Name: assessment of human adipose tissue microvascular function using videomicroscopy
Uploaded: 2017-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy at JoVE.com

Los autores desean agradecer a los voluntarios por su participación en estos estudios y el personal quirúrgico en el Boston Medical Center para proporcionar las biopsias de tejido adiposo. Dr. Gokce es apoyado por los institutos nacionales de subvenciones de salud (NIH) HL081587, HL114675 y HL126141. Dr. Farb es apoyado por los NIH grant HL135394 K23.

el protocolo y los ejemplos aquí descritos fueron aprobados por Boston University escuela de medicina Junta de revisión institucional (IRB, protocolo #H-25644) y se llevaron a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki. Todos los temas siempre el consentimiento informado escrito antes de la participación.
 1. preparación de soluciones y cánulas Micro-vidrio <ol><li>Prepare la solución de 4-2-hydrosyethyl-1--1-ácido solución salina ácida (HEPES). Para 1 L, disolver 8,059 g NaCl, 0,298 g KCl, 0,296 g de MgSO 4 &#8226; 7 H 2 O, 0,235 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O, 0.16 g KH 2 PO 4, 0.01 g EDTA, 1,081 g D glucosa y 2,383 g HEPES ácido en 950 mL de desionizada agua. Enrasar a 1 L con agua desionizada. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Buffer HEPES se puede almacenar 7 días a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar el 20 x acción tampón salino. Para 1 L, agregar 143,8 g NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g de MgSO 4 y 7.4 g CaCl 2 &#8226; 2 H 2 O en 900 mL de agua destilada. Completar volumen a 1 L con agua desionizada. Almacene la solución a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar el 20 x existencias. Para 1 L, agregar 26,8 g NaHCO 3 y 0,2 g EDTA·2H 2 O en 900 mL de agua desionizada. Completar volumen a 1 L con agua desionizada. Almacene la solución a 4 ° C.</li>
	<li>Prepara la solución de KREBS para ser utilizado en los experimentos fisiológicos. Para 1 L, agregar 50 mL de 20 x existencias, 900 mL de agua desionizada, 50 mL de solución salina tampón, 0,99 g D-glucosa de 0.16 g KH 2 PO 4 20 x. Ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico. Para mantener el pH del buffer, revuelva constantemente y cubrir con parafina o burbuja continuamente.
	<ol><li>Cheque el pH cada 20 minutos hacer la solución de KREBS fresco diario.</li>
	</ol></li> <li>Hacer vidrio micro cánulas de un diámetro interior de 40-240 μm utilizando un extractor de aguja/pipeta disponible comercialmente. El tamaño de las cánulas de vidrio se determina por el tamaño del diámetro interior de los vasos sanguíneos aislados (50-350 μm). Como alternativa, comprar cristal micro cánulas del tamaño predeterminado de.</li>
</ol> 2. Preparación de reactivos <ol><li>preparar la acetilcolina (Ach, 10 -2 M, solución). Disolver 18,29 g en 10 mL de agua desionizada. Almacenar en alícuotas de 1 mL de solución madre (10 -2 M) a-80 ° C. En el día del experimento en serie diluir hasta obtener las siguientes concentraciones de trabajo: 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 M.</li>
	<li>Preparar la papaverina (2 x 10 -2 M, solución). Disolver 0,07517 g en 10 mL de agua desionizada. Preparar 10 alícuotas de μl de la solución madre y conservar a -80 ° C. en serie diluir para obtener 10 -4 10 -5 10 -6, 10 -7, 10 -8 M en el día del experimento.</li>
	<li>Preparar la endotelina 1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, solución). Disolver 50 μg endotelina-1 en 1 mL de 1% BSA/PBS. Almacenar en alícuotas de 1 mL de solución madre (2 x 10 -5 M) a-80 ° C. En el día del experimento diluir hasta obtener una concentración de trabajo de 10 -10 M en el día del experimento.</li>
	<li>Almacenar reactivos en cualquiera de los dos-20 ° C o a-80 ° C según tipo de congelador disponible, pero no más de 6 meses.</li>
</ol> 3. Tejido adiposo y vasos preparación <ol><li>recluta hombres obesos y las mujeres (índice de masa corporal (IMC) &#8805; 35 kg/m², edad &#8805; 18 años) inscritos en el programa de cirugía bariátrica en el Boston Medical Center (BMC). Un total de 40 sujetos participaron en estos experimentos.</li>
	<li>Recoger muestras de tejido adiposo subcutáneo y visceral durante cirugías bariátricas planeadas por el cirujano realice la operación en.
	<ol><li>Cosecha el subcutánea adiposo tejidos de la pared abdominal inferior y visceral de grasa de mayor epiplón, respectivamente. Tamaño de la muestra de tejido adiposo típico varía de 3 a 10 mg de tejido.</li>
		<li>Lugar los tejidos inmediatamente frío HEPES buffer solución con un pH de 7.4 y almacenar a 4 ° C por 24 h. 
		Nota: Además, adiposas arteriolas pueden obtenerse individuos lean durante otros tipos de cirugías tales como reparaciones de hernia o cirugía plástica y también puede ser hecho una biopsia del depósito subcutáneo mediante biopsia de la almohadilla de grasa abdominal trans cutánea .</li>
	</ol></li> <li>Cuidadosamente usando un microscopio de disección de tejido, micro tijeras y pinzas de micro, quitar grasa y tejido conectivo circundantes de las pequeñas arteriolas adiposas (50-350 μm de diámetro intraluminal, 2-3 mm de longitud).</li>
	<li>Tie off todas las ramas de las arteriolas utilizando nylon pequeña o suturas de seda antes de canular en las pipetas capilares de vidrio. Disecar cuidadosamente las arteriolas ya incluso menor daño de la pared de la arteriola provoca cambios funcionales significativos.
	<ol><li>Minimice la exposición de recipiente a la luz y el calor ya que puede causar vasodilatación. Puesto que puede ser a veces difícil distinguir arteriolas vénulas, identificar el tono tamaño y músculo liso de los vasos por pellizcar las puntas de los vasos. Las arteriolas son generalmente más pequeñas y demostrar mayor tono en comparación con los venules.</li>
	</ol></li> <li>Preparar la cámara de órgano. Llene lentamente las pipetas capilares de vidrio y tubo de goma con solución de KREBS utilizando una jeringa de 10 mL.</li>
	<li>Una vez que se llena el tubo de goma y vidrio pipetas capilares están sumergidas en solución de KREBS dentro de la cámara de órgano, canule las arteriolas sobre las pipetas aseguradas y atar ambos extremos de la arteriola con nylon o nudos de sutura de seda cuidadosamente.</li>
	<li>Llenar la cámara de órgano con solución de KREBS hasta 2 mL.</li>
	<li>Garantizar la cámara de órgano a un escenario con el microscopio invertido (objetivo magnificación 10 X / 0.25) y cámara de video.</li>
	<li>Encender el software de detección de borde que se transmiten en tiempo real a una tasa de muestreo de 1 kHz (1 frame/s).</li>
	<li>Conectar un lado de la tubería a presión a la solución de KREBS presión llenado depósitos libre de burbujas, como las burbujas pueden introducir error experimental. Conecte el otro extremo de la tubería a presión a la cámara de órgano.</li>
	<li>Conectar los depósitos de presión de solución llenada de KREBS con el transductor de presión con un tubo limpio.</li>
	<li>Control de flujo intra-luminal mediante la regulación de la altura de estos dos embalses; así, cuando depósitos son colocados a la misma altura, no hay flujo intra-luminal ocurrirá.</li>
	<li>Una vez todos estos procesos, encender calefacción programa bloque y software para mantener la temperatura a 37 ° C. continuamente inundar el recipiente con solución de KREBS y airear con una mezcla de gas de 5% CO 2, 21% O 2 y 74% N 2 7 , 8 a lo largo de todo el procedimiento experimental.</li>
	<li>Para lograr la presión deseada inside la luz de los vasos aislados aumentar gradualmente la presión intraluminal (5 mmHg, cada 5 min) a través de la unidad de control de presión en el panel de interfaz mio, hacerlo a un ritmo lento para evitar el daño de la capa endotelial. 
	Nota: Una vez que la presión alcance 60 mm Hg, un período de 20-30 min equilibrado es necesaria para estabilizar la nave. Se realizan todos los estudios de la función vascular en 60 mmHg y 37 ° C a pH 7,4. 7</li></ol> 4. Evaluación de la función Microvascular adiposo Nota: en general, se puede produce vasodilatación endotelial dependiente de arteriola adiposo en respuesta a la fisiológica (fluir-inducido) y estímulos farmacológicos (inducida por Ach).
<ol><li><ol><li>La vasodilatación dependiente del endotelio, mediada por flujo después de presurización, registrar el diámetro de la arteriola grasa en reposo (Di). Esto se conoce como el diámetro basal reposo.</li>
		<li>Pre-constrict los vasos sanguíneos a ~ 55% del diámetro basal reposo (Dp) mediante la adición de 1 μl de endotelina-1 (ET-1, 10 &#8722; 10 M) directamente al baño y espere 5 minutos para el efecto. Repita este proceso hasta alcanzar el deseado ~ 55% previamente limitado estado.</li>
		<li>Después de la constricción, inducir flujo continuo en el espacio intraluminal de las arteriolas de tejido adiposo, en igualdad y direcciones opuestas de modo que una diferencia de presión puede ser desarrollada a través de la nave sin alterar la presión intraluminal media de 60 mm Hg. 
		Nota: por ejemplo, si un depósito se mueve hacia arriba por 10 cm de altura, otro debe mover hacia abajo 10 cm para modificar los gradientes de presión y así cambiar flujo intramural. Si se desean más precisas mediciones de tasa de flujo, un sistema medidor de flujo cuantitativo se puede aplicar al montaje experimental.</li>
		<li>Medir la dilatación mediada por flujo de 3-5 min después de la iniciación de la inducción de flujo. Los niveles de flujo intramural (gradientes de presión) pueden ser en el rango de 0 - 100 cmH 2 O. aumentar cada incremento de gradiente de presión Δ10 cmH 2 O cada 5-6 min., hasta un máximo de 100 cmH 2 O. 
		Nota: Para inducir el flujo laminar estable en el lumen, ambos tamaños de punta de cánula de vidrio tienen que estar muy cerca de diámetro interno de las arteriolas; de lo contrario, se produce flujo turbulento dentro del lumen e inducir errores de medición.</li>
		<li>Tras la evaluación del flujo-mediada por dilatación, devolver depósitos de presión a la misma altura (60 mmHg).</li>
		<li>Luego, arteriola y cámara de lavado quitando inmediatamente la solución de la cámara y reemplazar con la nueva solución de KREBS. Esto se hace con cuidado para no perturbar la arteriola suspendida dentro de la cámara de.</li>
		<li>Repetir este proceso 3 - 4 veces durante 20-30 minutos, o hasta que el buque aislado devuelve al diámetro basal reposo.</li>
	</ol></li> <li>Vasodilatación mediada por acetilcolina, dependiente de endotelio, <ol><li>cuando la arteriola adiposa ha vuelto al reclinación diámetro basal, la constricción vasos ~ 55% mediante la administración de endotelina-1 (ET-1, 10 &#8722; 10 M) directamente a la bañera, como se describe anteriormente en la sección 4.1.2.</li>
		<li>Después de la constricción, secuencialmente administrar dosis crecientes (2 μL) de la acetilcolina que es un receptor-medió, óxido nítrico agonista (Ach 10 -9 a 10 -5 M) directamente a la bañera. Registrar el cambio en el diámetro arteriolar 5 min después de la administración de cada dosis.</li>
		<li>Una vez que el buque ha llegado a una meseta después de la administración de la dosis final de Ach, lave el vaso 3 - 4 veces con solución de KREBS. Permitir que 20-30 min para el recipiente recuperar y devolver al diámetro basal de reposo. Para ayudar a mantener el pH en la comba de órgano, cambiar solución de KREBS cada 15 minutos</li>
	</ol></li> <li>Incubar la arteriola con N w - nitro - l-éster metílico de arginina (L-NAME, 10 -4 M), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa por 30 min y luego repetir 4.2.1 y 4.2.2 caracterizar la contribución relativa de el óxido nítrico a la vasodilatación mediada por Ach.</li>
	<li>Evaluar la vasodilatación independiente del endotelio (función del músculo liso vascular) y la viabilidad de buque por una administración secuencial de dosis creciente de la papaverina (10 -8 a 10 -4 M) directamente a la bañera. Si el diámetro del vaso no volver a, o exceden el diámetro inicial (Di) descanso en respuesta a la papaverina (es decir, vasodilatación apropiada), considerar que el buque no viables y descartar los puntos de datos.</li>
</ol> 5. Análisis de datos y cálculo <ol><li>calcular la reactividad vascular. Uso de vasodilatación por ciento para la expresión de datos representan diferencias basales diámetro del vaso y calcular mediante la siguiente ecuación: % vasodilatación = (DT-Dp/Di-Dp) × 100 donde DT es el diámetro registrado en un momento determinado (máximo diámetro), Dp es el diámetro registrado después de la adición del agente de vasoconstricción (es decir. ET-1 inducida por el diámetro de la constricción), y Di es el diámetro inmediatamente antes de la adición del agente de vasoconstricción (descanso diámetro basal). 9</li> <li>definir sensibilidad de vasodilatación y vasoconstricción (dosis-respuesta) a un agonista como la concentración de Ach, papaverina o ET-1 que provoca el 50% de la máxima respuesta (CE 50) que puede ser definido por un parámetro sigmoidal y trazada, como se describió anteriormente. 10 Nota: los estudios de reproducibilidad interobservador de la vasodilatación de microvessels del adiposa tiene un coeficiente de correlación alto (CC) de 0,99 (n = 10 experimentos de buque) en nuestro laboratorio.</li></ol>
 6. Análisis estadístico <ol><li>Express continua mediciones como la media ± SEM. Estos tienden a distribuirse normalmente. Analizar la reactividad vascular en arteriolas adiposas por medidas repetidas ANOVA dos vías.</li>
	<li>Por otra parte, comparar el área bajo la curva (AUC) de la parcela para vasodilatación acumulativa dosis-respuesta entre grupos de tratamiento. En todos los casos, considerar P &#60; 0.05 estadísticamente significativa.</li>
</ol>

<ol>
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Autores no tienen revelaciones o conflictos de interés al informe.

La disección y aislamiento de las arteriolas adiposas de los tejidos circundantes pueden ser un proceso desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva con atención al detalle y protocolo técnico. El procedimiento de microdisección requiere habilidades meticulosas y utensilios especializados la disección para evitar posibles daños en el músculo liso o endotelial celular capas de la microvascularización. Incluso pequeñas punciones accidentales en la pared arteriolar pueden prevenir presión intraluminal y resul...

Videomicroscopía es una técnica útil para examinar la función vasomotora de las arteriolas pequeñas de seres humanos vivos ex vivo. Nuestro laboratorio se ha centrado en la disección de pequeños microvasos de tejido adiposo diferentes compartimentos para caracterizar los efectos de varios microambientes adiposas en la microvascularización. Una gran ventaja de esta técnica es que los vasos sanguíneos extraídos del cuerpo humano funcionales y puede ser examinados fácilmente dentro de minutos a horas después de la biopsia. Condiciones fisiológicas son mímico y constante presión transmural en el espacio intraluminal a través de cánulas micro-vidrio que recapitular muchas características en vivo . 1 , 2 además, un montaje de videomicroscopía confiable con el software de detección de borde automática permite evaluación cualitativa y cuantitativa de capacidad de vasodilatador y vasoconstrictor dependiente de endotelio - independiente y de aislados Barcos en tiempo real, que permite rápida evaluación fisiológica en respuesta a estímulos físicos y farmacológicos. 3 otras técnicas microvasculares también están disponibles como alambre miografía que tiende a ser mucho menos tiempo y medir las respuestas de tensión a varios agonistas por un transductor de fuerza.
Nuestro laboratorio ha aplicado videomicroscopía para examinar la relación entre obesidad y disfunción vascular, centrándose en los efectos de los dominios diferentes de tejido adiposo en la vasculatura. Adiposidad central con acumulación de grasa visceral abdominal ha estado más estrechamente vinculada a la producción de adipocitoquinas, disfunción metabólica y riesgo cardiometabólico. Se ha postulado que la disfunción del tejido adiposo con exceso de producción de disregulación de citocinas y adipoquinas pro-aterogénico están fuertemente implicados en estos procesos, pero moléculas reguladoras específicas y los objetivos del tratamiento siguen siendo en gran parte sin descubrir. 4 por otra parte, en el nivel local del tejido adiposo, rarefacción capilar y alteración de la perfusión se han relacionado con tejido adiposo pseudohypoxia y dysregulation metabólico. La hipótesis de que la enfermedad cardiovascular puede ser la consecuencia de la disfunción del tejido adiposo está evolucionando. Pro-aterogénico mediadores liberados de la grasa, particularmente en asociación con adiposidad central/visceral, probablemente promueven la disfunción endotelial y patógenos cambios vasculares que se pueden manifiestan localmente en la vasculatura adiposa y detectan mediante la Aquí se describe la metodología. 5
La evaluación funcional de las arteriolas aisladas del tejido adiposo es un enfoque útil para comprender la fisiopatología y mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular en la obesidad humana. Para investigar los mecanismos que contribuyen a la disfunción específicos de depósito de grasa, se han desarrollado métodos para examinar dependiente del endotelio y - independiente respuestas vasodilatadoras de la microvascularización y evaluar la expresión de diversos regulatorios candidatos en muestras pareadas de visceral y subcutáneas (SC) tejido graso obtenidos de sujetos obesos en el momento de la cirugía bariátrica.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemical Name&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra acetic acid (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&lt;em&gt;w&lt;/em&gt;&lt;/sub&gt;-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; )</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Finescience tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Zeiss Achromat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory tubing</td><td>Euro-Pharm</td><td>250100306F999</td><td></td></tr><tr><td>Needle/pippette puller</td><td>David kopf instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic monofilament nylon suture</td><td>Surgical specialties</td><td>A7756N</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Finescience tools</td><td>150000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Chamber</td><td>DMT</td><td>VAS v.2.1</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of human adipose tissue microvascular function using videomicroscopy

Mientras que la obesidad está estrechamente relacionada con el desarrollo de enfermedad metabólica y cardiovascular, poco se sabe sobre los mecanismos que rigen estos procesos. Se presume que mediadores pro-aterogénico de tejido graso especialmente en asociación con adiposidad central/visceral pueden promover cambios vasculares patógenos localmente y sistémicamente, y la idea de que la enfermedad cardiovascular puede ser la consecuencia de la disfunción del tejido adiposo sigue evolucionando. Aquí, describimos un método único de videomicroscopía que involucra el análisis de las respuestas de vasodilatador y vasoconstrictor de las arteriolas humanas pequeño intactas extraídas el depósito adiposo de seres humanos vivos. Videomicroscopía se utiliza para examinar propiedades funcionales de microvasos aislado en respuesta a estímulos fisiológicos o farmacológicos utilizando un sistema de presión que imita las condiciones de en vivo . La técnica es un método útil para comprender la fisiopatología y mecanismos moleculares que contribuyen a la disfunción vascular localmente en el medio del tejido adiposo. Por otra parte, alteraciones en la microcirculación del tejido adiposo también se han relacionado con enfermedades sistémicas. Aplicamos esta técnica para examinar las respuestas vasculares específicas de depósito en sujetos obesos. Se evaluó la vasodilatación dependiente del endotelio a aumento del flujo y de la acetilcolina en las arteriolas adiposas (50-350 μm de diámetro interno, 2-3 mm de longitud) aisladas de dos diferentes depósitos adiposos durante cirugía bariátrica desde el mismo individuo. Hemos demostrado que las arteriolas de la grasa visceral exhiben deterioro vasodilatación dependiente del endotelio en comparación con los vasos aislados del depósito subcutáneo. Los resultados sugieren que el microambiente visceral se asocia con disfunción endotelial vascular que puede ser relevante para la observación clínica a mayor adiposidad visceral a los mecanismos de la enfermedad sistémica. La técnica de videomicroscopía puede utilizarse para examinar fenotipos vasculares de diferentes depósitos de grasa, así como comparar los resultados a través de individuos con diferentes grados de disfunción metabólica y obesidad. El método puede utilizarse también para examinar las respuestas vasculares longitudinalmente en respuesta a las intervenciones clínicas.

Nuestro laboratorio ha utilizado videomicroscopía examinar dependiente del endotelio y - vasodilatación independiente, así como función vasoconstrictoras de tejido adiposo arteriolas aisladas de grasa subcutánea y visceral de los seres humanos obesos. El montaje experimental característica se muestra en la figura 1A. Tejido adiposo arteriolas están suspendidas entre dos pipetas capilares de vidrio y aseguradas en su lugar con suturas dentro de la cáma...

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Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Evaluación de la función Microvascular del tejido adiposo humano mediante videomicroscopía

Sistemas de videomicroscopía se utilizan para examinar propiedades funcionales de las arteriolas aisladas de tejido adiposo en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos. Esta técnica se puede utilizar para examinar fenotipos microvasculares en dominios diferentes de tejido adiposo en humanos obesos.

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

7.4K vistas.  Boston University School of Medicine. Sistemas de videomicroscopía se utilizan para examinar propiedades funcionales de las arteriolas aisladas de tejido adiposo en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos. Esta técnica se puede utilizar para examinar fenotipos microvasculares en dominios diferentes de tejido adiposo en humanos obesos.

Video: Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

La evaluación no invasiva de la función endotelial microvascular y

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Investigación

Medicina

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

Un enfoque metodológico para las evaluaciones no invasivas de la función vascular y Morfología

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate postprandial delivery of nutrients and hormones to insulin-sensitive tissues. We here describe a technique for combining intravital microscopy (IVM) and contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) of the adductor compartment of the mouse hindlimb to simultaneously visualize muscle resistance arteries and perfusion of the microcirculation in vivo. Simultaneously assessing insulin's effect at multiple levels of the vascular tree is important to study relationships between insulin's multiple vasoactive effects and muscle perfusion. Experiments in this study were performed in mice. First, the tail vein cannula is inserted for the infusion of anesthesia, vasoactive compounds and ultrasound contrast agent (lipid-encapsulated microbubbles). Second, a small incision is made in the groin area to expose the arterial tree of the adductor muscle compartment. The ultrasound probe is then positioned at the contralateral upper hindlimb to view the muscles in cross-section. To assess baseline parameters, the arterial diameter is assessed and microbubbles are subsequently infused at a constant rate to estimate muscle blood flow and microvascular blood volume (MBV). When applied before and during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp, combined IVM and CEUS allow assessment of insulin-induced changes of arterial diameter, microvascular muscle perfusion and whole-body insulin sensitivity. Moreover, the temporal relationship between responses of the microcirculation and the resistance arteries to insulin can be quantified. It is also possible to follow-up the mice longitudinally in time, making it a valuable tool to study changes in vascular and whole-body insulin sensitivity.

Insulin-induced vasodilation regulates muscle perfusion and increases the microvascular surface area (microvascular recruitment) available for solute exchange between blood and tissue interstitium. Combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography is presented to simultaneously assess insulin&#39;s action at the larger vessels and the microcirculation in vivo.

Combina la microscopia Intravital y ecografía de contraste de la trasera de ratón para estudiar la perfusión muscular y vasodilatación inducida por la insulina

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Co de tinción de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en el tejido adiposo

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Inmunología e Infección

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Bioingeniería

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Biología

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...