Name: a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
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Agradecemos o pessoal dentro do Instituto de genética humana para sequenciamento e preparação de biblioteca NGS. Agradecemos Einat Snir por sua experiência na preparação de fragmentos de biblioteca genômica para a biblioteca do plasmídeo Y2H feita aqui. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e pelo NSF Grant de projeto de pesquisa: 1517110.

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Os autores não têm nada a divulgar

Aqui nós fornecemos um guia de como realizar ensaios Y2H em lote usando métodos otimizados. Existem alguns passos críticos no procedimento para ajudar a garantir que a população de levedura que devem ser colocada sob seleção é representante da biblioteca de partida e que suficiente da população inicial de fermento é usado para se submeter a seleção para limitar a variabilidade . Importante, estes parâmetros são relativamente fáceis de alcançar ao lado de adaptar os métodos e materiais para um ensaio de ...

Um entendimento completo dos processos biológicos de célula depende de encontrar as redes de interação de proteínas que fundamentam seus mecanismos moleculares. Uma abordagem para identificar as interações da proteína é ensaio fermento 2-híbrido (Y2H), que trabalha pela montagem de um fator de transcrição quimérico funcionamento uma vez que os dois domínios da proteína de interesse ligam para um outro1. Uma tela típica de Y2H é realizada através da criação de uma população de levedura que abriga tanto uma biblioteca de plasmídeos codificação interação proteínas fundidas a um ativador transcricional (ex., 'presas' a proteína de fusão) e um determinado 'isca' plasmídeo composto da proteína de interesse fundido a um domínio de ligação do DNA (por exemplo, o domínio de Gal4 DNA-ligando que vincula-se à sequência de ativação Gal4-upstream). Uma das principais vantagens da abordagem Y2H é que é relativamente fácil e barata para realizar em um laboratório típico equipada para trabalho rotineiro de biológica molecular2. No entanto, quando tradicionalmente realizada, um usuário amostras colônias individuais que surgem em seleção para uma interação positiva de Y2H. Isto limita severamente o número de clones 'presas' biblioteca que podem ser pesquisados. Este problema é agravado quando a abundância de uma particular interação presa é muito elevada em relação às outras, diminuindo a chance de detecção de interação de plasmídeos de rapina baixa abundância.
Uma solução para usando o princípio de Y2H em uma cobertura abrangente da proteoma é o uso de uma abordagem de matriz formatada no qual uma matriz contendo plasmídeos conhecido presas individuais pode ser interrogada digitalmente. No entanto, essa abordagem exige uma infra-estrutura que não é prontamente acessível ou rentável para os investigadores que estão interessados em definir a interactome de um pequeno número de proteínas ou domínios3. Além disso, bibliotecas de rapina muito complexo que podem codificar vários fragmentos de interação de proteínas que expandir o tamanho do como matrizes matriz para tamanhos impraticáveis. Uma alternativa é realizar ensaios com bibliotecas complexas em lotes e avaliar a presença de interação clones usando sequenciamento de elevado-throughput maciço paralelo4. Isto pode ser aplicado para ensaiar a presença de plasmídeos de rapina que surgem em várias colônias usando um típico Y2H formatado abordagem em qual fermento habitação um par de interação de proteínas da fusão de células podem crescer em uma placa de5,6. Esta ideia geral pode ser acentuada para aumentar a consulta de ambos várias iscas e presas componentes ao mesmo tempo7,8.
Ainda assim, muitas investigações exigem que um mais fácil ainda mais focado esforço em apenas algumas proteínas 'iscas' e podem se beneficiar mais de uma consulta exaustiva e semi-quantitativa de uma biblioteca de rapina complexo único. Temos desenvolvido e validado uma abordagem para realizar estudos de interação de proteínas em larga escala usando um princípio de Y2H em formato de lote4. Isto usa a taxa de expansão de um plasmídeo presa particular como um proxy para a força relativa da interação de Y2H9. Sequenciamento profundo de todos os plasmídeos dentro de uma população submetida ao crescimento normal ou condições de crescimento seletivo produz um mapa completo de clones que geram interações de Y2H forte e fracas. O repertório de interactianos pode ser obtido e comparado diretamente através de múltiplos isca plasmídeos. O fluxo de trabalho resultante denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), portanto, pode ser usado para identificar interactomes diferencial das bibliotecas de rapina mesmo para identificar proteínas, permitindo a comparação entre uma proteína vs outro.
Aqui, demonstramos DEEPN e introduzir melhorias nos métodos laboratoriais que facilitam a sua utilização, que são descritos na Figura 1. Melhorias significativas incluem:
Geração de populações de presas fermento. Um dos principais requisitos de DEEPN está gerando populações de levedura com diferentes isca plasmídeos que têm a mesma distribuição das bibliotecas de rapina do plasmídeo. Populações de equivalente de linha de base da biblioteca do plasmídeo presa são essenciais para fazer comparações precisas entre o interactomes de iscas diferentes. Isto é melhor alcançado quando um plasmídeo de biblioteca já está alojado em uma população de levedura haploide e entrando um plasmídeo isco dado que a população é alcançado pelo acasalamento para produzir um diploides. Aqui, nós fornecemos um guia claro em como fazer tais populações usando bibliotecas comerciais alojadas em leveduras haploides. Embora não tenhamos encontrado métodos que geram um número elevado de diploides, a eficiência global de acasalamento destas cepas de leveduras contendo biblioteca comercial foi baixa. Portanto, nós construímos uma nova tensão que pode abrigar presas bibliotecas que rende muito mais diploides por reação de acasalamento.
Novo conjunto de isca plasmídeos. Muitos plasmídeos atuais que expressam proteínas da fusão 'isca' compostas da proteína de interesse e um domínio de ligação a DNA são baseados em 2µ, permitindo-lhes ampliar seu número de cópia. Este número de cópia pode ser bastante variável na população e levar a variabilidade na resposta transcricional de Y2H. Isto por sua vez poderia inclinar a capacidade de medir a força de uma interação de proteína dada baseada a resposta de crescimento das células de seleção. Isto pode ser parcialmente endereço usando um plasmídeo cópia baixa, alguns dos quais têm sido descritos anteriormente como o comercialmente disponível pDEST3210. Nós construímos um nova isca do plasmídeo (pTEF-GBD) que produz proteínas da fusão Gal4-DNA-ligando domínio dentro de um plasmídeo de cópia baixa baseada em Centrómero TRP1 carreg o gene de resistência de Kanr que também permite a clonagem de fragmentos de isca contra a corrente e a jusante do domínio Gal4 DNA-ligando.
Biblioteca de fragmento de novo high-density Y2H. Temos construído um plasmídeo novo para bibliotecas de rapina Y2H casa e usou para construir uma biblioteca de Y2H altamente complexa feita de distorcida aleatoriamente fragmentos de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae. Análise de sequência mostrou que esta biblioteca tinha mais 1 milhão de elementos diferentes, muito mais complexos do que descritas anteriormente fermento Y2H genômica plasmídeo bibliotecas11. Com essa nova biblioteca, fomos capazes de mostrar que o fluxo de trabalho do DEEPN é robusto o suficiente para acomodar o complexas bibliotecas com muitos plasmídeos diferentes de uma forma que é confiável e reprodutível.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>deep sequencing platform</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-HA antibodies</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-myc antibodies</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>Research Products International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>used for making DNA agarose gels</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Research Products International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sodium Salt</td><td>Research Products International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract Powder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>used for making media plates in section 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td></tr><tr><td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td></tr><tr><td>KAPA Hyper Prep kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>preparation kit for deep sequencing</td></tr><tr><td>Codon optimization</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Codon optimization</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td></tr><tr><td>Strings</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>high performance ultra-sonicator in section 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&amp;rsquo;- CGGTCTT&lt;br/&gt; CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 5&#039; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&amp;rsquo;-GAGTAACG&lt;br/&gt; ACATTCCCAGTTGTTC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 5&#039; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&amp;rsquo;-CACCGTAT&lt;br/&gt; TTCTGCCACCTCTTCC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 3&#039; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&amp;rsquo;-GCAACCGC&lt;br/&gt; ACTATTTGGAGCGCTG-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 3&#039; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligonucleotide 5&amp;rsquo;-GTTCCGATG&lt;br/&gt; CCTCTGCGAGTG-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>5&#039; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5&amp;rsquo;-GCACATGCT&lt;br/&gt; AGCGTCAAATACC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>3&#039; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5&amp;rsquo;-ACCCAAGCA&lt;br/&gt; GTGGTATCAACG-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>5&#039; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5&amp;rsquo;- TATTTAGA&lt;br/&gt; AGTGTCAACAACGTA -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>3&#039; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA yeast strain</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-activation domain expression plasmid</td></tr><tr><td>100 mm petri dishes</td><td>Kord-Vallmark sold by VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serological Pipette</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipette</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Serological Pipette</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL graduated cylinder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>used to measure the Optical Density of cells</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td></tr><tr><td>Electronic UV transilluminator</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 &amp;micro;L Low Retention Pipette Tips</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;LLow Retention Pipette Tips</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L XL Low Retention Pipette Tips</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Wooden applicators</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>microcentrifuge</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>benchtop centrifuge</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>Secondary Antibody</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Secondary Antibody</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL detection solution</td></tr><tr><td>Isotemp Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Incubator</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Shaking incubator</td></tr><tr><td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>water bath</td></tr><tr><td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>commercially available cDNA Library</td></tr><tr><td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>commercially available cDNA Library</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Vector</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>commercially available DNA-BD Vector</td></tr><tr><td>Biolase DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>DNA polymerase used for section 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>pcr machine</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

Triagem para interações da proteína-proteína usando o ensaio de 2-híbrido de levedura tem sido uma ferramenta eficaz, mas seu uso foi em grande parte limitado à descoberta de interactianos de alta afinidade que são altamente enriquecido na biblioteca dos candidatos interagindo. Em um formato tradicional, o ensaio 2-híbrido de levedura pode render muitas colônias para analisar quando conduzido no rigor baixa onde os interactianos de baixa afinidade podem ser encontrados. Além disso, sem uma interrogação abrangente e completa da mesma biblioteca contra diferentes isca plasmídeos, uma análise comparativa não pode ser alcançada. Embora alguns destes problemas podem ser abordados usando bibliotecas de matriz presa, o custo e a infra-estrutura necessária para operar essas telas podem ser proibitivos. Como alternativa, adaptámos o ensaio 2-híbrido de levedura para descobrir simultaneamente dezenas de transiente e interações proteína estático dentro de uma única tela utilizando uma estratégia denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), que incorpora o sequenciamento de DNA do elevado-throughput e computação para acompanhar a evolução de uma população de plasmídeos que codificam parceiros interagindo. Aqui, descrevemos reagentes personalizados e protocolos que permitem que uma tela DEEPN a ser executado de modo fácil e econômico.

O ensaio de Y2H tem sido amplamente utilizado para encontrar interações da proteína: proteína e várias adaptações e sistemas foram desenvolvidos. Na maior parte, as mesmas considerações que ajudam a garantir o sucesso com estas abordagens anteriores são importantes para DEEPN. Alguns dos pontos de referência importantes incluem: garantindo a expressão do domínio de ligação a DNA proteínas da fusão, garantindo um baixo fundo de espúrias + seu crescimento nos diploides que...

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.3K visualizações.  University of Iowa. Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Vídeo: A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Bioquímica

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Genética

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imunologia e Infecção

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biologia

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Estudos de interação biomolecular usando a técnica de dois híbridos de levedura 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

Autor em destaque: Isolamento aprimorado de mutantes de interação nula em levedura

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Resumo

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Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

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Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

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