche wild-type; Tuttavia, i metodi descritti qui possono essere facilmente adattati per altri tessuti, compreso i dischi di ala e dell'epitelio dell'occhio. Descriviamo tecniche per esprimere mCherry::pHluorin del lignaggio di FSC, mantenimento del tessuto ovarico durante il live di imaging e acquisire ed analizzare le immagini per ottenere i valori di pHi.

Qui abbiamo descritto il processo di misurazione pHi nell'epitelio del follicolo, che prevede diversi passaggi. In primo luogo, le ovaie vengono sezionate da mosche del genotipo appropriato utilizzando strumenti per dissezione e montaggio (Figura 1). Le ovarioles sono quindi Imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza quantitativa e le immagini vengono analizzati per ottenere misurazioni di pHi. Per ogni immagine, i tipi di cellule di interesse vengono ...

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Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Forniamo un protocollo per l'imaging di pH intracellulare di una stirpe delle cellule staminali epiteliali in vivo tessuto ovarico di Drosophila . Descriviamo i metodi per generare mosche transgenici che esprimono un biosensore pH, mCherry::pHluorin, immagine biosensore usando la formazione immagine di fluorescenza quantitativa, generare curve standard e convertire i valori di intensità di fluorescenza per valori di pH.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K Views.  University of California, San Francisco. Forniamo un protocollo per l'imaging di pH intracellulare di una stirpe delle cellule staminali epiteliali in vivo tessuto ovarico di Drosophila . Descriviamo i metodi per generare mosche transgenici che esprimono un biosensore pH, mCherry::pHluorin, immagine biosensore usando la formazione immagine di fluorescenza quantitativa, generare curve standard e convertire i valori di intensità di fluorescenza per valori di pH.

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biologia

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Neuroscienze

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l&#39;imaging dal vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

L&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; Drosophila</em&gt; Follicolo isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Riepilogo

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Live-imaging del

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Immagini dal vivo di

Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila

Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l'imaging dal vivo

Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in

L'utilità della fase-specifici medio-tardiva

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

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Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Immagini dal vivo di

Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila

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Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l'imaging dal vivo

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in

L'utilità della fase-specifici medio-tardiva

Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in