Name: assessment of human adipose tissue microvascular function using videomicroscopy
Uploaded: 2017-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer os voluntários para a sua participação nestes estudos e a equipe cirúrgica no centro médico de Boston para a prestação de biópsias de tecido adiposo. Dr. Gokce é suportado pelo Instituto Nacional de bolsas de saúde (NIH), HL081587, HL114675 e HL126141. Dr. Farb é suportado pelo NIH conceder K23 HL135394.

o protocolo e exemplos aqui descritos foram aprovados por Boston Universidade escola de medicina institucional Review Board (IRB, protocolo #H-25644) e foram conduzidos de acordo com a declaração de Helsinque. Todos os temas fornecidos escrito consentimento informado antes participação.
 1. preparação de soluções e vidro Micro cânulas <ol><li>preparar a solução salina de ácido 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Para 1 L, dissolver 8,059 g de NaCl, 0,298 g de KCl, 0,296 g MgSO 4 &#8226; 7 H 2 O, 0,235 g de CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O, 0,16 g KH 2 PO 4, 0,01 g EDTA, 1,081 g de D-Glucose e 2,383 g HEPES de ácido em 950 mL de água deionizada água. Perfazer o volume de 1 L com água desionizada. Ajuste o pH para 7,4 usando NaOH. Tampão HEPES pode ser armazenado 7 dias a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar a 20 x regulador de sal. Para 1L, adicionar 143,8 g NaCl, 7,0 g de KCl, 5,9 g MgSO 4 e 7,4 g de CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O em 900 mL de água destilada. Completar o volume de 1 L com água desionizada. Armazenar a solução estoque em 4 ° C.</li>
	<li>Preparar a 20 x regulador. Para 1L, adicione 26,8 NaHCO 3 e 0,2 g EDTA·2H 2 O em 900 mL de água desionizada. Completar o volume de 1 L com água desionizada. Armazenar a solução estoque em 4 ° C.</li>
	<li>Prepara a solução de KREBS para ser usado durante os experimentos fisiológicos. Para 1L, adicione 900 mL de água deionizada, 50 mL de 20 x Buffer Stock, 50 mL de 20 x sal solução-tampão, 0,99 g de D-Glucose e 0,16 g KH 2 PO 4. Ajuste o pH para 7,4 usando HCl. Para manter o pH do buffer, mexa constantemente e cobrir com parafina ou bolha continuamente.
	<ol><li>Verificar o pH a cada 20 min. faça a solução de KREBS frescos diariamente.</li>
	</ol></li> <li>Fazer vidro micro cânulas com diâmetro interno de 40-240 µm usando um extrator de agulha/pipeta comercialmente disponível. O tamanho das cânulas de vidro é determinado pelo tamanho do diâmetro interno dos vasos sanguíneos isolados (50-350 µm). Como alternativa, comprar vidro micro cânulas do tamanho pré-determinado.</li>
</ol> 2. Preparação dos reagentes <ol><li>preparar a acetilcolina (Ach, 10 -2 M, solução estoque). Dissolva 18,29 g em 10 mL de água desionizada. Armazenar as alíquotas de 1 mL da solução-mãe (10 -2 M) a-80 ° C. No dia do experimento serialmente diluído para obter as seguintes concentrações de trabalho: 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.</li>
	<li>Preparar a papaverina (2 x 10 -2 M, solução estoque). Dissolva 0,07517 g em 10 mL de água desionizada. Prepare-se 10 alíquotas µ l da solução estoque e loja a -80 ° C. serialmente diluir para obter 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M no dia do experimento.</li>
	<li>Preparar a endotelina-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, solução estoque). Dissolver 50 µ g de endotelina-1 em 1 mL de 1% BSA/PBS. Armazenar as alíquotas de 1 mL da solução-mãe (2 x 10 -5 M) a-80 ° C. No dia do experimento diluído para obter uma concentração de trabalho de 10 -10 M, no dia do experimento.</li>
	<li>Armazenar reagentes em ou-20 ° C ou até-80 ° C, dependendo do tipo de congelador disponível, mas não mais de 6 meses.</li>
</ol> 3. Coleção de tecido adiposo e preparação do navio <ol><li>recruta obesos homens e mulheres (índice de massa corporal (IMC) &#8805; 35 kg/m ², idade &#8805; 18 anos) inscritos no programa de cirurgia bariátrica no centro médico de Boston (BMC). Um total de 40 sujeitos participou nestas experiências.</li>
	<li>Coletar amostras de tecido de adiposo subcutâneo e visceral durante cirurgias bariátricos planejadas pelo cirurgião realizar a operação.
	<ol><li>Colheita subcutânea adiposo tecidos da parede abdominal inferior e visceral de gordura do omento maior, respectivamente. Tamanho de amostra de tecido adiposo típica varia de 3 a 10 mg de tecido.</li>
		Tecidos <li>lugar imediatamente no frio HEPES buffer de solução com um pH de 7,4 e loja a 4 ° C por até 24 h. 
		Nota: Além disso, arteríolas adiposas pode ser obtidas de indivíduos magros também durante outros tipos de cirurgias tais como reparos de hérnia ou cirurgia plástica e também pode ser uma biópsia do depósito subcutâneo através de biópsia do tecido abdominal trans-cutânea 6.</li>
	</ol></li> <li>Usando um microscópio de dissecação de tecido, micro tesouras e micropinça, Retire cuidadosamente circundante gordura e tecido conjuntivo de pequenas arteríolas adiposas (50-350 µm de diâmetro intraluminal, 2-3 mm de comprimento).</li>
	<li>Tie todos os ramos sobre as arteríolas usando minúsculo nylon ou seda suturas antes canulação sobre a pipeta capilar de vidro. Dissecar cuidadosamente as arteríolas desde que mesmo pequenos danos da parede da arteríola provoca alterações funcionais significativas.
	Exposição de navio <ol><li>minimizar a luz e calor que pode causar vasodilatação. Desde que pode ser às vezes difícil distinguir as arteríolas vênulas, identifica o tom de tamanho e musculatura lisa dos vasos por beliscando as pontas dos vasos. Arteríolas são geralmente menores e demonstrar o tom maior, em comparação com vênulas.</li>
	</ol></li> <li>Preparar a câmara de órgão. Lentamente, encha a pipeta capilar de vidro e tubo de borracha com solução de KREBS utilizando uma seringa de 10 mL.</li>
	<li>Uma vez que o tubo de borracha é preenchido e pipetas capilares de vidro estão submersos em solução de KREBS dentro da câmara de órgão, Canule as arteríolas firmemente sobre as seguras pipetas e amarre as duas extremidades da arteríola com nylon ou pontos de sutura de seda cuidadosamente.</li>
	<li>Encher a câmara de órgão com solução de KREBS até 2 mL.</li>
	<li>Secure câmara do órgão para um palco com o microscópio invertido (objetivo de ampliação 10 X / 0.25) e câmara de vídeo.</li>
	<li>Ativar o software de detecção de borda que é transmitido em tempo real a uma taxa de amostragem de 1 kHz (quadro 1/s).</li>
	<li>Conecte um lado do tubo de pressão para a solução de KREBS reservatórios cheios de pressão livre de microbolhas, como bolhas podem apresentar erro experimental. Ligue a outra extremidade do tubo pressurizado para a câmara de órgão.</li>
	<li>Conectar os reservatórios de pressão cheia de solução KREBS para o transdutor de pressão com tubo limpo.</li>
	<li>Controle de fluxo intra luminal, regulando a altura destes dois reservatórios; assim, quando os reservatórios são colocados na mesma altura, nenhum fluxo intra-luminal ocorrerá.</li>
	<li>, Uma vez que todos estes processos estão completos, ligar o aquecimento bloco e software programa para manter a temperatura a 37 ° C. continuamente perfundir o recipiente com solução de KREBS e ventilar com uma mistura de gás de 5% de CO 2, 21% O 2 e 74% N 2 7 , 8, ao longo de todo o procedimento experimental.</li>
	<li>Para atingir a pressão desejada insido lúmen dos vasos isolados, gradualmente, aumentar a pressão intraluminal (5 mmHg, cada 5 min) através da unidade de controle de pressão no painel myo-interface, fazê-lo em ritmo lento para evitar lesões da camada endotelial. 
	Nota: Uma vez que a pressão atinge 60 mmHg, um período de equilíbrio de 20-30 minutos é necessário para estabilizar o navio. Todos os estudos da função vascular são executados em 60 mmHg e 37 ° C em pH 7,4. 7</li></ol> 4. Avaliação da função Microvascular adiposa Nota: em geral, vasodilatação endotélio-dependente de arteríola adiposa pode aparecer em resposta a fisiológica (induzida pelo fluxo) e estímulos farmacológicos (Ach-induzida).
<ol><li>Vasodilatação mediada por fluxo, endotélio-dependente <ol><li>após pressurização, gravar o diâmetro da arteríola adiposa em repouso (Di). Isto é referido como o descanso de diâmetro de base.</li>
		<li>Pre-constrição dos vasos sanguíneos para ~ 55% do diâmetro da linha de base de descanso (Dp) adicionando 1 µ l de endotelina-1 (ET-1, 10 &#8722; 10 M) diretamente para o banho e espere 5 min, para o efeito. Repita este processo até alcançar o desejado ~ 55% pre-constrito estado.</li>
		<li>Após pré-constrição, induzir o fluxo contínuo no espaço intraluminal de tecido adiposo arteríolas, em igual e direções opostas para que uma diferença de pressão pode ser desenvolvida através do navio sem alterar a pressão intraluminal média de 60 mmHg. 
		Nota: por exemplo, se um reservatório move para cima por 10 cm de altura, o outro precisa ser movido para baixo por 10 cm para alterar gradientes de pressão e, assim, alterar intraluminal caudal. Se medições mais precisas de taxa de fluxo são desejadas, um sistema de medidor de fluxo quantitativa pode ser aplicado para a montagem experimental.</li>
		<li>Medir a dilatação fluxo-mediada 3-5 min após o início da indução fluxo. Os níveis de fluxo intraluminal (gradientes de pressão) podem ser na faixa de 0 - 100 cmH 2 O. aumentar a cada incremento de gradiente de pressão por Δ10 cmH 2 O cada 5-6 minutos, até um máximo de 100 cmH 2 O. 
		Nota: A fim de induzir o fluxo laminar estável no lúmen, ambos os tamanhos de ponta de cânula de vidro micro precisam estar muito perto de diâmetro interno de arteríolas; caso contrário, ele irá produzir fluxo turbulento dentro do lúmen e induzir a erros de medição indesejados.</li>
		<li>Após a avaliação de dilatação fluxo-mediada, retornar reservatórios de pressão para a mesma altura (60 mmHg).</li>
		<li>Em seguida, lavar arteríola e câmara removendo imediatamente a solução da câmara e substitua com solução de KREBS fresca. Isso é feito com cuidado para não perturbar a arteríola suspensa dentro da câmara.</li>
		<li>Repita este processo 3 - 4 vezes por 20-30 min, ou até o vaso isolado retorna ao diâmetro do descanso da linha de base.</li>
	</ol></li> <li>Vasodilatação mediada por acetilcolina, endotélio-dependente, <ol><li>quando a arteríola adiposa retornou ao diâmetro do descanso da linha de base, pre-constrição vaso ~ 55% através da administração de endotelina-1 (ET-1, 10 &#8722; 10 M) diretamente para o banho, conforme descrito acima na seção 4.1.2.</li>
		<li>Após pré-constrição, sequencialmente, administrar doses crescentes (2 µ l) de acetilcolina, que é mediada por receptores, óxido nítrico agonista (Ach, 10 -9 a 10 -5 M) diretamente para o banho. Registrar a mudança de diâmetro arteriolar 5 min após a administração de cada dose.</li>
		<li>, Uma vez que o navio tem alcançado um platô após a administração da última dose Ach, lave o recipiente 3 - 4 vezes com solução de KREBS. Permitir que 20-30 min para navio recuperar e retornar ao diâmetro da linha de base de repouso. Para ajudar a manter o pH na curvatura do órgão, alterar a solução de KREBS cada 15 min.</li>
	</ol></li> <li>Incubar a arteríola com N w - nitro - l-éster metílico de arginina (L-NAME, 10 -4 M), um inibidor da óxido nítrico sintase por 30 min e em seguida repetir 4.2.1 e 4.2.2 para caracterizar a contribuição relativa da óxido nítrico, a vasodilatação mediada por Ach.</li>
	<li>Avaliar a vasodilatação endotélio-independente (função de músculo liso vascular) e viabilidade de navio por uma administração sequencial de doses crescentes de papaverina (10 -8 a 10 -4 M) diretamente para o banho. Se o diâmetro do vaso não voltar, ou exceder o diâmetro da linha de base (Di) descanso em resposta a papaverina (ou seja, vasodilatação apropriado), considera o navio inviáveis e descartar os pontos de dados.</li>
</ol> 5. Análise de dados e cálculo <ol><li>calcular a reatividade vascular. Use vasodilatação por cento para expressão de dados que representam as diferenças de base no diâmetro dos vasos e calcular através da seguinte equação: % vasodilatação = (DT-Dp/Di-Dp) × 100 onde DT é o diâmetro gravado em um ponto determinado tempo (máximo diâmetro), Dp é o diâmetro gravado após a adição do agente de vasoconstrição (i. e. ET-1 induzido diâmetro de constrição), e Di é o diâmetro gravado imediatamente antes da adição do agente de vasoconstrição (diâmetro de descanso da linha de base). 9</li> <li>definir a sensibilidade de vasodilatação e vasoconstrição (dose-resposta) para um agonista como a concentração de Ach, papaverina ou ET-1 que provoca 50% da resposta máxima (CE 50) que pode ser definido por um parâmetro sigmoidal e plotados, conforme descrito anteriormente. 10 Nota: os estudos de reprodutibilidade inter observador de vasodilatação do tecido adiposo microvessels tem um alto coeficiente de correlação (CC) de 0,99 (n = 10 experimentos de embarcação) em nosso laboratório.</li></ol>
 6. análise estatística <ol><li>Express contínua medições como média ± SEM. Estes tendem a ser normalmente distribuída. Analisar a reatividade vascular em arteríolas adiposas por medidas repetidas ANOVA de duas vias.</li>
	<li>Alternativamente, comparar a área sob a curva (AUC) da trama para vasodilatação cumulativa a dose-respostas entre os grupos de tratamento. Em todos os casos, considerar P &#60; 0.05 estatisticamente significativo.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm divulgações ou conflitos de interesses ao relatório.

A dissecção e o isolamento de arteríolas adiposas dos tecidos circundantes podem ser um processo demorado e trabalhoso com cuidadosa atenção aos detalhes e protocolo técnico. O procedimento de microdissection exige habilidades meticulosas e utensílios especializados dissecação para evitar possíveis danos ao músculo liso ou endoteliais células camadas da microvasculatura. Até mesmo pequenas punções acidentais na parede arteriolar podem evitar pressurização intraluminal e resultados em um experimento mal s...

Tele-microscopia é uma técnica útil utilizada para examinar a função vasomotora pequenas arteríolas removido da vida humana assuntos ex vivo. Nosso laboratório centrou-se na dissecação fora microvessels minúsculo de compartimentos diferentes de tecido adiposo para caracterizar os efeitos de vários microambiente adiposa sobre a microvasculatura. Uma grande vantagem desta técnica é que os vasos sanguíneos removidos do corpo humano permanecem funcionais e podem ser examinados prontamente dentro de minutos a horas após a biópsia. Condições fisiológicas são imitadas e firme pressão transmural mantida no espaço intraluminal através de cânulas de vidro micro que recapitular muitas características de na vivo . 1 , 2 além disso, um set-up confiável tele-microscopia com software de detecção de borda automática permite que para avaliação qualitativa e quantitativa do endotélio-dependente e - independente de vasodilatador e vasoconstritor capacidade isolada navios em tempo real, permitindo rápida avaliação fisiológica em resposta a estímulos físicos e farmacológicos. 3 outras técnicas microvasculares também estão disponíveis como fio miografia que tende a ser menos demorado e medir respostas de tensão para vários agonistas por um transdutor de força.
Nosso laboratório tem aplicado tele-microscopia para examinar a relação entre obesidade e disfunção vascular, enfocando os efeitos de domínios diferentes de tecido adiposo na vasculatura. Adiposidade central, com acúmulo de gordura visceral intra-abdominal tem sido mais estreitamente associada a produção de adipocytokine, disfunção metabólica e risco Cardiometabólica. Foi postulado que a disfunção do tecido adiposo com excesso de produção de pro-aterogênico desregulagem de citocinas e adipokine estão fortemente implicados nestes processos, mas moléculas reguladoras específicas e alvos de tratamento permanecem em grande parte por descobrir. 4 além disso, no nível do tecido adiposo local, rarefação capilar e perfusão deficiente têm sido associados a pseudohypoxia de tecido adiposo e desregulação metabólica. A hipótese de que a doença cardiovascular pode ser a consequência da disfunção do tecido adiposo está evoluindo. Pro-aterogênico mediadores liberados da gordura, particularmente em associação com a adiposidade central/visceral, provável promovem disfunção endotelial e alterações vasculares patogénicas que podem ser manifestam localmente na vasculatura adiposa e detectado usando o descrito neste documento metodologia. 5
A avaliação funcional das arteríolas isoladas de tecido adiposo é uma abordagem útil para a compreensão da fisiopatologia e mecanismos moleculares que contribuem para a disfunção vascular na obesidade humana. Para investigar os mecanismos que contribuem para a disfunção gordura de depósito específico, desenvolvemos métodos para examinar o endotélio-dependente e - respostas vasodilatadoras independentes da microvasculatura e avaliar a expressão de vários normativos candidatos em emparelhados viscerais e subcutâneas (SC) tecido adiposo espécimes obtidos de indivíduos obesos no momento da cirurgia bariátrica.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemical Name&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra acetic acid (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&lt;em&gt;w&lt;/em&gt;&lt;/sub&gt;-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Finescience tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss Achromat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory tubing</td><td>Euro-Pharm</td><td>250100306F999</td><td></td></tr><tr><td>Needle/pippette puller</td><td>David kopf instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic monofilament nylon suture</td><td>Surgical specialties</td><td>A7756N</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Finescience tools</td><td>150000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Chamber</td><td>DMT</td><td>VAS v.2.1</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of human adipose tissue microvascular function using videomicroscopy

Enquanto a obesidade está intimamente ligada ao desenvolvimento de doenças metabólicas e cardiovasculares, pouco é conhecido sobre os mecanismos que regem esses processos. Supor que mediadores pro-aterogênico liberados do adiposo, particularmente em associação com a adiposidade visceral/central podem promover alterações vasculares patogénicas localmente e sistemicamente, e a noção de doença cardiovascular pode ser o consequência da disfunção do tecido adiposo continua a evoluir. Aqui, descrevemos um método exclusivo de tele-microscopia que envolve a análise das respostas vasodilatador e vasoconstritor intacta pequenas arteríolas humana, retirados do depósito de tecido adiposo de seres humanos vivos. Tele-microscopia é usada para examinar as propriedades funcionais de microvessels isolado em resposta a estímulos fisiológicos ou farmacológicos, usando um sistema de pressão que imita as condições na vivo . A técnica é uma abordagem útil para a compreensão da fisiopatologia e mecanismos moleculares que contribuem para a disfunção vascular localmente dentro do meio do tecido adiposo. Além disso, anormalidades na microvasculatura tecido adiposo também têm sido associadas com doenças sistêmicas. Nós aplicamos esta técnica para examinar o depósito específico respostas vasculares em indivíduos obesos. Avaliamos a vasodilatação endotélio-dependente ao fluxo aumentado e acetilcolina em arteríolas adiposas (50-350 µm de diâmetro interno, 2-3 mm de comprimento) isoladas de dois diferentes depósitos de tecido adiposos durante cirurgia bariátrica do mesmo indivíduo. Demonstrámos que arteríolas de gordura visceral apresentam prejudicada vasodilatação endotélio-dependente, em comparação aos navios isolados do depósito subcutâneo. Os resultados sugerem que o microambiente visceral está associado a disfunção endotelial vascular que pode ser relevante para a observação clínica vinculando aumento de adiposidade visceral aos mecanismos de doença sistêmica. A técnica de tele-microscopia pode ser usada para examinar vasculares fenótipos de diferentes depósitos de gordura, bem como comparar resultados entre indivíduos com diferentes graus de obesidade e disfunções metabólicas. O método também pode ser usado para examinar as respostas vasculares longitudinalmente em resposta às intervenções clínicas.

Nosso laboratório tem usado tele-microscopia para examinar o endotélio-dependente e - vasodilatação independente, bem como a função de vasocontractile de tecido adiposo arteríolas isoladas de gordura subcutânea e visceral de humanos obesos. A montagem experimental característica é exibida na figura 1A. Tecido adiposo arteríolas são suspensas entre duas pipetas de vidro capilar e preso no lugar com suturas dentro da câmara de órgão, como mostrad...

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Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Avaliação da função Microvascular de tecido adiposo humano usando tele-microscopia

Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

7.4K visualizações.  Boston University School of Medicine. Sistemas de tele-microscopia são usados para examinar as propriedades funcionais das arteríolas isoladas de tecido adiposo em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos. Esta técnica pode ser usada para examinar fenótipos microvasculares em domínios diferentes de tecido adiposo em seres humanos obesos.

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Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

Avaliação não invasiva da função microvascular e endotelial

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Medicina

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

Uma abordagem metodológica para avaliações não-invasivas de função vascular e Morfologia

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate postprandial delivery of nutrients and hormones to insulin-sensitive tissues. We here describe a technique for combining intravital microscopy (IVM) and contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) of the adductor compartment of the mouse hindlimb to simultaneously visualize muscle resistance arteries and perfusion of the microcirculation in vivo. Simultaneously assessing insulin's effect at multiple levels of the vascular tree is important to study relationships between insulin's multiple vasoactive effects and muscle perfusion. Experiments in this study were performed in mice. First, the tail vein cannula is inserted for the infusion of anesthesia, vasoactive compounds and ultrasound contrast agent (lipid-encapsulated microbubbles). Second, a small incision is made in the groin area to expose the arterial tree of the adductor muscle compartment. The ultrasound probe is then positioned at the contralateral upper hindlimb to view the muscles in cross-section. To assess baseline parameters, the arterial diameter is assessed and microbubbles are subsequently infused at a constant rate to estimate muscle blood flow and microvascular blood volume (MBV). When applied before and during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp, combined IVM and CEUS allow assessment of insulin-induced changes of arterial diameter, microvascular muscle perfusion and whole-body insulin sensitivity. Moreover, the temporal relationship between responses of the microcirculation and the resistance arteries to insulin can be quantified. It is also possible to follow-up the mice longitudinally in time, making it a valuable tool to study changes in vascular and whole-body insulin sensitivity.

Insulin-induced vasodilation regulates muscle perfusion and increases the microvascular surface area (microvascular recruitment) available for solute exchange between blood and tissue interstitium. Combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography is presented to simultaneously assess insulin&#39;s action at the larger vessels and the microcirculation in vivo.

Combinado de microscopia Intravital e ultra-sonografia contraste aprimorado do membro posterior Mouse para estudar a vasodilatação induzida por insulina e perfusão muscular

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Imunologia e Infecção

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Bioengenharia

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biologia

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...