저자는 이러한 연구와 지방 조직 생체 검사를 제공 하기 위한 보스톤 의료 센터에서 외과 직원에 그들의 참여에 대 한 자원 봉사자 감사 하 고 싶습니다. 박사 Gokce HL081587, HL114675, 및 HL126141 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 됩니다. 박사 Farb NIH에서 지원 K23 HL135394를 부여.

프로토콜 및 여기에 설명 된 예제에서 보스톤 대학 학교의 약 기관 검토 위원회 (IRB, 프로토콜 #H-25644)를 승인 했다 고 헬싱키 선언에 따라 실시 했다. 참여 하기 전에 서 면된 동의 제공 하는 모든 과목.
 1. 솔루션의 준비 및 마이크로 유리 뉼 <ol><li>준비 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic 산 성 염 (HEPES) 솔루션. 1 L에 대 한 8.059 g, NaCl 0.298 g, KCl 0.296 g MgSO 4 분해 &#8226; 7 H 2 O, 0.235 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 포 4, 950 mL에 0.01 g EDTA, 1.081 g D-포도 당, 및 2.383 g HEPES 산 이온 물입니다. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. PH를 7.4 NaOH를 사용 하 여 조정 합니다. HEPES 버퍼 7 일 4에서 저장 될 수 있다 ° c.</li>
	<li>소금 버퍼 재고 x 20을 준비합니다. 1 L에 대 한 추가 143.8 g NaCl, KCl 7.0 g, 5.9 g MgSO 4 및 7.4 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O 900 mL의 증류수에. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. 4 재고 솔루션을 저장 ° c.</li>
	<li>버퍼 재고 x 20을 준비합니다. 1 L 26.8 g NaHCO 3 및 0.2 g EDTA·2H 2 O 이온된 물 900 mL에 추가 합니다. 이온을 제거 된 물 1 L에 볼륨을 확인 합니다. 4 재고 솔루션을 저장 ° c.</li>
	<li>생리 실험 동안 사용할 KREBS 솔루션을 준비 합니다. 1 L, 이온된 물 900 mL, 버퍼 재고 x 20의 50 mL, 50 mL 소금 버퍼 솔루션, 0.99 g D-포도 당 및 0.16 g KH 2 포 4 x 20의 추가. PH를 7.4 HCl을 사용 하 여 조정 합니다. 버퍼의 pH를 유지 하려면 지속적으로 저 어와 파라핀으로 또는 지속적으로 거품.
	<ol><li>확인 전화 20 분 마다 매일 KREBS 솔루션 신선한 게.</li>
	</ol></li> <li>마이크로 유리 뉼 상용 바늘/피 펫 끌어당기는 사람을 사용 하 여 40-240 µ m의 내부 직경을 확인. 유리 뉼의 크기는 고립 된 혈관 (50-350 µ m)의 내부 직경의 크기에 의해 결정 됩니다. 또는, 미리 정해진된 크기의 마이크로-유리 뉼 구입.</li>
</ol> 2. 시 약의 준비 <ol><li>준비 아 세 틸 콜린 (Ach, 10 -2 M, 재고 솔루션). 18.29 g 10 mL 이온된 물에 용 해. 1 mL aliquots-80 ° c.에 재고 솔루션 (10 -2 M)의 저장 다음 작업 농도를 연속적으로 희석 실험의 날: 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.</li>
	<li>Papaverine (2 x 10 -2 M, 재고 솔루션)를 준비합니다. 0.07517 g 10 mL 이온된 물에 용 해. 준비 재고 솔루션 및 저장소-80에 10 µ L aliquots ° C. 직렬 실험의 하루에 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 M를 희석.</li>
	<li>는 Endothelin 1 (외 1, 2 x 10 -5 M, 재고 솔루션)를 준비합니다. 1%의 1 mL에 50 µ g endothelin-1 녹 BSA/PBS. 1 mL aliquots-80 ° c.에 재고 솔루션 (2 x 10 -5 M)의 저장 실험 실험의 하루에 10 -10 M의 작업 농도를 희석의 날.</li>
	<li>시 약 중-20 ° C에 저장 또는 냉장고의 종류에 따라 사용할 수 있는, 하지만 하지 6 개월 이상-80 ° C까지.</li>
</ol> 3. 지방 조직 수집 및 선박 준비 <ol><li>모집 비만 남자와 여자 (몸 질량 색인 (BMI) &#8805; 35 k g/m ², 나이 &#8805; 18 년) 보스톤 의료 센터 (BMC)에서 비만 수술 프로그램에 등록. 40 과목의 총이이 실험에 참가 했다.</li>
	<li>계획된 bariatric 수술 하는 동안 작업을 수행 하는 외과 의사에 의해 피하와 내장 지방 조직 샘플을 수집.
	<ol><li>수확은 피하 지방 조직을 더 낮은 복 부 벽에서 내장 지방 그레이터 omentum에서 각각. 전형적인 지방 조직 샘플 크기 3-10 mg의 조직에서 변화 한다.</li>
		<li>장소 조직을 즉시 차가운 HEPES 버퍼 ph 7.4와 최대 24 h. 4 ° C에서 저장소 솔루션 
		참고: 또한, 지방 arterioles 다른 유형의 헤 르 니 아 수리 등 성형 수술, 수술 중 뿐만 아니라 마른 개인에서 얻어질 수 있다 그리고 또한 수 트랜스 피부 복 부 지방 패드 생 검을 통해 피하 디포에서 biopsied 6.</li>
	</ol></li> <li>주변 지방과 결합 조직 (50-350 µ m intraluminal 직경, 길이 2-3 m m) 작은 지방 arterioles에서 제거 신중 하 게 조직 해 부 현미경, 마이크로-가 위 및 마이크로 집게를 사용 하 여,.</li>
	<li>Arterioles 유리 모 세관 펫에 cannulating 전에 작은 나일론 또는 실크 봉합을 사용 하 여에 모든 지점에서 넥타이. 신중 하 게 해 부하는 arterioles 되 벽의 사소한 손상 원인 중요 한 기능 변경 이후.
	빛과 열으로 <ol><li>최소화 배 노출 혈관 확장을 일으킬 수 있습니다. 그것은 때로는 어려울 수 있습니다 venules arterioles 구별, 이후 혈관의 끝 물에 의해 혈관의 크기 및 평활 근 음색을 식별 합니다. Arterioles는 일반적으로 더 작은 이며 venules에 비해 더 큰 톤.</li>
	</ol></li> <li>기관 챔버 준비. 천천히 KREBS 솔루션 10 mL 주사기를 사용 하 여 유리 모 세관 펫 및 고무 튜브를 작성.</li>
	<li>고무 튜브 채워지고 유리 모 세관 펫 챔버 내에 장기 KREBS 솔루션에 잠긴, 일단 안전 하 게 보안된 펫에 arterioles cannulate와 나일론 되의 두 끝을 묶어 또는 실크 봉합 사 매듭 신중 하 게.</li>
	<li>KREBS 솔루션과 장기 챔버를 채워 최대 2 mL.</li>
	<li>거꾸로 현미경 (배율 10 배 / 0.25 목표)와 함께 무대에 기관 실 확보 및 비디오 카메라.</li>
	<li>1 kHz의 샘플링 레이트에서 실시간에 스트리밍 가장자리 탐지 소프트웨어에 설정 (1 프레임/초).</li>
	<li>연결할 가압된 튜브의 한쪽 채워진된 압력 저수지 microbubbles, 무료로 KREBS 솔루션으로 거품 실험 오류를 발생할 수 있습니다. 기관 실에 가압된 튜브의 다른 쪽을 연결.</li>
	<li>깨끗 한 배관 압력 트랜스듀서에 KREBS 솔루션 가득 압력 저수지를 연결.</li>
	<li>제어이 두 저수지의 높이 조절 하 여 내부 luminal 흐름; 따라서 때 저수지에 배치 됩니다 같은 높이, 아니 내 luminal 흐름 발생 합니다.</li>
	<li>이러한 모든 프로세스가 완료 되 면 설정 37에 온도 유지 하기 위해 블록 및 소프트웨어 프로그램을 난방 ° C. 지속적으로 perfuse KREBS 솔루션과 선박 및 5% CO 2, 21% O 2와 N 74%의 가스 혼합 aerate 2 전체 실험 절차에 걸쳐 7 , 8.</li>
	<li>원하는 압력 insi 달성 하기드의 격리 된 선박 루멘 점차적으로 압력 제어 장치 묘 인터페이스 패널에서 내 피 층 손상을 방지 하기 위해 느린 속도로 이렇게 통해 intraluminal 압력 (5 mmHg, 매 5 분)를 증가. 
	참고: 압력 60 mmHg에 도달 하면, 20-30 분 평형 기간 필요 선박 안정 합니다. 모든 혈관 기능 연구 60 mmHg, pH 7.4에서 37 ° C에서 수행 됩니다. 7</li></ol> 4. 지방 Microvascular 함수의 평가 참고: 일반적으로, 많은 되 종속 내 피 혈관 확장 (흐름 유도)에 생리 적인 응답에 elicited 수 및 약리 자극 (Ach 유도).
<ol><li>흐름 중재, 종속 내 피 혈관 확장 <ol><li>가압, 다음 나머지 (디)에서 지방 되의 직경을 기록. 이 휴식 기준 직경으로 불린다.</li>
		<li>미리 endothelin 1의 1 µ L을 추가 하 여 ~ 55% 휴식 기준 직경 (Dp)의 혈관을 수축 (동부 표준시-1, 10 &#8722; 10 M) 목욕 및 효과 대 일 분 대기에 직접. 상태를 막혀서 미리 원하는 ~ 55%에 도달 될 때까지이 과정을 반복.</li>
		<li>압력 차이 평균 intraluminal 압력을 변경 하지 않고 선박에 걸쳐 개발 될 수 있도록 유도 지방 조직 arterioles, 평등 하 고 반대 방향의 intraluminal 공간으로 연속 흐름을 사전 수축, 다음 60 mmHg의. 
		참고: 예를 들어 한 저수지 높이 10 cm에 의해 이동 하는 경우 다른 하나 필요를 압력 기울기를 변경 하 고 따라서 intraluminal 유량 변경 10 cm에 의해 이동 해야 합니다. 더 정확한 흐름 속도 측정 바란다면 양적 유량 시스템 실험 설정에 적용할 수 있습니다.</li>
		<li>흐름 중재 팽창 측정 흐름 유도의 개시 후 3-5 분. Intraluminal 흐름 (압력 기온 변화도)의 수준 수 범위의 0-100 cmH 2 오 증가 압력 기온 변화도의 각 증가 Δ10 cmH 2 O 100 cmH 2 오의 최대 5-6 분 마다 
		참고: 안정 층 류는 루멘에서 유도 하기 위하여 두 마이크로 유리 정 팁 크기 필요가 arterioles;의 내부 직경에 매우 가까울 그렇지 않으면, 루멘 내의 난 류를 생산 하 고 원치 않는 측정 오류를 유발.</li>
		<li>흐름-중재 팽창 평가, 다음 돌아가기 압력 저수지 같은 높이 (60 mmHg).</li>
		<li>그런 다음 즉시 상공에서 솔루션을 제거 하 여 되 고 챔버를 세척 하 고 신선한 KREBS 솔루션으로 대체. 이 챔버 내에 중단된 되는 방해 하지 않는 만큼 주의 이루어집니다.</li>
		<li>3-4 회 20-30 분, 또는 격리 된 선박 휴식 기준 지름에 반환 될 때까지이 과정을 반복.</li>
	</ol></li> <li>중재 하는 아 세 틸 콜린, 내 피-종속, 엷게 <ol><li>지방 되는 휴식 기준 직경에 반환은, 미리 수축 endothelin-1 (동부 표준시-1, 10 를 투여 하 여 배 ~ 55% &#8722; 10 M) 위의 섹션에서에서 설명한 대로 4.1.2 목욕에 직접.</li>
		<li>사전 수축에 따라 순차적으로 수용 체 중재 하는, 산화 질소 주 작동 근 (Ach, 10 -5 M에 10 -9) 직접 목욕 하는 아 세 틸 콜린의 증가 복용량 (2 µ L)를 관리. 각 복용량의 관리 후 arteriolar 직경 5 분에 있는 변화를 기록.</li>
		<li>배 최종 Ach 복용량의 관리를 다음 대 지에 도달 했습니다 일단 워시는 용기 3-4 회 KREBS 솔루션. 복구 하 고 초기 직경 휴식을 반환 선박에 대 한 20-30 분을 허용 합니다. 장기 의회에서 pH를 유지 하려면 변경 KREBS 솔루션 15 분 마다</li>
	</ol></li> <li>품 어 되 N w-니트로-l-아르기닌 메 틸 에스테 르 (L 이름, 10 -4 M), 30 분, 산화 질소 synthase의 억제제 및 다음 반복 4.2.1 및 4.2.2 특성의 상대적 기여도를 Ach 중재 혈관을 산화 질소.</li>
	<li>목욕에 직접 papaverine (10 10 -4 M를 -8)의 증가 복용량의 순차적 행정에 의해 endothelium 독립 혈관 (혈관 부드러운 근육 기능) 및 선박 생존 능력을 평가합니다. 혈관 직경, 반환 하거나 papaverine (즉 적절 한 혈관)에 대 한 응답 휴식 기준선 (디) 직경을 초과 하지 않습니다, 선박 비 가능한 고려 하 고 데이터 요소를 삭제.</li>
</ol> 5. 데이터 분석 및 계산 <ol><li>계산 혈관 반응성. 데이터 표현에 대 한 백분율 혈관 혈관 직경 기준 차이 대 한 계정 및 다음 수식을 사용 하 여 계산을 사용 하 여: % 혈관 (DT-Dp/디-Dp) × 100 = DT는 주어진된 시간 (최대에 기록 된 직경 지름), Dp입니다 vasoconstriction 에이전트 (즉 추가 후 기록. ET-1 유도 축의 직경), 고 디 바로 앞 vasoconstriction 에이전트 (휴식 초기 직경)의 추가 기록입니다. 9</li> <li>Ach, papaverine, 또는 외-1 최대 응답 (EC 50)의 50%를 elicits 의해 정의 될 수 있는 농도 주 작동 근에 혈관 확장 및 vasoconstriction 감도 (복용량 응답) 정의 자형 매개 변수 및 플롯, 앞에서 설명한 대로. 10 참고: 지방이 많은 microvessels의 혈관의 관찰자 간 재현성 연구는 0.99의 높은 상관 계수 (CC) (n = 10 배 실험) 우리의 실험실에.</li></ol>
 6. 통계 분석 <ol><li>익스프레스 연속 측정 ± SEM.를 의미 이 일반적으로 배포 하는 경향이. 반복 측정 양방향 ANOVA에 의해 지방 arterioles 혈관 반응성 분석.</li>
	<li>또는 처리 그룹 사이 복용량 응답을 누적 혈관에 대 한 음모의 곡선 (AUC) 아래 영역을 비교합니다. 모든 경우에 P 고려 &#60; 0.05 통계적.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 또는 보고서 이해 충돌 있다.

해 부 및 주위 조직에서 지방 arterioles의 절연 기술 프로토콜 세부 사항에 주의 함께 시간과 노동 집약적인 과정 수. 있습니다 서 절차 세심 한 기술과 부드러운 근육 또는 내 피 손상을 방지 하기 위해 특수 해 부 기구는 microvasculature의 레이어를 셀 필요 합니다. Arteriolar 벽에도 작은 실수로 구멍 intraluminal 가압 및 실패 한 실험에서 결과 방지할 수 있습니다. 또한, cannulation arterioles 봉합 활용의 그릇...

Videomicroscopy 작은 arterioles 생활 인체 ex vivo에서제거의 조절과 기능 검사를 활용 하는 유용한 기술입니다. 우리 연구소는 microvasculature에 다양 한 많은 microenvironments의 효과 특성을 다른 지방 조직 구획에서 작은 microvessels에 밖으로 해 부에 집중 했다. 이 기술의 주요 장점은 인체에서 제거 하는 혈관 기능 유지와 생 시간을 몇 분 안에 쉽게 시험 될 수 있다. 생리 적인 조건 유사 하 고 과거 압력 마이크로 유리 뉼 많은 비보에 특성을 정리를 통해 intraluminal 공간에서 유지 관리를 꾸준히. 1 , 2 또한, 자동된 가장자리 감지 소프트웨어와 신뢰할 수 있는 videomicroscopy 설정 endothelium 종속-독립적인 vasodilator 및 vasoconstrictor 용량 절연의 질적 및 양적 평가 대 한 허용 물리적 및 약리 자극에 대 한 응답에서 실시간, 허용 빠른 생리 적 평가에서 선박. 3 다른 microvascular 기법 와이어 myography 적은 시간이 소요 되며 힘 변환기에 의해 다양 한 agonists 긴장 응답을 측정 하는 경향이 사용할 수 있습니다.
본 연구실은 비만는 맥 관 구조에 다른 지방 조직 도메인의 효과에 초점을 맞추고 혈관 부전 사이의 관계를 검사 하는 videomicroscopy를 적용 하 고 있다. 내부-복 부 내장 지방의 축적으로 중앙 adiposity adipocytokine 생산, 대사 장애, 및 cardiometabolic 위험에 가장 밀접 하 게 연결 되었습니다. 프로 atherogenic cytokines 및 adipokine dysregulation의 과잉 생산으로 지방 조직 장애는 이러한 프로세스에 연루 강력 하지만 특정 규제 분자 및 치료 목표는 크게 남아 postulated이 되었습니다. 알려지지 않은. 4 또한, 현지 지방 조직 수준, 모 세관 진공 및 장애인된 관류에 지방 조직 pseudohypoxia 및 대사 dysregulation 연결 되었습니다. 심혈 관 질환 지방 조직 장애의 결과 수 있습니다 가설 진화입니다. 지방에서 특히 중앙/내장 adiposity, 가능성이 함께 협회에서에서 발표 하는 프로 atherogenic 중재자 홍보 내 피 기능 장애 및 병원 성 혈관 변화 될 수 있는 많은 맥 관 구조에 로컬로 명단 및 사용 하 여 검출 된 여기에 방법을 설명합니다. 5
고립 된 지방 조직 arterioles의 기능 평가 이상과 인간의 비만에 혈관 장애에 기여 하는 분자 메커니즘의 이해를 얻기 위해 유용한 방법입니다. 지방 서비스 센터 관련 장애에 기여 하는 메커니즘을 조사, endothelium 종속을 검사 하는 방법을 개발 했습니다 및-microvasculature의 독립적인 vasodilatory 응답 각종 규제의 식을 평가 하 고 bariatric 수술의 때에 뚱뚱한 과목에서 얻은 내장과 피하 (SC) 지방 조직 표본 쌍된에 후보자.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemical Name&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra acetic acid (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&lt;em&gt;w&lt;/em&gt;&lt;/sub&gt;-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Finescience tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss Achromat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory tubing</td><td>Euro-Pharm</td><td>250100306F999</td><td></td></tr><tr><td>Needle/pippette puller</td><td>David kopf instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic monofilament nylon suture</td><td>Surgical specialties</td><td>A7756N</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Finescience tools</td><td>150000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Chamber</td><td>DMT</td><td>VAS v.2.1</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of human adipose tissue microvascular function using videomicroscopy

비만 대사 및 심혈 관 질환의 발전에 밀접 하 게 연결 된다, 그러나 약간이 프로세스를 제어 하는 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 그것은 국부 적으로 그리고 체계적으로, 중앙/내장 adiposity와 협회에서 특히 지방 조직에서 발표 프로 atherogenic 중재자 병원 성 혈관 변화를 촉진 수 있습니다 그리고 개념 심혈 관 질병이 있을 수 있습니다 가상은 지방 조직 장애의 결과 진화 하 고 있습니다. 여기, 우리는 그대로 작은 인간의 arterioles 살아있는 인간을 대상의 지방 창 고에서 제거의 vasodilator 및 vasoconstrictor 응답의 분석을 포함 하는 videomicroscopy의 독특한 방법을 설명 합니다. Videomicroscopy는 응답을 vivo에서 조건 압력된 시스템을 사용 하 여 약리학 또는 생리 적 자극으로 격리 된 microvessels의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 기술은 이상과 지방 조직 환경 내에서 로컬로 혈관 장애에 기여 하는 분자 메커니즘의 이해를 얻기 위해 유용한 방법입니다. 또한, 지방 조직 microvasculature에 이상 또한 조직의 질병으로 연결 되었습니다. 우리는 뚱뚱한 주제에 있는 창 고 전용 혈관 응답 검사에이 기술을 적용. 우리는 증가 흐름을 두 개의 서로 다른 많은 플랫폼에서 동일한 개인에서 bariatric 수술 동안 격리 지방 arterioles (50-350 µ m 내부 직경, 길이 2-3 m m)에서 아 세 틸 콜린 endothelium 종속 엷게 평가. 우리는 내장 지방에서 arterioles 피하 창 고에서 고립 된 선박에 비해 장애인된 endothelium 종속 엷게 전시 시연 했다. 연구 결과 내장 microenvironment는 조직의 질환 메커니즘을 증가 내장 adiposity를 연결 하는 임상 관측에 관련 될 수 있는 혈관 내 피 기능 장애와 관련 된 것이 좋습니다. Videomicroscopy 기술은 다른 지방 창 고에서 관 고기 검사 하 고 결과 비교 하 여 비만 대사 장애의 다른 정도 가진 개인에 걸쳐 사용할 수 있습니다. 메서드 또한 임상 내정간섭에 응답에 경도 혈관 반응 검사를 사용할 수 있습니다.

우리 연구소는 endothelium 종속 검사를 videomicroscopy를 사용 하 고 있다 고-지방 조직 arterioles의 vasocontractile 기능 뿐만 아니라 독립적인 혈관, 피하와 내장 지방 비만 인간의에서 격리. 특성 실험 설정 그림 1A에 표시 됩니다. 지방 조직 arterioles 두 유리 모 세관 펫 사이 일시 중단 하 고 챔버 내에 장기 그림 1B와 같이 봉합과 장소에 ?...

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Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

Videomicroscopy 시스템은 고립 된 지방 조직 arterioles 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 비만 인 간에 있는 다른 지방 조직 도메인에 microvascular 고기 검사를 사용할 수 있습니다.

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

assessment-human-adipose-tissue-microvascular-function-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

7.4K 조회수.  Boston University School of Medicine. Videomicroscopy 시스템은 고립 된 지방 조직 arterioles 생리 및 약리 자극에 대 한 응답에서의 기능 속성을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 비만 인 간에 있는 다른 지방 조직 도메인에 microvascular 고기 검사를 사용할 수 있습니다.

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Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

Microvascular 및 내피 기능의 비 침습적 평가

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

연구

의학

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

혈관 기능 및 형태의 비 침습적 평가에 대한 방법 론적 접근

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate postprandial delivery of nutrients and hormones to insulin-sensitive tissues. We here describe a technique for combining intravital microscopy (IVM) and contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) of the adductor compartment of the mouse hindlimb to simultaneously visualize muscle resistance arteries and perfusion of the microcirculation in vivo. Simultaneously assessing insulin's effect at multiple levels of the vascular tree is important to study relationships between insulin's multiple vasoactive effects and muscle perfusion. Experiments in this study were performed in mice. First, the tail vein cannula is inserted for the infusion of anesthesia, vasoactive compounds and ultrasound contrast agent (lipid-encapsulated microbubbles). Second, a small incision is made in the groin area to expose the arterial tree of the adductor muscle compartment. The ultrasound probe is then positioned at the contralateral upper hindlimb to view the muscles in cross-section. To assess baseline parameters, the arterial diameter is assessed and microbubbles are subsequently infused at a constant rate to estimate muscle blood flow and microvascular blood volume (MBV). When applied before and during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp, combined IVM and CEUS allow assessment of insulin-induced changes of arterial diameter, microvascular muscle perfusion and whole-body insulin sensitivity. Moreover, the temporal relationship between responses of the microcirculation and the resistance arteries to insulin can be quantified. It is also possible to follow-up the mice longitudinally in time, making it a valuable tool to study changes in vascular and whole-body insulin sensitivity.

Insulin-induced vasodilation regulates muscle perfusion and increases the microvascular surface area (microvascular recruitment) available for solute exchange between blood and tissue interstitium. Combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography is presented to simultaneously assess insulin&#39;s action at the larger vessels and the microcirculation in vivo.

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

면역학 및 감염병학

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

생체공학

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

생물학

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...