Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e pelo NSF Grant de projeto de pesquisa: 1517110.

1. mapeamento de arquivos de Fastq
Nota: DEEPN software, bem como muitos programas de Bioinformática usam dados de sequência de DNA onde cada sequência ler foi mapeada para a sua posição em referência DNA. Uma variedade de programas de mapeamento pode ser usada para esta incluindo a interface MAPster aqui que usa o programa HISTAT2 para produzir arquivos Sam usados em etapas subsequentes.
<ol><li>Mapear os dados de sequência para a versão correta do genoma. Para bibliotecas de Y2H de origem do mouse, use o genoma de mm10 UCSC; para aqueles que utilizam os genes humanos, uso o genoma de referência UCSC hg38, para genes de Saccharomyces cerevisiae , o genoma de referência de UCSC SacCer3.</li>
	<li>
Instale o MAPster.
	<ol>
<li>Baixar software MAPster e instalar. O software pode ser encontrado usando um navegador da web para o seguinte: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 é executado em sistemas baseados em Unix como um Apple Macintosh. Por causa disso, o programa MAPster só vai funcionar em sistemas compatíveis, como o Apple Macintosh e linux. Nota: Requisitos do sistema para um Mac da Apple são: OSX 10,10 +, > 4 Gb de RAM, > 500 Gb de espaço em disco e acesso à internet para download de genomas de referência. Os usuários podem precisar de o consultar com um institucional pessoa se sua empresa tem protocolos de segurança Restringindo permissões e direitos de administrador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Insira arquivos necessários e parâmetros através da guia "Main" (Figura 1). Selecione o botão "Pairwise" apropriado para inserir arquivos ou como pares ou não pareado com FASTQ como o formato de arquivo padrão.
	<ol>
<li>Para análise DEEPN, ativar a opção de "Pairwise" para "Off" para ser executado em um único formato de leitura.</li>
		<li>Carregar arquivos em MAPster bastando arrastar-e-soltar para a janela apropriada.</li>
		<li>Selecione uma fonte de DNA/genoma que corresponde à fonte das pastilhas Y2H rapina biblioteca de referência. Indexado genomas de diversos organismos modelo são listadas na caixa "Genoma" e podem ser automaticamente baixadas da Johns Hopkins University Center for Computational Biology. Genomas de referência serão armazenadas localmente para uso posterior.</li>
		<li>Indica o número de processos do computador para ser dedicado ao programa de mapeamento sob a caixa de "Threads", desde HISAT2 suporta multi-threading. MAPster irá Pesquisar o computador e sugerir o número máximo de processadores disponíveis por padrão.</li>
		<li>Especifique um nome de arquivo de saída. Este nome de arquivo será usado durante todo o processo DEEPN então recomenda-se um nome curto mas descritivo sem espaço ou caracteres especiais. Especifique uma pasta para os arquivos mapeados usando o botão "Abrir pasta de saida" de saída.</li>
		<li>Uma vez que os arquivos apropriados e parâmetros foram selecionados, adicione o trabalho de mapeamento para a fila de trabalhos usando o botão "Adicionar a fila". Os nomes de arquivo na janela principal podem ser eliminados e substituídos com os arquivos correspondentes a uma nova amostra e podem ser adicionados para a fila depois de fornecer um nome de arquivo de saída correspondente.</li>
		<li>Clique no botão "Executar fila", uma vez que todos os trabalhos são inseridos na fila de trabalho. Nota: Uma vez que um trabalho de mapeamento foi colocado na fila, selecionar esse trabalho faz com que as configurações de parâmetro a ser exibido na janela "Parâmetros de trabalho" e a instrução de linha de comando com todos os argumentos para ser exibido na janela do "Comando de trabalho". As opções de saída incluem dirigindo-se a manter leituras que não conseguem alinhar e especificando o número de alinhamentos primários permitidos para cada leitura. O arquivo de saída padrão de MAPster é em formato de SAM (por exemplo, um arquivo de 'Sam'). Ele conterá todas as leituras de sequência de arquivos fastq especificado para aquela amostra, incluindo aqueles que foram (mapeado) e não foram mapeadas com sucesso para o especificado geome (desmapeadas).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic processamento usando Software DEEPN
Nota: Software de DEEPN atualmente é compilado para uso com bibliotecas de rapina contendo sequências de cDNA de rato, sequências de cDNA humano ou sequências de DNA genômicas de S. cerevisiae . DEEPN aceita o formato de arquivo padrão Sam e pode aceitar um arquivo SAM (Sam) contendo leituras mapeadas e não mapeadas ou arquivos separados para cada um do lê não mapeado e mapeado.
<ol><li>Download de software DEEPN e instalar. O software pode ser encontrado usando um navegador da web para o seguinte: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Selecione qual versão corresponde a plataforma de computação e o descarregamento. Para instalar, abra o pacote de instalação baixado. Nota: As versões do DEEPN estão disponíveis para PC, Mac e Linux sysrems. Devem ter sistemas Mac e PC > espaço no disco rígido de 500 Gb e > 4 Gb de RAM.</li>
	<li>
Abra o software DEEPN. Selecione as informações de biblioteca de rapina correspondente da caixa de seleção superior a janela principal (Figura 2). Selecione uma pasta onde os arquivos processados podem ir clicando no botão "Pasta de trabalho" e navegando para a pasta/diretório. Uma pessoa pode criar um novo pasta/diretório se necessário. Uma vez que uma "pasta de trabalho" está selecionada, DEEPN criará três subpastas, intitulado unmapped_sam_files, mapped_sam_files e sam_files.
	<ol>
<li>Se usando arquivos Sam contendo leituras mapeadas e não mapeadas, tais como aqueles produzidos com as configurações padrão do programa MAPster, coloque-os na pasta 'sam_files'. Caso contrário coloque arquivos Sam no unmapped_sam_files e mapped_sam_files em conformidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie o processamento clicando no botão "Gene Count + junção fazer". Nota: O processamento começará com o módulo de contagem de Gene que usará as posições de mapeamento para contar quantas leituras correspondem a cada gene. Make de junção, em seguida, extrair sequências de junção (as sequências fundiram diretamente a jusante do domínio de Gal4-ativação) do lê e identificá-los usando o algoritmo de explosão. Isto irá criar um conjunto de pastas retratado na Figura 3. Tempo de processamento depende do tamanho e número de sequência de arquivos de dados e velocidade de processamento do computador usado. Lê vezes típicas variam de 12 a 30 h para um conjunto de dados experimental de 250 milhões. O procedimento de Gene contagem e o procedimento Junction_Make podem ser iniciados individualmente clicando no botão "Gene contagem" ou o botão "Fazer junção".</li>
	<li>
Baixe e instale o Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Este é um pacote de análise estatística, projetado para conjuntos de dados DEEPN que atualmente só funciona em sistemas Unix Mac.
	<ol>
<li>Abra Stat_Maker e clique no botão "Verificar a instalação" (Figura 4). Se executando pela primeira vez, Stat_Maker instalará automaticamente R, JAGS e Bioconductor puxando esses recursos da internet. Uma vez que R e JAGS Bioconductor são detectados, Stat_Maker se tornará ativo e permitir a entrada do usuário.</li>
		<li>Clique no botão "Escolher pasta" para navegar até a pasta de trabalho que DEEPN processado. Stat_Maker automaticamente encontrar e listar os arquivos para a análise estatística na janela.</li>
		<li>Arraste e solte os arquivos apropriados da janela de lista de arquivo acima no windows arquivo abaixo para cada conjunto de dados vetoriais e isca e para cada condições de crescimento: não selecionado (a + mídia) e selecionado (a mídia). Importante, Stat_Maker requer conjuntos de dados duplicados para vazio vector em paz, duas amostras de populações não selecionadas e duas amostras de selecionado. Isto dá uma estimativa de variabilidade dentro do experimento.</li>
		<li>Clique no botão "Executar". Dependendo da velocidade do computador, computação levará entre 5 a 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rever os resultados da saída do Stat_Maker, que são colocados em uma nova subpasta dentro da pasta de trabalho principal rotulada "Stat_Maker resultados". Nota: Os resultados são encontrados em um arquivo CSV (valores separados por vírgula) que pode ser aberto, em comum, programas de planilha eletrônica. Stat_Maker irá classificar hits de gene que são susceptíveis de ser diferencialmente enriquecida em seleção com a isca de interesse sobre o vazio pTEF-GBD (Figura 5). Também tabulados é a percentagem de leituras para cada conjunto de dados onde a inserção do gene encontra-se a montante, a jusante, ou dentro do frame de leitura aberto e se o gene também é encontrado dentro do quadro de leitura correta de translação. Muitas vezes, DEEPN irá capturar robustas interações Y2H de uma isca com porções de um cDNA dado que são fora do quadro de leitura adequada da proteína correspondente ou a uma parte do cDNA que está a jusante do seu quadro de leitura aberta correspondente. A saída combinada de Stat_Maker de digitalização agiliza deteção e eliminação destes sucessos irrelevantes.</li>
	<li>
Para rever os dados sobre cada candidato em potencial, abra o software DEEPN, selecione as informações de biblioteca de rapina correspondente e, em seguida, a pasta de trabalho correto usando a "pasta de trabalho".
	<ol>
<li>Clique no botão "Consulta de explosão". Isso carrega uma nova janela (Figura 6). Na caixa de texto superior, digite o nome do gene ou o número do GenBank NM para selecionar o gene candidato de interesse. Esses nomes de gene correspondem aos nomes listados no arquivo de saída de StatMaker. Tipo entrar ou retornar, que inicia a recuperação do gene de interesse.</li>
		<li>Selecione quais conjuntos de dados serão utilizados para a análise usando os menus "Selecione Dataset". Normalmente, estes incluem o vetor somente e isca amostras crescidas sob condições não-seletivo e a amostra de isca cultivadas sob condições de seleção. Inicialmente, os conjuntos de dados irão levar alguns momentos para carregar, no entanto, a consulta subsequentes dos mesmos conjuntos de dados com genes diferentes vai rapidamente. Blast_Query irá exibir os pontos de fusão junto a sequência de interesse e abundante como cada ponto de fusão é. Isto pode ser exibido em um formato gráfico usando a guia de "Conspiração" ou um formato de tabela, usando a guia "Resultados". Estes resultados podem ser exportados para um arquivo. csv, clicando no botão "Salvar. csv" no canto superior direito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verificação de candidatos identificados por DEEPN
Nota: O propósito de DEEPN e Stat_Maker é identificar genes candidatos que dão uma interação positiva de Y2H. Verificar tais interações de Y2H pode ser feito usando um formato tradicional de Y2H binário usando o plasmídeo isca de interesse emparelhado com o plasmídeo de rapina' domínio' Gal4-ativação vazio bem como emparelhado com o plasmídeo de rapina carregando o fragmento do gene/do cDNA de interesse. Não é viável para isolar o plasmídeo real de interesse dentro da mistura de DNA isolado da população de leveduras submetida a seleção Y2H. No entanto, um pode computacionalmente reconstruir o que o fragmento do gene/cDNA é que produz a interação Y2H, projetar primers para a 5' e 3' extremidades desse fragmento e amplificar o fragmento de DNA isolado da população de leveduras. Esta seção descreve como localizar a extremidade 5' e 3' do fragmento de rapina do candidato.
<ol><li>Abra o software DEEPN e escolher os parâmetros "Parâmetro Select" e a pasta de trabalho "Selecione trabalho pasta" correspondente ao projeto. Lançar o módulo Blast_Query clicando no botão "Consulta de explosão".</li>
	<li>
Digite o nome do gene de interesse ou sua GenBank "NM" número na caixa de texto superior. Selecione o menu pull-down do conjunto de dados que corresponde à população levedura selecionada para a isca de interesse para recuperar a tabela de posições da junção na aba 'Resultados'. Por padrão, Blast_Query requisitará as diferentes posições de acordo com a sua abundância no dataset, quantificada pelo ppm do número total dos cruzamentos encontrados dentro do banco de dados.
	<ol>
<li>Encontrar uma posição da mais abundante, que é "no ORF" e "no quadro". O valor de posição corresponde à posição de nucleotídeos do gene com a sequência de referência NCBI (número de 'NM') encontrada na caixa de texto superior. Essa sequência pode ser Obtida de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) ou copiada da caixa de texto inferior na janela Blast_Query. Nota: Um exemplo pode ser encontrado na Figura 6, painel do meio. No centro conjunto de dados, os 'resultados' mostraram como a junção de mais abundante: 'Posição': 867; '#Junctions': 20033.821; 'Início da consulta', 1; CDS: No ORF; e 'Frame': no quadro. 867 de nucleótidos da sequência de referência NCBI GenBank NM_019648 é o início do fragmento de rapina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se começar a consulta for 1, desenha a extremidade 5' do primer para incluir o nucleotídeo correspondente ao número de posição e estender 25 nucleotídeos a jusante da posição (Figura 7). Se começar a consulta é mais do que 1, indica que há nucleotídeos extras entre o domínio de activação de Gal4 e a sequência de presas de interesse e que a primeira demão deve começar mais a jusante de acordo com o valor do início da consulta.</li>
	<li>Da janela DEEPN clique no botão de "Profundidade de leitura" sob "Analisar dados". Uma vez que a janela de leitura de profundidade é aberta, digite o NCBI referência sequência (NM) número ou gene nome na caixa de texto superior. Use o menu pull-down para selecionar o conjunto de dados relevante que contém o gene enriquecido de interesse. Utilize a tabela do lado esquerdo e os gráficos exibir à direita para determinar quantas leituras foram encontradas nos dados que correspondem ao gene de interesse (Figura 7-B).</li>
	<li>Desenha uma cartilha da extremidade 3' que irá capturar a sequência do fragmento do gene calculado pela profundidade de leitura. Se a abundância de leituras ultrapassa a ORF e pare de códon, desenha a primeira demão para que inclui o códon de parada e a região só montante do códon de parada. Se as sequências do gene não ultrapassam o codão stop, use a tabela de resultados para localizar a região 3' mais distante que pode ser detectada e use esta posição como o mais distante 3' posição para colocar o primer. Nota: O programa de leitura de profundidade verifica em intervalos para encontrar as sequências que correspondem o especificado gene/do cDNA de interesse. Isto ajuda a prever onde o final 5' e 3' do fragmento de rapina mais abundante é para esse gene na amostra. Flutuações na profundidade ao longo do comprimento da sequência de leitura são normais, como pode ser visto na Figura 7. Se a profundidade de leitura é claramente passado o códon de parada, ele indica que o fragmento de rapina se estende além do códon de parada e, portanto, o 3' primer pode simplesmente correspondem a região em torno do códon de parada.</li>
	<li>
Realize uma reação de PCR de 50 µ l por gene. Cada reação contém 25 pmol de cada primer frente e verso, combinando o plasmídeo de rapina-biblioteca (ver tabela de materiais). Reações também contem 25 µ l de alta-fidelidade 2 x PCR Master Mix, 5 µ g de amostra de DNA e a água até 50 µ l.
	<ol>
<li>Amplificar as reações para 25 ciclos com tempos de extensão de 3 min a 72 ° C, recozimento a temperatura de 55 ° C por 30 s e desnaturando a 98 ° C, durante 10 s. Precede a bicicleta por uma desnaturação s 30 a 98 ° C e siga com uma incubação de 5 min a 72 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O pacote de software aqui descrito permite completamente processar e analisar dados de sequenciamento de DNA de alto throughput de uma experiência de DEEPN. O primeiro programa usado é o MAPster, que leva as leituras de sequência de DNA em arquivos padrão fastq e mapas de sua posição para uma referência de DNA para processamento a jusante, por uma série de programas de informática, incluindo o software DEEPN. O utilitário da interface MAPster e sua capacidade de enfileirar vários trabalhos, combinar arquivos d...

Uma abordagem para descobrir as interações da proteína é o ensaio (Y2H) 2-híbrido do fermento, quais façanhas engenharia de células de levedura que crescem somente quando uma proteína de interesse vincula-se a um fragmento de uma interação sócio1. Deteção de múltiplas interações Y2H agora pode ser feita com a ajuda de sequenciamento de elevado-throughput maciço paralelo. Vários formatos foram descritas2,3,4,5 , incluindo uma que desenvolvemos onde as populações são cultivadas no lote sob condições que seleciona para levedura, que contém plasmídeos que produzem um positivos da interação do Y2H6. O fluxo de trabalho desenvolvido, denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteína), identifica o diferencial interactomes das bibliotecas de rapina mesmo para identificar as proteínas que interagem com uma proteína (ou domínio) vs. outra proteína ou um domínio mutante conformationally distinto. Um dos passos importantes para este fluxo de trabalho é adequado processamento e análise dos dados de sequenciamento de DNA. Algumas informações podem ser recolhidas contando apenas o número de leituras para cada gene antes e depois da seleção de interações Y2H de forma análoga a um experimento de RNA-seq. No entanto, informações muito mais detalhadas podem ser extraídas desses conjuntos de dados, incluindo informações sobre o subdomínio de uma determinada proteína que é capaz de produzir uma interação Y2H. Além disso, Considerando que a abordagem DEEPN é valiosa, analisar muitas repetições de amostra pode ser complicado e caro. Este problema é aliviado usando um modelo estatístico que foi desenvolvido especificamente para conjuntos de dados DEEPN onde o número de repetições é limitada6. Para fazer processamento e análise de conjuntos de dados de sequenciamento de DNA confiável, completo, robusto e acessível para os investigadores sem especialização bioinformática, desenvolvemos um conjunto de programas de software que cobrem todas as etapas de análise.
Esta suite de programas de software stand-alone que são executados em computadores desktop inclui MAPster, DEEPN e Stat_Maker. MAPster é uma interface gráfica de usuário que permite que cada arquivo de fastq na fila para mapear o genoma usando o programa HISAT27, produzindo um arquivo Sam padrão para uso em aplicações a jusante. DEEPN tem vários módulos. Ele atribui e conta leituras correspondentes a determinado gene semelhante a uma quantificação de RNA-seq tipo usando o módulo 'Gene contagem'. Também extrai as sequências correspondentes a junção entre o domínio transcriptional Gal4 e a sequência de rapina e agrupa a posição desses cruzamentos para permitir a sua inspecção pelos quadros comparativos e gráficos (usando o módulo 'Junction_Make') O módulo 'Blast_Query' permite fácil inspeção, quantificação e comparação de sequências de junção de Gal4 de junção. Stat_Maker avalia as leituras por dados de enriquecimento gene estatisticamente como uma maneira de priorizar provável Y2H sucessos. Aqui, descrevemos como usar esses programas de software e totalmente analisar dados de um Y2H DEEPN experimentar a sequência de DNA. Versões do DEEPN estão disponíveis para rodar em sistemas Linux, Mac e PC. Outros programas, como o programa de mapeamento MAPster e o módulo de estatísticas DEEPN Stat_Maker dependem de sub-rotinas que executado sob Unix e estão disponíveis apenas em sistemas Mac e linux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mapster</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEEPN software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statmaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum computer system</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>Mac Intel Core i5 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>OS 10.10 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>Intel i5-7400 or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>4 Gb RAM or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>500 Gb Disk spce or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Windows 7 or higher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Adaptámos o ensaio 2-híbrido de levedura para descobrir simultaneamente dezenas de interações proteína transitória e estático dentro de um único ecrã utilizando o sequenciamento de DNA do elevado-throughput curto-leitura. Os conjuntos de dados sequência resultante podem não só acompanhar que genes em uma população que são enriquecidos durante a selecção para interações de 2-híbrido de levedura positivas, mas também fornecem informações detalhadas sobre os subdomínios relevantes de proteínas suficientes para interação. Aqui, descrevemos um conjunto completo de programas de software stand-alone que permitem que não-especialistas para executar todas as bioinformática e estatísticos passos para processar e analisar arquivos de fastq de sequência de DNA de um ensaio de 2-híbrido do fermento de lote. As etapas de processamento abrangidas por estes programas incluem: 1) mapeamento e contagem leituras sequência correspondente a cada proteína candidato codificada dentro de uma biblioteca de rapina 2-híbrido do fermento; 2) um programa de análise estatística que avalia os perfis de enriquecimento; e 3) ferramentas para examinar o quadro translacional e posição dentro da região de codificação de cada enriquecido plasmídeo que codifica as proteínas interagindo de interesse.

Mapeamento de dados de fastq: o primeiro passo Em praticamente todas as aplicações de NGS incluindo DEEPN a saída inicial é um arquivo de leituras de pequena sequência deve ser mapeada pelo alinhamento de genômica, transcriptomic, ou outra referência de DNA8. Recentemente, o programa de alinhamento de HISAT2 foi desenvolvido que usa algoritmos de indexação de estado-da-arte para aumentar drasticamente a velocidade de mapeamento<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K visualizações.  University of Iowa. Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Vídeo: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genética

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

Análise transcriptomic de<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenciação de dados através da Suíte Tuxedo no Projeto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...