Nós gostaríamos de reconhecer o apoio financeiro do centro da Legião real britânica para estudos de lesão explosão HA e financiamento do Conselho de pesquisa médica (M01858X/1) para CAH.

1. cultura de células e preparação da amostra <ol><li>obter uma linha de célula apropriada (por exemplo, as células da papila dérmica). 
	Nota: O protocolo atual foi concebido para células aderentes, com fibroblastos de papila dérmica de rato isolados de vibrissae usado como um modelo.</li>
	<li>Cultura de células em um frasco de T-75 contendo o mínimo essencial médio (MEM) α suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina estreptomicina. Manter as células em condições de cultura padrão de 37 ° C e 5% de CO 2 em um ambiente umidificado até atingirem 80% confluência.</li>
	<li>o meio de aspirar e lavar duas vezes as células Dulbecco &#39; s fosfato salino (PBS). Dissociar as células do recipiente incubando-os em 2 mL de tripsina/EDTA na cultura padrão condições 5 min. verificar brevemente para assegurar que as células com êxito tem dissociada o balão usando um microscópio de contraste de luz/fase (com uma lente de objetiva X 10 ).</li>
	<li>Adicionar 4 mL de meio de cultura para neutralizar a reação tripsinização. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Centrífuga no x 200 g de 4 min para as células de Pelotas. Lentamente, Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não deslocar o pellet. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio.</li>
	<li>Transferir uma alíquota de 20 µ l de suspensão de célula para um hemocytometer limpo e contar as células usando um microscópio equipado com uma lente de objetiva 10 X.</li>
	<li>Preparar células para a explosão, colocando três pratos de 35 milímetros dentro de um prato de 90 mm. Rotulá-los adequadamente. Adicionar 2 mL do meio de cada prato de 35mm e um total de 5 x 10 4 células por prato, distribuir as células uniformemente ao redor do prato de sementes. Incubar as amostras experimentais durante a noite, em condições de cultura padrão para permitir a penhora de célula adequada antes da onda de choque exposição. 
	Nota: Para a imagem latente fluorescente, células devem ser propagadas para as lamelas de vidro estéril.</li>
</ol> 2. Conjunto de tubo de choque <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> Figura 2 : EVOC Rig e choque tubo Assembly. Imagem do (A) da plataforma EVOC. (B) esquema de aparelho de tubo de choque. Dimensões do tubo de choque incluem um diâmetro interno de 59 mm e um comprimento total, incluindo o equipamento EVOC, de 4,13 m. O comprimento do tubo conduzido e os totais de equipamento EVOC 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Usar botas biqueira de aço e um casaco de laboratório durante os procedimentos de montagem.</li>
	<li>Inserir as barras de dois alinhamento através dos furos de dois parafuso encontraram no plano horizontal da flange de saída. Coloque uma folha de gaxeta de borracha nitrílica sobre a extremidade das barras de alinhamento para que senta-se entre o flange de saída e o equipamento de cultura (EVOC) ex vivo órgão. 
	Nota: O equipamento de EVOC é um dispositivo elétrico projetados para uso com pratos de Petri 35mm ( Figura 2A).</li>
	<li>Coloque o equipamento EVOC para o flange de saída do tubo de choque deslizando o dispositivo elétrico sobre as barras de alinhamento, garantindo que é orientado corretamente para que a seção que contém a placa de Petri está localizada em sua base.</li>
	<li>Introduzir quatro M24 parafusos e anilhas nos furos restantes. Coloque as porcas para que eles toquem a flange.</li>
	<li>Firmemente apertar as porcas e parafusos sequencialmente de forma simétrica na diagonal enquanto visualmente verificar que o tubo de equipamento e choque EVOC ter alinhado com sucesso.</li>
	<li>Anexar um transdutor de pressão para o equipamento de EVOC e conectá-lo à fonte de corrente usando um cabo do sensor. Então, usando um cabo BNC, ligue a fonte de corrente para osciloscópio.</li>
	<li>, Certifique-se de que todos solte válvulas e fluem de controles sobre o tubo de choque está fechadas. Abra a linha interna externa de ar comprimido e manualmente rode o regulador de pressão para carregar o solenoide para 2,5 bar</li>
	<li>Abra a válvula da garrafa de gás comprimido, girando-a no sentido anti-horário 180°.</li>
	<li>Lentamente gire o regulador de pressão, localizado na parte superior da garrafa de gás, no sentido horário para aumentar a pressão para aproximadamente 15 bar 
	Nota: O ponto de ajuste deste regulador deve ser ligeiramente acima do mais alto estourando a pressão do diafragma mais grosso que deve ser usada no experimento.</li>
	<li>Preparar os diafragmas por uma folha de plástico de 0,125 mm de espessura de corte em quadrados de 10 x 10 cm. 
	Nota: A espessura do diafragma será correlacionar com a pressão de rotura, alterando a pressão de pico da onda de choque (ou seja, um diafragma mais grosso irá resultar em uma onda de choque com uma maior pressão de pico; A tabela 1).</li>
</ol> < tabela fo:keep-together.within-página = "1" &gt; <tbody><tr><td>diafragma de Mylar dimensões (cm)</td> <td>pressão (bar) de ruptura</td> <td>Sensor 3 faixa de pressão (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,023</td> <td>2 ± 0,2</td> <td>± 47 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0,2</td> <td>± 72 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,125</td> <td>9,5 ± 0,5</td> <td>± 127 12.5</td></tr></tbody> < / t capaz > tabela 1: Burst pressão correspondente à espessura do diafragma e pressão de pico.
<ol start="11"> <li>criar identificadores sem fita, corrigi-los para a parte superior e inferior do diafragma e usá-los cuidadosamente, posicionar o diafragma ao lado do flange dianteira pequena pela câmara de culatra. Certifique-se de que o diafragma é reta e corretamente posicionado antes de fechar a culatra.</li>
	<li>Este seguro usando quatro M24 parafusos e porcas. Firmemente, aperte as porcas e parafusos em sequência de forma simétrica na diagonal.</li>
</ol> 3. Preparação de células apenas antes da onda de choque exposição <ol><li>Prepare um capuz de fluxo laminar de tecido através da realização de esterilização ultravioleta. Limpá-lo com um desinfetante solução e 70% de etanol. Recolher todos os itens necessários para a manipulação de células prévia para/post-choc exposição de onda e colocá-los dentro do capô estéril. 
	Nota: Isto inclui meio fresco, adesivas membranas permeável ao gás, tesoura estéril, pipeta e pipeta dicas.</li>
	<li>Transferir um prato de Petri de 90 milímetros contendo três amostras experimentais de incubadora para o capô estéril.</li>
	<li>Corte uma membrana permeável ao gás adesiva da folha (ver a Tabela de materiais) em seis quadrados, tal que cada um é grande o suficiente para cobrir o topo de um prato de Petri de 35 mm.</li>
	<li>Aspire o médio de 35 milímetros de Petri, coloque a tampa de um lado e cubra com duas seções de adesivo membranas permeável ao gás, garantindo que não há um selo apertado entre a membrana e a borda do prato.</li>
	<li>Transferir a amostra para o equipamento de EVOC e fixá-lo na base de fixação do modo que a parte superior do prato está alinhada com a base interna do tubo de choque.</li>
</ol> 4. Operação do tubo de choque <ol><li>usar protectores auriculares, óculos de proteção de olho, botas de segurança e um casaco de laboratório ao pressurizar o sistema de tubo de choque.</li>
	<li>Rode o botão de controle de fluxo da válvula, permitindo que o gás flua a mangueira flexível conectando o cilindro de ar comprimido para o tubo de choque.</li>
	<li>Na parte inferior do painel de controle, selecione o &#34; duplo culatra &#34; entrada para um wav de choque de curta duraçãoe ou o &#34; tubo condutor &#34; entrada para uma duração maior onda.</li>
	Ligue a fonte de alimentação CC e osciloscópio para adquirir os dados de forma de onda de <li>. Definir a taxa de amostragem osciloscópio de 50,0 MS/s, com um comprimento de 1 M do registro pontos. Definir um intervalo de 50 mV para disparar no bar 2 e 100 mV para acima de 4 bar</li>
	<li>Ligar as luzes de segurança utilizando o interruptor na parede em frente ao painel de controle. 
	Nota: Este diz que outros pesquisadores não para entrar na sala quando o tubo de choque está cobrando.</li>
	<li>Ligue o interruptor da caixa de controle do solenoide para fechar o solenoide. 
	Nota: Esse recurso de segurança fecha uma válvula situada na câmara de culatra dupla, permitindo o sistema a ser carregado.</li>
	<li>No painel de controle, abra lentamente o controle de fluxo girando o botão no sentido anti-horário para aumentar gradualmente a pressão dentro da câmara de compressão. Monitorar a pressão usando o visor do painel de controle.</li>
	<li>, Uma vez que a pressão de ruptura do diafragma é alcançado, o diafragma se romper e um &#34; bang &#34; será ouvido. Fechar rapidamente o controle de fluxo girando o botão. 
	Nota: A onda de choque vai viajar para baixo o tubo da amostra de célula e a extremidade do tubo.</li>
	<li>Abrir o solenoide, desligando o interruptor na caixa de controle do solenoide e desligar a luz de segurança (utilizando o interruptor na parede em frente ao painel de controle).</li>
	<li>Transferir a amostra de células para o hood estéril, remova as adesivas membranas permeável ao gás e encher o prato com 2 mL de meio de cultura fresco. As células podem ser usadas imediatamente para avaliação, conforme descrito na etapa 5, ou voltou para a incubadora para estudos de longo prazo.</li>
</ol> 5. Viabilidade celular <ol><li>avaliar viabilidade de celular após a exposição de ondas de choque, usando a combinação de um ensaio de indicador redox e a imagem fluorescente de células vivas e mortas. 
	Nota: Para a imagem latente fluorescente, células devem ser propagadas para as lamelas de vidro estéril durante a seção 1: preparação de cultura e amostra de células. Estes podem ser colocados dentro os pratos de petri 35mm.</li>
	<li>Transferência de 200 µ l de reagente indicador redox (consulte a Tabela de materiais) para cada prato experimental diretamente depois da recarga-los com 2 mL de pós-choque médio onda exposição. Incubar a condições de cultura padrão para 4 h.</li>
	<li>Para cada prato, transferir (em uma capa escura de estéril) alíquotas de 2 x 100 µ l para um preto ou limpar a placa de 96 poços, dependendo se fluorescência ou absorvância será usada para avaliar a viabilidade.</li>
	<li>Transferir a placa de 96 poços para um leitor adequado equipado com os filtros corretos e ler usando a excitação bandas 530ex/590em de fluorescência ou 570 nm combinado com uma referência de 600 nm para absorvância. Exportar e salvar os dados.</li>
	<li>Analisar os dados para identificar qualquer diferença entre a onda de choque-expostos amostras e controles não-expostos, como isso pode indicar uma queda na viabilidade celular. 
	Nota: Um controle negativo também deve ser incluído no projeto experimental. Além disso, a interpolação de uma curva padrão pode ser usada para calcular números de celular.</li>
	<li>, Aspire o meio contendo o reagente de indicador redox. Substituí-lo com 2 mL de meio fresco e incube as celulas em condições de cultura padrão para 24 h.</li>
	<li>Repita os passos acima, se necessário para obter um segundo ponto de tempo de viabilidade.</li>
	<li>Para a imagem fluorescente de células vivas e mortas, Aspire o meio e lavar as células duas vezes em 1 mL de PBS. Transferir 100 µ l de reagente completo encontrado na imagem kit (veja a Tabela de materiais) para cada amostra e incubar a temperatura ambiente protegida da luz por 15 min.</li>
	<li>Reagente de aspirar e lavar uma vez usando 1 mL de PBS. Usando pinças de ponta fina, cuidadosamente remova o prato de 35mm a lamela e colocá-lo virado para baixo sobre uma lâmina de vidro de microscopia.</li>
	<li>Adquirir imagens para cada amostra, usando um microscópio fluorescente (10 X da lente objetiva, abertura numérica 0.50) equipados com os filtros de excitação e emissão corretos (ex / em 488 nm/515 nm e 570 nm nm/602). 
	Nota: Células vivas irão emitir fluorescência intensa, uniforme, verde. Mortos ou moribundos células com uma membrana celular comprometida serão absorção do componente kit morto, resultando em emissão de fluorescência vermelha, encontrados predominantemente na região nuclear da célula.</li>
	<li>Usar a análise de imagem, software para também manualmente ou automaticamente contar o número de células vivas e mortas de cada imagem.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Lesões primárias obtidas da exposição a eventos de explosão ainda não são totalmente compreendidos. Identificar e compreender os mecanismos que provocam lesões induzida pela explosão, como da lesão cerebral traumática3,4 e ossificação heterotópica6,7, são importantes primeiros passos para o desenvolvimento métodos eficazes de profilaxia. Para ajudar a alcançar este objetivo, um número de sistemas experimentais foram desenvolvido para replicar a explosão evento exposição11,12,13,14,18,19 . A técnica descrita aqui usa tubo equipamento de choque (Figura 2) capaz de disparar ondas de choque em uma gama de pressões em todo o corpo (ou seja, roedores), amostras de células ou tecidos. A capacidade de carregar tipos de células individuais em vez de tecidos dá a capacidade de analisar respostas celulares distintas, como dano pode ocorrer simultaneamente através de uma variedade de mecanismos1,2. Por exemplo, para modelar traumático lesão cerebral, a avaliação dos tipos de células individuais, tais como os neurônios e astrócitos, pode permitir a identificação de lesões de células específicas. Além disso, a resposta de todo órgão pode ser avaliada usando o tecido cerebral. Ambos os tipos de célula individual e as amostras de tecido tem valor e podem dar informações diferentes. Também é possível alterar a quantidade de ar que é pressurizado para gerar o choque, selecionando a entrada dupla-culatra ou condutor-tubo. Este controla a duração da onda de choque. Outra possibilidade é mudar o diafragma material e espessura para alterar a pressão de pico25.
Outro fator a considerar são efeitos de fim de interferências que podem estar presentes quando o compartimento de amostra está localizado perto da saída do tubo de choque, como a encontrada na plataforma EVOC descrita no actual sistema. Cavalcanti et al . olhou para explosão onda perfis encontrados em locais diferentes em um tubo de choque controlado por compressão e encontrado que a forma de onda Friedlander foi melhor representada em um local dentro do tubo de choque15. Kuriakose et al também estudou o secundário carregamento da amostra e descobriu que a colocação de uma placa final no final do tubo de choque era capaz de eliminar ondas refletidas indesejados16. Considerando os dados encontrados nestas publicações15,16, futuras modificações para melhorar o sistema de tubo de choque descrito neste artigo poderiam envolver a colocação do equipamento em um local mais profundo dentro do tubo conduzido EVOC ou, Alternativamente, a inclusão de uma placa final do tubo de choque. Limitações do método descrito poderiam incluir a taxa de transferência relativamente baixa das amostras. Um único usuário pode operar o tubo de choque com segurança em uma saída de em torno de 6-8 amostras por hora. Actualmente, o sistema é projetado em torno do uso de pratos de petri 35mm único. Portanto, maiores experimentos contendo vários grupos e repetições biológicas podem ser difícil de alcançar.
Este artigo de métodos mostra como a viabilidade das células da papila dérmica aderentes foi afetada pela exposição a uma única onda de choque. Uma onda de choque de curta duração (&#60; 10 ms) de ≤72 kPa não afetou viabilidade quando comparado ao controle (Figura 3 e Figura 4). Em contraste, uma onda de choque no 127 kPa estimulou uma queda significativa na viabilidade no pós explosão 24h, como mostrado por um ensaio de indicador redox (Figura 3) e análise de imagens fluorescentes (Figura 4). Miller et al relataram uma redução similar na viabilidade celular em culturas de fatias hippocampal do rato organotypic quando as células foram expostas a um qualquer um 147 kPa ou onda de choque de 278 kPa usando um tubo de choque em aberto, orientado por Hélio14. Em contraste, VandeVord et al . reportou que não havia nenhum efeito sobre a viabilidade em astrócitos de ratos expostos a uma sobrepressão de curta duração de &#62; 200 kPa, embora um barochamber foi usado em vez de um tubo de choque18. Deve notar-se que a pressão externa é dependente da onda de explosão, embora isto cria ondas de estresse complexo dentro do corpo, portanto, tornando a natureza do carregamento altamente depende das propriedades mecânicas do tecido ou da célula. Estudos de caracterização adicional da resposta celular aos eventos de explosão é necessária. Além disso, avaliando exposição de onda de choque a nível celular, como mostrado nesta técnica, respostas biológicas acionadas por lesão, tais como a perturbação de sinalização de percursos ou alterações epigenéticas, podem ser identificadas e exploradas ainda mais.
Em conclusão, este trabalho descreve o uso de um tubo de aço inoxidável de choque e um aparelho EVOC modificado para incorporar culturas celulares primárias. Ondas de choque em uma gama de pressões podem ser geradas e propagadas em células vivas para replicar os efeitos que ocorrem pela exposição a uma onda de choque. Este protocolo demonstra como avaliar a viabilidade celular, mas a longo prazo alterações em tipos de células individuais também podem ser estudadas. Vai em frente, pretendemos avaliar os efeitos diferenciais que complexas ondas de choque pode eliciar em diferentes tipos de células, com o objectivo de aprofundar a nossa compreensão das lesões primárias induzida pela explosão.

Com a recente tendência para a utilização de dispositivos explosivos improvisados em modern warfare e ações terroristas contra civis, compreender os efeitos de eventos explosivos no corpo humano é de grande importância. Ferimentos obtidos através da exposição a eventos de explosão podem ser mortal e letal, com os processos físicos de lesão a ser divididos em quatro categorias. Resultado de lesões primárias de exposição directa para a onda da explosão, que interage com o corpo localmente de forma compressiva e posteriormente expansiva, causando a ruptura de membranas e tecidos moles1. Lesões secundárias incluem trauma contuso ou penetrante feridas causadas pelo impacto com objetos de baixa massa impelidos a alta velocidade pela onda de explosão. Lesões terciárias ocorrem quando a onda da explosão tem energia suficiente para lançar objetos de massa alta ou indivíduos contra objetos. Por último, lesões de explosão quaternária são definidos por outros diversos ferimentos que não cabem as outras categorias, tais como queimaduras flash2. Após exposição a tais eventos de explosão, lesões primárias incluem54,3,do lesão cerebral traumática, ossificação heterotópica6,7, explosão de lesão pulmonar8, perda de audição 9e os outros10.
Uma forma de onda observada comumente de eventos de explosão é a onda de Friedlander, representando uma explosão de campo livre, em oposição a um espaço fechado. A forma de onda é composto por uma frente de explosão que pode ser definida como um aumento afiado e rápido da pressão positiva. Isto é seguido imediatamente por um vento de explosão de ar se movendo em alta velocidade e uma onda de liberação que reduz a pressão para abaixo dos níveis atmosféricos. Um vácuo parcial é deixado na região da explosão inicial, que resulta no lento refluxo de ar. As fases positivas e negativas da onda (figura 1A) resultam no movimento de encaixe da explosão onda1. Para ajudar a elucidar os mecanismos por trás de lesões de impacto, modelos experimentais foram criados para produzir formas de onda, tais como a onda de Friedlander, que células e tecidos terá de enfrentar quando exposta a um evento de explosão genuíno. Atuais sistemas listados na literatura incluem choque tubos11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, o Kolsky bar20, explosão avançados simuladores21, o Split Hopkinson pressão bar22e a recriação de eventos alternativos de explosão em um ambiente controlado usando Tetranitrato de pentaeritritol23. Apesar da ampla gama de modelos disponíveis, muitas variáveis influenciam o prejuízo obtido a partir de ondas de explosão, incluindo o pré-estresse aplicado e as propriedades mecânicas do, os tipos de células individuais ou tecidos sob avaliação24. Enquanto o estudo de tecidos ou órgãos pode lançar luz sobre a deformação do tecido e brutas alterações morfológicas sofridas como resultado de eventos de explosão, análise a nível celular pode revelar alterações epigenéticas e transcriptional influenciadas pela onda de choque.
Este artigo de métodos descreve uma técnica para propagar ondas de choque em uma gama de pressões sobre células vivas em uma monocamada. Isto permite a caracterização imediata da viabilidade celular, elucidar os limiares de dano potencial das ondas de choque. Além disso, células viáveis podem ser retornadas para as condições de cultura padrão, e podem ser avaliados a longo prazo efeitos biológicos do evento explosão. O protocolo abaixo descreve duas técnicas de viabilidade celular que podem ser usadas em células em cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Figura 1: Aproximação de uma onda de Friedlander. (A) uma aproximação de uma onda de Friedlander observada no sensor 3 do tubo de choque. (B) dados representativos mostrando os perfis diferentes de pressão observados em sensores, 1, 2 e 3 do tubo de choque. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>MEM &amp;alpha;, nucleosides</td><td>ThermoFisher</td><td>22571020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15070-063</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Dilute 1 in 10 before use.</td></tr><tr><td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td><td>Starlab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Triple Red</td><td>TCD010035</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent</td><td>VWR UK</td><td>391-0453&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Alamarblue cell viability reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>13494309</td><td></td></tr><tr><td>Virkon tablets</td><td>VWR UK</td><td>115-0020</td><td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>SurgicalTools</td><td>11295-10</td><td>Use to remove coverslips from petri dish.</td></tr><tr><td>Cover glass, square</td><td>VWR UK</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR UK</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>96 Well plate, solid black</td><td>AppletonWoods</td><td>CC760</td><td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td></tr><tr><td>96 Well plate, clear, (PS)</td><td>VWR UK</td><td>734-1799</td><td>Plate to be used for absorbance measurments.</td></tr><tr><td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Optical microscope used for cell culture.</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010A</td><td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0782</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0786</td><td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0798</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Current source power unit</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>4103C</td><td>Power source for 2300V1 sensor.</td></tr><tr><td>IEPE Pressure Sensor</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>2300V1</td><td>Pressure sensor located on shock tube.</td></tr><tr><td>Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO 4104B</td><td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td></tr></tbody></table>

evaluating primary blast effects in vitro

Exposição a eventos de explosão pode causar trauma grave de órgãos vitais como os pulmões, ouvidos e cérebro. Compreender os mecanismos por trás de tais ferimentos induzida a explosão é de grande importância, tendo em conta a recente tendência para a utilização de explosivos em modern warfare e incidentes relacionados ao terrorista. Para entender completamente a lesão induzida pela explosão, nós deve primeiro ser capazes de replicar tais eventos de explosão em um ambiente controlado, usando um método reprodutível. Esta técnica usando equipamento de tubo de choque, as ondas de choque em uma gama de pressões podem ser propagadas sobre células vivas cultivadas em 2D e marcadores de viabilidade celular podem ser imediatamente analisados usando um ensaio de indicador redox e a imagem fluorescente de células vivas e mortas. Este método demonstrou que aumentando a sobrepressão de explosão de pico para 127 kPa pode estimular uma significativa queda na viabilidade celular quando comparados aos controles não tratados. Amostras de teste não estão limitadas a células aderentes, mas pode incluir suspensões celulares, amostras de tecido e todo o corpo, através de pequenas modificações para a instalação de tubo de choque. Replicar as condições exatas que tecidos e células experimentam quando expostos a um evento de explosão genuíno é difícil. Técnicas como o apresentado neste artigo podem ajudar a definir limiares de dano e identificar as alterações epigenéticas e transcriptional dentro das células resultantes de exposição de ondas de choque.

Crescido em uma monocamada de células usando o método acima descrito, foram expostas em triplicado para as ondas de choque geradas usando um tubo de choque (Figura 2B). Marcadores de viabilidade celular foram avaliados. Usando um ensaio de indicador redox, verificou que a aplicação de uma onda de choque de 127 kPa foi capaz de reduzir significativamente a viabilidade das células de papila dérmica em comparação aos controles após 24h em cultura (Figura 3). A aplicação de uma onda de choque ≤72 kPa não reduz a viabilidade. Para apoiar estas observações, utilizou-se um ensaio de imagem fluorescente capaz de fluorescente rotulagem células ao vivo ou mortas com fluorophores verde ou vermelha, respectivamente. A quantificação de células vivas e mortas de 13 imagens fluorescentes por replicar biológica demonstrou uma redução na viabilidade celular em pessoas expostas à onda de choque de 127 kPa quando comparado ao controle (Figura 4). Análise estatística foi realizada utilizando uma One-Way ANOVA, seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, com p &#60; 0,05 considerado estatisticamente significativo. O tamanho da amostra por grupo totalizou 9 para o ensaio de indicador redox e 39 para a análise de imagens de fluorescência quantitativa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Figura 3 : Dados de ensaio de indicador redox mostrando tempo curso de viabilidade celular após a exposição de ondas de choque. Significativamente menos células foram observadas após 24 h do grupo de ondas de choque-expostos 127-kPa quando comparado com o controle não tratado. O controle negativo que consistia de um tratamento de 30-s com 2% desinfetante (consulte a tabela de materiais) mostrou significativamente menos células no T0 e 24 h, em comparação com todos os outros grupos. Cada barra representa o média ± 1 desvio-padrão (SD); réplicas biológicas, N = 3; técnico Replica, n = 3. = p &#60; 0,0001. * = p &#60; 0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Figura 4 : Fluorescência Imaging. (A) dados quantitativos recolhidos do fluorescentes imagens de células vivas e mortas capturadas usando um microscópio de fluorescência na exposição de ondas de pós-choque 24 h. Significativamente menos células viáveis foram observadas em kPa a 127 (quer dizer = 93.42) amostra exposta por ondas de choque em comparação com o 47 kPa (quer dizer = 98.18), 72 kPa (quer dizer = 98.87) e grupos de controle (quer dizer = 99.10). Não há células viáveis foram observadas no grupo controle negativo após 24h (quer dizer = 0). (B) imagens de fluorescência representativa. Verde mostra células vivas, enquanto o vermelho mostra as células mortas. Cada parcela de caixa mostra os quartis superiores e inferiores com bigodes de Tukey; réplicas biológicas, N = 3; técnico Replica, n = 13. = p &#60; 0,0001. Barra de escala = 300 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Compreensão de como as células são moduladas pela exposição a ondas de choque pode ajudar a identificar os mecanismos subjacentes lesões acionados por eventos de explosão. Este protocolo usa equipamento de tubo de choque custom-built para aplicar as ondas de choque em uma gama de pressões de monocamadas de células e identificar os efeitos subsequentes na viabilidade celular.

Avaliar impacto efeitos In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K visualizações.  Imperial College London. Compreensão de como as células são moduladas pela exposição a ondas de choque pode ajudar a identificar os mecanismos subjacentes lesões acionados por eventos de explosão. Este protocolo usa equipamento de tubo de choque custom-built para aplicar as ondas de choque em uma gama de pressões de monocamadas de células e identificar os efeitos subsequentes na viabilidade celular.

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Blast Quantification Using Hopkinson Pressure Bars

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures up to many hundreds of megapascals. In this respect the simplicity of the Hopkinson pressure bar has a major advantage in that while the measurement end of the Hopkinson bar can endure and be exposed to harsh conditions, the strain gauge mounted to the bar can be affixed some distance away. This allows protective housings to be utilized which protect the strain gauge but do not interfere with the measurement acquisition. The use of an array of pressure bars allows the pressure-time histories at discrete known points to be measured. This article also describes the interpolation routine used to derive pressure-time histories at un-instrumented locations on the plane of interest. Currently the technique has been used to measure loading from high explosives in free air and buried shallowly in various soils.

This protocol details the use of Hopkinson pressure bars to measure reflected blast loading from near-field explosive events. It is capable of interpolating a pressure-time history at any point on a reflective boundary and as such can be used to fully characterize the spatial and temporal variations in loading produced.

Explosão Quantificação Usando barras de pressão Hopkinson

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures ...

Engenharia

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

Um novo portátil em Vitro Cassette exposição para amostragem de aerossol

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Ambiente

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Medicina

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

Protocolo para blastóides humanos modelando desenvolvimento e implantação de blastocisto

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Biologia do Desenvolvimento

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Quantificação rápida de blastogénese induzida por Mitogénio em linfócitos T para identificar drogas imunomoduladoras

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Imunologia e Infecção

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Um modelo de romance In Vitro de explosão traumatismo crânio-encefálico

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Neurociência

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

Modelo de onda de explosão de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Método do tubo de choque para modelar explosão de baixo nível altamente repetitiva em camundongos

Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are well understood, the effects of smaller blasts such as those that occur during military training are less understood. This small, low-level blast exposure also varies highly according to military occupation and training tempo, with some units experiencing few exposures over the course of several years whereas others experience hundreds within a few weeks. Animal models are an important tool in identifying both the injury mechanisms and long-term clinical health risks following low-level blast exposure. Models capable of recapitulating this wide range of exposures are necessary to inform acute and chronic injury outcomes across these disparate risk profiles.
Although outcomes following a few low-level blast exposures are easily modeled for mechanistic study, chronic exposures that occur over a career may be better modeled by blast injury paradigms with repeated exposures that occur frequently over weeks and months. Shown here are methods for modeling highly repetitive low-level blast exposure in mice. The procedures are based on established and widely used pneumatic shocktube models of open-field blast exposure that can be scaled to adjust the overpressure parameters and the number or interval of the exposures. These methods can then be used to either enable mechanistic investigations or recapitulate the routine blast exposures of clinical groups under study.

Autor em destaque: decifrando os efeitos a longo prazo de exposições a explosões de baixo nível em camundongos

Presented here are methods for producing repeated low-intensity blast exposures using mice.

Modelagem de exposição a explosões de baixo nível altamente repetitiva em camundongos

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are ...