Agradecemos Moustafa Saleh e Jay Tourigny pela leitura crítica do manuscrito e Steven Hahn e Steven Henikoff para orientação e apoio durante o desenvolvimento do ChEC-seq e sua aplicação ao complexo do Mediador. O SG é suportado por concessões do NIH R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ é suportado pelos fundos de inicialização da Universidade de Indiana.

1. Geração de cepas de fermento <ol><li> Gerar uma cepa de fermento com o fator de interesse etiquetado com MNase. <ol><li> O PCR amplifica a cassete de marcação MNase do vetor desejado ( Tabela 1 ) usando a mistura de reação especificada ( Tabela 2 ) e condições de ciclagem ( Tabela 3 ). Misture 5 μL da reação de PCR e 1 μL de corante de carga de DNA 6X. Execute cada alíquota de PCR em um gel de agarose a 0,8% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de ~ 2,3 kb. </li><li> Transforme a cassete de marcação amplificada para a tensão de escolha usando a transformação padrão de acetato de lítio 22 e execute a seleção. </li><li> Verifique a integração correta da cassete de marcação com PCR de colônia. <ol><li> Prepare a mistura de reação especificada ( Tabela 4 ) para o número de colônias a serem selecionadas. Mantenha-se gelado até ser necessário. </li><li> Escolha uma porção de cada colônia para ser tesDeslizou-se no fundo de um tubo de PCR usando um palito de palito esterilizado ou uma pipeta. </li><li> Microondas as colônias colhidas com alta potência durante 1 min. </li><li> Adicione 50 μL de mistura de PCR ( Tabela 4 ) a cada colônia de microondas e pipetar para cima e para baixo para misturar. Execute PCR usando as condições de ciclagem especificadas ( Tabela 5 ). </li><li> Misture os 50 μL de reação de PCR e 10 μL de corante de carga de DNA 6X diretamente em cada tubo de PCR. Executar 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 1% a 120 V durante 40 min. O tamanho esperado do produto é de 700 pb. NOTA: Se desejado, verifique a expressão apropriada da proteína de fusão MNase por Western Blot. É esperada uma mudança de ~ 20,6 kilodalton no peso molecular da proteína marcada. </li></ol></li></ol></li><li> Gerar uma linhagem de MNase livre por clonagem baseada em homologia do promotor do gene de interesse em pGZ136 (Tabela 1) e transformação e seleção como no passo 1.1.2. <ol><li> AlternatiPor exemplo, montar o promotor do gene de interesse e 3xFLAG-MNase-SV40 NLS em um vetor plasmídico, transformar e selecionar como no passo 1.1.2 e cultivar a deformação na condição seletiva apropriada para a manutenção do plasmídeo. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> À tarde / noite do dia anterior ao experimento ChEC, inocule 3 mL de levedura-peptona-dextrose (YPD) ou meio seletivo apropriado com uma única colônia da cepa que contém o fator marcado com MNase. Incubar esta cultura durante a noite (agitação de 180 RPM, 30 ° C). </li><li> Na manhã do dia do experimento ChEC, diluir a cultura durante a noite em 50 mL de meio para uma densidade óptica a 600 nm (OD 600 ) de 0,2 a 0,3. Incubar esta cultura (180 RPM agitando, 30 ° C) até atingir uma DO 600 de 0,5-0,7. À medida que a cultura se aproxima do OD 600 apropriado, coloque o bloco de calor ou o banho de água a 30 ° C e comece a descongelar os aditivos Buffer A ( TaBle 6). </li><li> Prepare 5 mL de aditivos Buffer A plus ( Tabela 6 ) por cultura. Mantenha o buffer A na RT durante o procedimento. </li><li> Prepare tubos de microcentrífuga contendo 90 μL de solução de parada ( Tabela 7 ) e 10 μL de SDS a 10% para cada ponto de tempo a ser coletado. Para cada novo fator analisado, faça amostras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min. </li><li> Decantar a cultura em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar a 1.500 xg e a temperatura ambiente (RT) durante 1 min. </li><li> Ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A e transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente as células em 1 mL de tampão A por pipetagem para cima e para baixo. Pellets ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 xg e RT por 30 s. Repita este passo uma vez. </li><li> Ressuspender completamente as células em 570 μL de tampão A. Adicionar 30 μL de 2% de digitonina(0,1% de concentração final) para facilitar a permeabilização das células e inverter para misturar. </li><li> Permeabilize células em bloco de calor ou banho-maria a 30 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células. Remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas como um controle negativo para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS (passo 2.4) e vortex brevemente para misturar. </li><li> Adicione 1,1 μL de CaCl2 1 M (concentração final 2 mM) a células permeabilizadas para ativar MNase e inverter várias vezes rapidamente ou vortex brevemente para misturar. Volte imediatamente a reação mista a 30 ° C e comece um temporizador. </li><li> Em cada ponto de tempo a ser coletado, pipetar a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme de células, então remova uma alíquota de 100 μL de células permeabilizadas para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS e vortex brevemente para misturar. Para cada novo fator analisado, tome 0 s (não adicionou CaCl 2 ), 30 s1 minuto, 2,5 min, 5 min e 10 minutos. NOTA: Experimentos de ChEC com fatores que rapidamente escinham DNA a 30 ° C podem ser realizados a temperaturas mais baixas para diminuir a cinética de clivagem de MNase. </li><li> Uma vez que todos os pontos de tempo foram coletados, adicione 4 μL de 20 mg / mL de proteinase K a cada amostra, vortex brevemente para misturar e incuba a 55 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 200 μL de fenol: cloroformo: álcool isoamílico a cada amostra, vortex vigorosamente para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min. </li><li> Remova cada fase aquosa (~ 150 μL) para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Vortex vigorosamente para misturar e precipitar em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa. </li><li> O precipitado precipitou DNA à velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min. </li><li> Decantar sobrenadantes e granulados de lavagem com 1 mL de RT 70% de etanol. </li><li> Decantar o etanol, remover o restante invando umD suavemente tocando os tubos em uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min. </li><li> Enquanto os grânulos estão secando, faça uma mistura principal para ressuspender os grânulos secos em 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μL de RNase A 10 mg / mL cada. Digerir ARN a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Misture 1 μL de corante de carga de DNA 6X com 5 μL de cada amostra e execute um gel de agarose a 1,5% a 120 V durante 40 min. </li></ol> 3. Seleção de tamanho NOTA: O objetivo da seleção de tamanho é remover fragmentos multi-kilobase de DNA genômico da amostra para ser sequenciado e enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente o tamanho do DNA nucleossômico) ou menor. Na sequenciação de dados, fragmentos &lt;400 pb são enriquecidos, com um pico notável em torno do tamanho do DNA nucleossômico (~ 150 pb) e uma distribuição máxima ou ampla de fragmentos subnucleosômicos. &lt;Ol&gt; <li> Para cada amostra, adicione 75 μL de contas de imobilização reversível em fase sólida (SPRI) em uma solução de polietileno glicol (PEG) 23 e pipetar para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Incubar a contagem: mistura de DNA à TA por 5 min. </li><li> Durante a incubação do talão de SPRI, prepare tubos de microcentro contendo 96 μL de Tris 10 mM, pH 8,0 e 4 μL de NaCl 5 M para cada amostra. </li><li> Coloque os tubos num suporte magnético para coletar os grânulos no lado do tubo. Permitir que as pérolas coletem no lado do tubo por 2 min. </li><li> Transfira cada sobrenadante para um novo tubo contendo Tris e NaCl (passo 3.2). </li><li> Adicionar 200 μL de fenol: clorofórmio 25: 24: 1: álcool isoamílico a cada amostra, vórtice para misturar e centrifugar a velocidade máxima e RT em uma microcentrífuga por 5 min. </li><li> Remova cada fase aquosa para um novo tubo. Adicione 30 μg de glicogênio e 500 μL de etanol a 100%. Precipitar o DNA em gelo seco durante 10 minutos ou até a solução ser viscosa. </li><li> Pellet preciADN catiônico na velocidade máxima e 4 ° C em uma microcentrífuga por 10 min. </li><li> Decantar os sobrenadantes e lavar os grânulos com 1 mL de etanol a 70%. </li><li> Decantar o etanol, removendo o restante invando e batendo suavemente os tubos sobre uma toalha de papel. Gire rapidamente as amostras usando uma centrífuga de mesa e use uma pipeta para remover o etanol residual, tomando cuidado para não perturbar a pelotização. Pellets secos ao ar à TA durante 5 min. </li><li> Ressuspender os grânulos secos em 25 μL de Tris, pH 8,0. Determine a concentração da amostra usando um teste de alta sensibilidade. Para experiências TF ChEC, o DNA 10-100 ng é rotineiramente recuperado após a seleção do tamanho. </li><li> Prepare bibliotecas de seqüenciamento. Os protocolos de preparação de bibliotecas que não dependem da seleção de tamanho, como descrito anteriormente 24 , são desejáveis ​​para permitir o seqüenciamento de uma grande variedade de tamanhos de fragmentos (25-500 pb). </li><li> Bibliotecas de seqüência no modo pareado. Um mínimo de 25 bases de sequência em cada extremidade é necessário para leitura de alta qualidademapeamento. Entre 1 e 2 milhões de leituras fornece cobertura suficiente para uma amostra ChEC. NOTA: A análise dos dados do ChEC-seq é um procedimento complexo e além do alcance deste artigo. Informações detalhadas sobre análise de dados podem ser encontradas nas publicações anteriores 1 , 21 e os scripts personalizados usados ​​para análise estão disponíveis no GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) também pode ser usado para análise de linha de comando de dados ChEC-seq. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Mostramos que o ChEC pode mapear diversas classes de proteínas de levedura na cromatina e antecipar que será amplamente aplicável a diferentes famílias de TFs e outros fatores de ligação à cromatina na levedura. O ChEC-seq é vantajoso porque não requer reticulação, solubilização da cromatina ou anticorpos. Assim, o ChEC evita artefactos potencialmente presentes no X-ChIP-seq, como o artefato 3 , 4 e o Chip nativo hiper-ChIPable, como os falsos negat...

O mapeamento dos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs), remodeladores de cromatina e outros fatores reguladores associados à cromatina é fundamental para entender todos os processos baseados em cromatina. Embora as abordagens de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (ChIP-seq) tenham sido usadas para obter muitos pontos de vista importantes sobre a biologia do genoma, eles apresentam limitações notáveis. Introduzimos recentemente um método alternativo, denominado clivagem endógena de cromatina e seqüenciamento de alto rendimento (ChEC-seq) 1 , para contornar essas desvantagens. O ChIP-seq é mais frequentemente realizado com um passo inicial de reticulação de formaldeído (X-ChIP-seq) para preservar as interações proteína-DNA. No entanto, uma série de estudos recentes indicaram que X-ChIP-seq captura interações transiente ou inespecífica proteína-DNA 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , dando origem a falsos locais de ligação positiva. Além disso, a sonicação, comumente usada para fragmentar a cromatina em experimentos X-ChIP-seq, preferencialmente cisa regiões de cromatina aberta, levando a recuperação tendenciosa de fragmentos dessas regiões 9 , 10 . A sonicação também produz uma mistura heterogênea de comprimentos de fragmentos, limitando, em última instância, a resolução do local de ligação, embora a adição de um passo de digestão com exonuclease possa melhorar muito a resolução 11 , 12 . Os métodos ChIP nativos, tais como regiões ocupadas de genomas, de cromatina naturalmente isolada purificada por afinidade (ORGÂNICO) 13 não utilizam reticulação e fragmentação de cromatina com nuclease microcócica (MNase), aliviando vieses de potencial associadas à reticulação de formaldeído e sonicação. Contudo,A solubilidade de muitas proteínas ligadas à cromatina sob as condições relativamente suaves requeridas para a extração nativa da cromatina é fraca, potencialmente levando a uma redução do alcance dinâmico e / ou falsos negativos 14 . Enquanto várias iterações de ChIP-seq são mais comumente usadas para mapeamento genômico de interações proteína-DNA, várias técnicas de mapeamento baseadas na fusão de proteínas de interesse para várias enzimas modificadoras de DNA também foram implementadas. Uma dessas abordagens é a identificação de DNA adenina metiltransferase (DamID) 15 , em que uma proteína de ligação à cromatina de interesse é geneticamente fundida em Dam e esta fusão é expressa em células ou animais, resultando em metilação de sequências de GATC proximais a locais de ligação para a proteína. DamID é vantajoso porque não depende da imunoprecipitação e evita a reticulação, os anticorpos ou a solubilização da cromatina. Também é realizado in vivo . Contudo, A resolução de DamID é limitada à escala de kilobase e a atividade de metilação da proteína de fusão de Dam é constitutiva. Um segundo método baseado na fusão enzimática é Calling Card-seq 16 , que emprega a fusão de um fator de interesse para uma transposase, direcionando a integração específica do site para os transposões. Como DamID, o Calling Card-seq não é baseado na imunoprecipitação e, portanto, tem vantagens semelhantes, com o benefício adicional de uma maior resolução. No entanto, Calling Card-seq pode ser limitado por viés de sequência das transposases e também depende da presença de locais de restrição próximos aos locais de inserção do transposão. Um terceiro método de fusão enzimática, desenvolvido no laboratório de Laemmli, é clivagem endógena da cromatina (ChEC) 17 . No ChEC, uma fusão entre uma proteína associada à cromatina e MNase é expressa nas células, e após a adição de cálcio para ativar a MNase, o DNA é cortado proximal aos locais de ligação para os marcadosFator ( Figura 1 ). Em conjunto com Southern Blot, o ChEC tem sido usado para caracterizar a estrutura da cromatina e a ligação de proteínas em vários loci individuais em leveduras 17 , 18 e foi combinado com análise de microarrays de baixa resolução para investigar a interação de componentes de poros nucleares com o fermento Genoma 19 . O ChEC oferece benefícios semelhantes a DamID e Calling Card-seq, e sua resolução é quase um par de bases únicas quando analisado pela extensão primária 19 . O ChEC também é controlável: a clivagem de DNA robusta por MNase depende da adição de cálcio milimolar, garantindo que o MNase seja inativo nas baixas concentrações de cálcio livres observadas em células de fermento vivas 20 . Anteriormente, postulamos que a combinação de ChEC com sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq) proporcionaria mapas de alta resolução de sites de ligação TF. Na verdade, ChEC-seq gerou mapas de alta resolução dos fatores reguladores gerais de fermento em broto (GRFs) Abf1, Rap1 e Reb1 em todo o genoma 1 . Também aplicamos o ChEC-seq com sucesso ao complexo Mediador modular, um coativador transcriptional global conservado e conservado 21 , expandindo a aplicabilidade dos complexos ChEC-seq para megadalton-size que não contatam diretamente o DNA e podem ser difíceis de serem mapeados pelo ChIP- Métodos baseados. O ChEC-seq é um método poderoso tanto para validação independente de resultados de ChIP-seq quanto para geração de novas idéias sobre a regulação de processos de residência de cromatina. Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a implementação deste método em fermento em brotamento.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 high-fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, High Purity</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td></tr><tr><td>MagneSphere magnetic rack</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

O mapeamento genômico de interações proteína-DNA é crítico para a compreensão da regulação de genes, remodelação de cromatina e outros processos residente em cromatina. A reticulação de formaldeído seguida de imunoprecipitação com cromatina e sequenciação de alto rendimento (X-ChIP-seq) tem sido usada para obter muitas informações valiosas sobre a biologia do genoma. No entanto, X-ChIP-seq tem limitações notáveis ​​ligadas à reticulação e sonicação. O ChIP nativo evita essas desvantagens ao omitir reticulação, mas muitas vezes resulta em uma recuperação fraca de proteínas ligadas à cromatina. Além disso, todos os métodos baseados em ChIP estão sujeitos a considerações de qualidade de anticorpos. Métodos enzimáticos para mapear interações proteína-DNA, que envolvem a fusão de uma proteína de interesse para uma enzima modificadora de DNA, também foram utilizados para mapear interações proteína-DNA. Recentemente, combinamos um desses métodos, clivagem endógena de cromatina (ChEC), com sequenciação de alto rendimento como ChEC-seq. ChEC-seq depende da fusão de uma cromatina-assocProteína de interesse para a nuclease microcócica (MNase) para gerar clivagem de DNA direcionada na presença de cálcio nas células vivas. O ChEC-seq não se baseia na imunoprecipitação e evita possíveis preocupações com reticulação, sonicação, solubilização da cromatina e qualidade de anticorpos, ao mesmo tempo que fornece mapeamento de alta resolução com sinal mínimo de fundo. Nós imaginamos que o ChEC-seq será uma contrapartida poderosa para o ChIP, proporcionando um meio independente para validar as descobertas do ChIP-seq e descobrir novas idéias sobre a regulação genômica.

No caso de um experimento de ChEC bem sucedido, a análise do DNA por eletroforese em gel de agarose revelará um aumento dependente do cálcio na fragmentação do DNA ao longo do tempo, conforme indicado por manchas e eventual digestão completa do DNA genômico. Em alguns casos, observa-se uma escala de bandas semelhante à observada com uma digestão MNase tradicional após a digestão prolongada. Este é o caso da análise ChEC do Reb1, um fator regulatório geral que liga as regiõ...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K visualizações.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase). 

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Genética

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Bioquímica

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologia

Isolamento de cromatina específico de locus de células de levedura

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa da cromatina e superando as limitações com um protocolo de isolamento de cromatina específico para locus de alto enriquecimento 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em

Resumo

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Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas