Ringraziamo Moustafa Saleh e Jay Tourigny per una lettura critica del manoscritto e Steven Hahn e Steven Henikoff per la tutorship e il supporto durante lo sviluppo del ChEC-seq e la sua applicazione al complesso Mediator. SG è supportato da NIH concede R01GM053451 e R01GM075114 e GEZ è supportato dai fondi di avvio di Indiana University.

1. Generazione di ceppi di lievito <ol><li> Genera un ceppo di lievito che porta il fattore di interesse tagliato con MNase. <ol><li> PCR amplifica la cassetta di contrassegno MNase dal vettore desiderato ( Tabella 1 ) usando la miscela di reazione specificata ( Tabella 2 ) e le condizioni di ciclo ( Tabella 3 ). Mescolare 5 μL della reazione PCR e 1 μL di colorante carica DNA 6X. Eseguire ogni aliquota di PCR su un gel agarosio 0,8% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 2,3 kb. </li><li> Trasformare la cassetta di etichettatura amplificata nel ceppo di scelta usando la trasformazione standard di acetato di litio 22 e eseguire la selezione. </li><li> Verificare l&#39;integrazione corretta del cassetto di codifica con colonia PCR. <ol><li> Preparare la miscela di reazione specificata ( Tabella 4 ) per il numero di colonie da sottoporre a screening. Continuare a girare fino a quando non sia necessario. </li><li> Scegli una porzione di ciascuna colonia per essere provataNella parte inferiore di un tubo PCR utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta pipetta. </li><li> Microonde le colonie selezionate ad alta potenza per 1 min. </li><li> Aggiungere 50 μL di miscela PCR ( Tabella 4 ) a ciascuna colonia microelastica e pipetta su e giù per mescolare. Eseguire il PCR utilizzando le condizioni di ciclo specificate ( Tabella 5 ). </li><li> Mescolare 50 μL di reazione PCR e 10 μL di colorante di caricamento del DNA da 6X direttamente in ciascun tubo PCR. Eseguire 10 μl di ogni campione su un gel agarosico al 1% a 120 V per 40 min. La dimensione del prodotto prevista è di ~ 700 bp. NOTA: Se si desidera, verificare l&#39;espressione appropriata della proteina di fusione MNase mediante blotting occidentale. Si prevede un cambiamento di ~ 20,6 kilodalton nel peso molecolare della proteina taggata. </li></ol></li></ol></li><li> Generare un ceppo di MNase libero mediante clonazione a base omologica del promotore del gene di interesse in pGZ136 (Tabella 1) e trasformazione e selezione come nel punto 1.1.2. <ol><li> alternati, Assemblare il promotore del gene di interesse e NLS di 3xFLAG-MNase-SV40 in un vettore plasmide, trasformare e selezionare come nel punto 1.1.2 e sviluppare il ceppo nella condizione appropriata selettiva per mantenere il plasmide. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> Nel pomeriggio / sera del giorno prima dell&#39;esperimento ChEC, inoculare 3 mL di lievito-peptone-dextrose (YPD) o di un mezzo selettivo appropriato con una singola colonia del ceppo che porta il fattore tagliato a MNase. Incubare questa coltura durante la notte (180 giri / min di scuotimento, 30 ° C). </li><li> Nella mattina del giorno dell&#39;esperimento ChEC, diluire la coltura durante la notte in 50 ml di media a una densità ottica a 600 nm (OD 600 ) di 0,2-0,3. Incubare questa coltura (180 rpm agitando, 30 ° C) fino a raggiungere un OD 600 di 0,5-0,7. Poiché la cultura si avvicina all&#39;appropriato OD 600 , impostare il blocco termico o il bagno d&#39;acqua a 30 ° C e avviare il disgelo del tampone A additivi ( TaBle 6). </li><li> Preparare 5 mL di Tampone A e gli additivi ( Tabella 6 ) per coltura. Tenere il buffer A a RT durante la procedura. </li><li> Preparare i tubi microfuge contenenti 90 μL di soluzione di arresto ( tabella 7 ) e 10 μL di SDS 10% per ogni punto temporale da raccogliere. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendete campioni a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 min. </li><li> Coltura la decantazione in un tubo conico da 50 mL e centrifuga a 1.500 xg e la temperatura ambiente (RT) per 1 minuto. </li><li> Riposizionare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A e trasferire le cellule risospese in un tubo microfugo. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s. </li><li> Aspirare il surnatante e riposare completamente le cellule in 1 mL di Tampone A pipettando verso l&#39;alto e verso il basso. Le pellicole hanno risospeso le cellule in una microfuga a 1.500 xg e RT per 30 s. Ripetere questa fase una sola volta. </li><li> Riposizionare completamente le cellule in 570 μl di Tampone A. Aggiungere 30 μl di 2% di digitonina(0,1% di concentrazione finale) per facilitare la permeabilizzazione delle cellule e invertire la miscela. </li><li> Permeabilizzare le cellule in blocco termico o in bagno d&#39;acqua a 30 ° C per 5 min. </li><li> Pipettare la reazione verso l&#39;alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme di celle. Rimuovere una aliquota da 100 μl di cellule permeabilizzate come un controllo negativo a un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS (fase 2.4) e vortex brevemente per mescolare. </li><li> Aggiungere 1,1 μL di 1 M CaCl2 (concentrazione finale 2 mM) alle cellule permeabilizzate per attivare MNase e invertire più volte rapidamente o vorticarsi brevemente per mescolare. Immediatamente restituire la reazione mista a 30 ° C e avviare un timer. </li><li> Ad ogni punto temporale da raccogliere, pipettare la reazione verso l&#39;alto e verso il basso per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule, quindi rimuovere una aliquota di cellule permeabilizzate da 100 μl in un tubo microfugo contenente soluzione di arresto e SDS e vorticare brevemente per mescolare. Per ogni nuovo fattore analizzato, prendere 0 s (nessun CaCl2 aggiunto), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min e 10 minuti di tempo. NOTA: Esperimenti di ChEC con fattori che rapidamente fendono il DNA a 30 ° C possono essere eseguiti a temperature più basse per rallentare la cinetica di scissione di MNase. </li><li> Una volta raccolti tutti i punti di tempo, aggiungere a ciascun campione 4 μL di 20 mg / mL proteinasi K, vorticare brevemente per mescolare e incubare a 55 ° C per 30 minuti. </li><li> Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticare vigorosamente per mescolare e centrifugare a velocità massima e RT in microfuga per 5 min. </li><li> Rimuovere ogni fase acquosa (~ 150 μL) in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Vortex vigorosamente per mescolare e precipitare su ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa. </li><li> Il pellet ha precipitato il DNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min. </li><li> Diluenti supernatanti e lavare pellet con 1 ml di etanolo RT 70%. </li><li> Decantare l&#39;etanolo, rimuovendo il resto invertendo unD toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l&#39;etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all&#39;aria per RT per 5 min. </li><li> Mentre i pellets stanno asciugando, fanno un master mix per riposizionare pellet essiccati in 29 μl di Tris, pH 8.0 + 1 μL di 10 mg / mL RNasi A ciascuno. Digest RNA a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Mescolare 1 μl di colorante di carica del DNA 6X con 5 μl di ciascun campione e eseguire su un gel agarosio al 1,5% a 120 V per 40 min. </li></ol> 3. Selezione delle dimensioni NOTA: L&#39;obiettivo della selezione delle dimensioni è quello di rimuovere frammenti multi-kilobase di DNA genomico dal campione da sequenziare ed arricchire frammenti di ~ 150 bp (circa la dimensione del DNA nucleosomale) o più piccoli. Nei dati di sequenziamento, i frammenti &lt;400 bp sono arricchiti, con un picco notevole intorno alla dimensione del DNA nucleosomale (~ 150 bp) e una distribuzione di picco o ampia di frammenti subnucleosomiali. &lt;ol&gt; <li> Ad ogni campione aggiungere 75 μL di branchi di immobilizzazione reversibile a fase solida (SPRI) in una soluzione di polietilenglicole (PEG) 23 e pipettare su e giù per 10 volte per mescolare. Incubare il tallone: ​​miscela DNA a RT per 5 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione del becco SPRI, preparare tubi microfuge contenenti 96 μl di 10 mM Tris, pH 8,0 e 4 μL di 5 M NaCl per ogni campione. </li><li> Posizionare i tubi in un rack magnetico per raccogliere le perline sul lato del tubo. Lasciare che le perle si raccolgano sul lato del tubo per 2 min. </li><li> Trasferire ogni supernatante ad un nuovo tubo contenente Tris e NaCl (fase 3.2). </li><li> Aggiungere a ciascun campione 200 μl di 25: 24: 1 fenolo: cloroformio: isoamilico, vorticarsi per mescolare e centrifugare alla velocità massima e RT in microfuga per 5 min. </li><li> Rimuovere ogni fase acquosa in un nuovo tubo. Aggiungere 30 μg di glicogeno e 500 μl di etanolo al 100%. Precipitare il DNA sul ghiaccio secco per 10 minuti o fino a quando la soluzione è viscosa. </li><li> Pellet preciDNA a velocità massima e 4 ° C in microfuga per 10 min. </li><li> Superannanti di decantazione e lavaggi con 1 ml di etanolo al 70%. </li><li> Decantate l&#39;etanolo, rimuovendo il resto invertendo e toccando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Campionare brevemente campioni utilizzando una centrifuga a benchtop e utilizzare una pipetta per rimuovere l&#39;etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Pelletri asciutti all&#39;aria per RT per 5 min. </li><li> Ripopolare i pellet essiccati in 25 μl di Tris, pH 8,0. Determinare la concentrazione del campione usando un test di alta sensibilità. Per esperimenti di TF ChEC, 10-100 ng di DNA viene recuperato normalmente dopo la selezione delle dimensioni. </li><li> Preparare le librerie di sequenziamento. I protocolli di preparazione della biblioteca che non si basano sulla selezione delle dimensioni, come descritto in precedenza 24 , sono desiderabili per consentire la sequenza di una vasta gamma di frammenti di dimensioni (25-500 bp). </li><li> Librerie di sequenza in modalità terminale parallela. Per la lettura di alta qualità è necessario un minimo di 25 basi di sequenza su ciascuna estremitàMappatura. Tra 1 e 2 milioni di letture fornisce copertura sufficiente per un campione di ChEC. NOTA: L&#39;analisi dei dati di ChEC-seq è una procedura complessa e oltre l&#39;ambito di questo articolo. Informazioni dettagliate sull&#39;analisi dei dati possono essere trovate nelle pubblicazioni precedenti 1 , 21 e gli script personalizzati utilizzati per l&#39;analisi sono disponibili su GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) può anche essere utilizzato per l&#39;analisi della riga di comando dei dati ChEC-seq. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Abbiamo dimostrato che la ChEC può mappare diverse classi di proteine ​​di lievito sulla cromatina e anticipare che sarà generalmente applicabile a diverse famiglie di TF e altri fattori leganti di cromatina nel lievito. ChEC-seq è vantaggioso in quanto non richiede un collegamento reticolato, solubilizzazione di cromatina o anticorpi. Così, ChEC evita gli artefatti potenzialmente presenti in X-ChIP-seq, come gli artefatti hyper-ChIPable 3 , 4 e ChIP nat...

La mappatura dei siti di legame dei fattori di trascrizione (TFs), dei rimodellanti di cromatina e di altri fattori regolatori associati alla cromatina è fondamentale per comprendere tutti i processi basati sulla cromatina. Mentre sono stati utilizzati approcci di immunoprecipitazione cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChIP-seq) per ottenere molte importanti conoscenze sulla biologia genoma, esse presentano limitazioni notevoli. Recentemente abbiamo introdotto un metodo alternativo, definito scissione endogena cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (ChEC-seq) 1 , per eludere questi inconvenienti. Il ChIP-seq viene spesso eseguito con un passo iniziale di reticolazione di formaldeide (X-ChIP-seq) per preservare interazioni proteine-DNA. Tuttavia, un certo numero di recenti studi hanno indicato che X-ChIP-seq cattura interazioni transienti o non specifiche di proteine-DNA 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , dando origine a falsi positivi siti di legame. Inoltre, la sonicazione, comunemente usata per frammentare la cromatina in esperimenti X-ChIP-seq, preferisce scavare regioni di cromatina aperta, portando a un recupero biasimo di frammenti da queste regioni 9,10. La sonicazione produce anche una miscela eterogenea di lunghezze di frammento, limitando in ultima analisi la risoluzione del sito di legame, anche se l&#39;aggiunta di una fase di digestione di esonucleasi può notevolmente migliorare la risoluzione 11 , 12 . I metodi naturali di ChIP come le regioni occupate di genomi da cromatina (ORGANIC) 13 naturalmente isolati dall&#39;affinità (ORGANIC) non usano la reticolazione e la frammentazione di cromatin con la nuclace micrococcica (MNase), alleviando potenziali pregiudizi associati a crosslinking e sonicazione di formaldeide. Però,La solubilità di molte proteine ​​legate alla cromatina sotto le condizioni relativamente lievi richieste per l&#39;estrazione natu- rale di cromatina è scarsa, potenzialmente in grado di ridurre la dinamica e / o falsi negativi 14 . Mentre varie iterazioni di ChIP-seq sono più comunemente utilizzate per la mappatura genoma di interazioni proteine-DNA, sono state implementate anche diverse tecniche di mappatura basate sulla fusione di proteine ​​di interesse per vari enzimi che modificano il DNA. Un tale approccio è l&#39;identificazione di DNA adenina metiltransferasi (DamID) 15 , in cui una proteina di interesse di cromatina di interesse è geneticamente fusa alla diga e questa fusione è espressa in cellule o animali, con conseguente metilazione di sequenze GATC prossimali ai siti di legame della proteina. DamID è vantaggioso in quanto non si basa sull&#39;immunoprecipitazione e quindi evita il collegamento a reticolazione, gli anticorpi o la solubilizzazione di cromatina. Viene anche eseguito in vivo . però, La risoluzione di DamID è limitata alla scala di kilobase e l&#39;attività di metilazione della proteina di fusione della diga è costitutiva. Un secondo metodo basato sulla fusione enzimatica è Calling Card-seq 16 , che impiega fusione di un fattore di interesse per una transposa, orientando l&#39;integrazione specifica del sito di transposoni. Come DamID, Calling Card-seq non è basato su immunoprecipitazione e quindi ha vantaggi simili, con il vantaggio aggiunto di una maggiore risoluzione. Tuttavia, Calling Card-seq può essere limitato da biases di sequenza di transposasi ed è anche dipendente dalla presenza di siti di restrizione vicini ai siti di inserimento di transposone. Un terzo metodo di fusione enzimatica, sviluppato nel laboratorio Laemmli, è la scissione endogena cromatina (ChEC) 17 . In ChEC, una fusione tra una proteina associata alla cromatina e il MNase viene espressa in cellule, e dopo l&#39;aggiunta di calcio per attivare MNase, il DNA viene ceduto prossimale ai siti di legame per il taggedFattore ( figura 1 ). In combinazione con il blotting del sud, la ChEC è stata usata per caratterizzare la struttura della cromatina e la legatura di proteine ​​in un certo numero di singoli loci nel lievito 17 , 18 ed è stata combinata con analisi microarray a bassa risoluzione per sondare l&#39;interazione dei componenti dei pori nucleari con il lievito Genoma 19 . ChEC offre vantaggi simili a DamID e Calling Card-seq, e la sua risoluzione è quasi una coppia di base quando viene analizzata dall&#39;estensione primer 19 . ChEC è inoltre controllabile: la robusta sequenza del DNA da parte di MNase dipende dall&#39;aggiunta di calcio millimolare, assicurando che MNase sia inattivo alle basse concentrazioni di calcio libere osservate nelle cellule di lievito vivo 20 . In precedenza, abbiamo affermato che la combinazione di ChEC con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq) fornirà mappe ad alta risoluzione di siti di legame TF. Anzi, ChEC-seq ha generato mappe ad alta risoluzione dei fattori di regolazione generale del lievito (GRF) Abf1, Rap1 e Reb1 attraverso il genoma 1 . Abbiamo anche applicato con successo ChEC-seq al complesso modulare Mediator, un coattivatore globale trascrizionale 21 essenzialmente conservato, espandendo l&#39;applicabilità di ChEC-seq a complessi di dimensione megadalton che non contattano direttamente il DNA e possono essere difficili da mappare con ChIP- Basati su metodi. ChEC-seq è un metodo potente sia per la convalida indipendente dei risultati ChIP-seq che per la generazione di nuove conoscenze nella regolazione dei processi residenti in cromatina. Qui esempiamo un protocollo passo per passo per l&#39;attuazione di questo metodo nel lievito in erba.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

La mappatura genomica delle interazioni proteine-DNA è fondamentale per comprendere la regolazione del gene, il rimodellamento della cromatina e altri processi residenti in cromatina. La reticolazione di formaldeide seguita da immunoprecipitazione di cromatina e sequenziamento ad alta percentuale (X-ChIP-seq) è stata utilizzata per ottenere molti approfondimenti nella biologia del genoma. Tuttavia, X-ChIP-seq ha limitazioni notevoli legate alla reticolazione e alla sonicazione. Il ChIP nativo evita questi inconvenienti evitando il collegamento incrociato, ma spesso provoca una scarsa ripresa delle proteine ​​legate alla cromatina. Inoltre, tutti i metodi basati su ChIP sono soggetti a considerazioni sulla qualità degli anticorpi. I metodi enzimatici per la mappatura delle interazioni proteine-DNA, che coinvolgono la fusione di una proteina di interesse per un enzima modificante del DNA, sono stati utilizzati anche per mappare interazioni proteine-DNA. Recentemente abbiamo combinato un metodo di questo tipo, scissione endogena cromatina (ChEC), con sequenziamento ad alto rendimento come ChEC-seq. ChEC-seq si basa sulla fusione di una cromatin-assoc(MNase) per generare frammenti di DNA mirati in presenza di calcio nelle cellule viventi. La ChEC-seq non è basata sull&#39;immunoprecipitazione e pertanto evita le potenziali preoccupazioni con il collegamento a reticolazione, la sonicazione, la solubilizzazione di cromatina e la qualità degli anticorpi, fornendo al tempo stesso una mappatura ad alta risoluzione con un minimo di segnale di fondo. Prevediamo che ChEC-seq sarà una potente controparte di ChIP, fornendo un mezzo indipendente per convalidare i risultati ChIP-seq e scoprire nuove conoscenze sulla regolazione genomica.

Nel caso di un esperimento di successo di ChEC, l&#39;analisi del DNA mediante elettroforesi con agarosio gel rivelerà un aumento calcio-dipendente della frammentazione del DNA in tempo, come indicato dalla macerazione e eventuale completa digestione del DNA genomico. In alcuni casi, una scala di bande simili a quella osservata con una digestione tradizionale di MNase viene osservata dopo una digestione estesa. Questo è il caso per l&#39;analisi ChEC di Reb1, un fattore di regolazione ...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase). 

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Ricerca

Genetica

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide

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