Wir möchten die finanzielle Unterstützung der Royal British Legion Zentrum für Blast Verletzungen Studien HA und Mittel aus dem Medical Research Council (M01858X/1) für CAH anerkennen.

1. Zellkultur und Probenvorbereitung <ol><li>erhalten einen entsprechenden Zell-Linie (z. B. Zellen der dermalen Papille). 
	Hinweis: Das aktuelle Protokoll ist konzipiert für adhärente Zellen mit Ratte dermalen Papille Fibroblasten isoliert von Tasthaare zum Vorbild.</li>
	<li>Kultur der Zellen in einem T-75 Kolben mit minimalen wesentliche mittlere (MEM) α mit fötalen Rinderserum 10 % und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt. Die Zellen standard Kulturbedingungen 37 ° C und 5 % CO 2 in eine feuchte Umgebung bleiben, bis sie 80 % Zusammenfluss erreichen.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und die Zellen in Dulbecco zweimal waschen &#39; s Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Trennen Sie die Zellen aus der Flasche durch brüten sie in 2 mL Trypsin/EDTA bei standard Kultur Bedingungen für 5 min. kurz zu überprüfen, um sicherzustellen, dass Zellen erfolgreich aus der Flasche mit einem Licht/Phase-Kontrast-Mikroskop (mit einem 10 X-Objektiv getrennt haben ).</li>
	<li>Fügen Sie 4 mL Kulturmedium, die Trypsinization Reaktion zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 200 X g für 4 min zu die Zellen zu Pellets. Langsam Aspirieren des Überstands, kümmert sich nicht um die Pellets zu verdrängen. Wieder aussetzen das Pellet in 5 mL Medium.</li>
	<li>Ein 20 µL Aliquot der Zellsuspension auf eine saubere Hemocytometer übertragen und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem 10 X-Objektiv ausgestattet.</li>
	<li>Bereiten die Zellen für die Explosion durch drei 35 mm Schalen in einem 90-Millimeter-Teller platzieren. Beschriften Sie sie entsprechend. Jedes Gericht 35 mm fügen Sie 2 mL Medium hinzu und Samen Sie insgesamt 5 x 10 4 Zellen pro Schale, die Zellen gleichmäßig um die Schale zu verteilen. Inkubieren Sie die experimentellen Proben Übernachtung im standard Kulturbedingungen, um angemessene Zellhaftung vor der Druckwelle Belichtung ermöglichen. 
	Hinweis: Für Fluoreszenz-Bildgebung, Zellen müssen werden gesät auf sterile Glasdeckgläser.</li>
</ol> 2. Schock-Baugruppe <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> Abbildung 2 : EVOC Rig und Schock Tube Assembly. (A) Bild von EVOC-Rig. (B) schematische Darstellung der Schock-Rohr-Apparat. Schock-Rohrdimensionen umfassen einen Innendurchmesser von 59 mm und einer Gesamtlänge, einschließlich das EVOC-Rig von 4,13 m. Die Länge des angetriebenen Rohres und die EVOC Rig Summen 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol><li>Tragen Stahl-Zehe Arbeitsstiefel und ein Laborkittel während der Montageabläufe.</li>
	<li>Insert gefunden die beiden Ausrichtung Balken durch die zwei Bohrungen in der horizontalen Ebene der Auslass-Flansch. Legen Sie ein Nitrilkautschuk Dichtung Blatt über das Ende der Achse Bars, so dass es zwischen dem Auslass-Flansch und ex Vivo Orgel Kultur (EVOC) Rig sitzt. 
	Hinweis: Das EVOC-Rig ist eine speziell angefertigte Halterung zur Verwendung mit 35 mm Petrischalen ( Abbildung 2A).</li>
	<li>Ausgang Flansch der Schock Röhre durch Verschieben der Leuchte über die Ausrichtung-Balken, um sicherzustellen, dass es richtig ausgerichtet ist, so dass der Abschnitt, der die Petrischale hält an seinem Fuße befindet das EVOC-Rig beimessen.</li>
	<li>Legen Sie vier M24 Schrauben und Unterlegscheiben in die verbleibenden Löcher. Die Muttern so positionieren, dass sie den Flansch berühren.</li>
	<li>Dicht befestigen Sie die Schrauben und Muttern nacheinander diagonal symmetrische Weise zwar visuell überprüfen, ob die EVOC Rig und Schock Röhre erfolgreich ausgerichtet haben.</li>
	<li>Der EVOC Rig ein Druckaufnehmer beimessen und an die Stromquelle mit einem Sensorkabel anschließen. Anschließend verbinden Sie die Stromquelle mit einem BNC-Kabel, mit dem Oszilloskop.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass alle Ventile freizugeben und Kontrollen auf dem Schock-Schlauch fließen sind geschlossen. Öffnen Sie die integrierten externen Druckluftleitung und manuell drehen Sie den Druckregler im Uhrzeigersinn, um die Magnetspule zu 2,5 Bar laden</li>
	<li>Das Sicherheitsventil auf das komprimierte Gasflasche durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn 180° öffnen.</li>
	<li>Drehen Sie langsam den Druckregler, befindet sich oben auf der Gasflasche im Uhrzeigersinn, um den Druck auf ca. 15 bar erhöhen 
	Hinweis: Die Einstellung Punkt dieses Reglers sollte werden leicht oberhalb der höchsten Berstdruck der dicksten Membran, die im Experiment verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten die Membranen von 0,125 mm dicken Plastikfolie in 10 x 10 cm Quadrate schneiden. 
	Hinweis: Die Dicke der Membran wird korrelieren mit der Berstdruck, verändern den Spitzendruck der Stoßwelle (d. h., die eine dickere Membran eine Schockwelle mit einem größeren Spitzendruck führt; Tabelle 1).</li>
</ol> < tabelle Fo:keep-together.within-seite "1" = > <tbody><tr><td>Mylar Membran Maße (cm)</td> <td>Berstdruck (Bar)</td> <td>Sensor 3 Druckbereich (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 X 0,023</td> <td>2 ± 0,2</td> <td>47 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0,2</td> <td>72 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,125</td> <td>9,5 ± 0,5</td> <td>127 ± 12,5</td></tr></tbody> < / t in der Lage > Tabelle 1: Burst Druck entsprechend Dicke Membran und Spitzendruck.
<ol start="11"> <li>Griffe aus Band erstellen, auf der Ober- und Unterseite der Membran zu beheben und nutzen sie, um das Zwerchfell neben der vorderen kleinen Flansch sorgfältig von der Beckenendlage Kammer positionieren. Sicherzustellen, dass die Membran gerade und korrekt positioniert ist, vor dem Schließen des Verschlusses.</li>
	<li>Sichern dies mit vier M24 Schrauben und Muttern. Fest befestigen Sie die Schrauben und Muttern nacheinander auf diagonal symmetrische Weise.</li>
</ol> 3. Vorbereitung der Zellen nur vor der Druckwelle Exposition <ol><li>vorbereiten eine Gewebe-Laminar-Flow-Kapuze durch ultraviolette Sterilisation durchführen. Reinigen Sie ihn mit einer desinfizierenden Lösung und 70 % Ethanol. Sammeln Sie alle Artikel für Umgang mit vorheriger zu/post-shock Zellen benötigt Welle Exposition und legen Sie sie in die sterile Haube. 
	Hinweis: Dazu gehören frisches Medium, selbstklebende gasdurchlässigen Membranen, sterile Schere, Pipetten und Pipette Tipps.</li>
	<li>Übertragung einer 90 mm Petrischale mit drei experimentellen Proben aus dem Inkubator, der sterile Haube.</li>
	<li>Schnitt eine selbstklebende gasdurchlässigen Membran in sechs Quadrate, Blatt (siehe die Tabelle der Materialien), so dass jeder ist groß genug, um ein 35 mm Petrischale bedecken.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium aus dem 35 mm Petrischale, setzen Sie den Deckel auf der einen Seite und mit Klebstoff gasdurchlässigen Membranen zweiteilig, sicherstellen, dass Sie eine gute Abdichtung zwischen der Membran und dem Rand der Schale abdecken.</li>
	<li>Die Probe in das EVOC-Rig zu übertragen und auf der Basis der Vorrichtung zu sichern, so dass die Spitze der Schale mit der inneren Basis der Schock Röhre ausgerichtet wird.</li>
</ol> 4. Schock-Rohr-Betrieb <ol><li>Auge Schutzbrillen, Gehörschutz, Sicherheitsschuhe und ein Laborkittel zu tragen, wenn die Schock-Rohr-System unter Druck zu setzen.</li>
	<li>Drehknopf die Strömung am Regler im Uhrzeigersinn, so dass Gas in den Schlauch anschließen der Pressluftbehälter mit dem Schock-Rohr fließen.</li>
	<li>Am unteren Rand der Systemsteuerung, wählen Sie entweder die &#34; doppelte Verschluss &#34; Einlass für einen kurzzeitigen Schock Wave oder die &#34; Treiber Tube &#34; Einlass für eine erhöhte Welle Dauer.</li>
	<li>Schalten Sie die DC Stromquelle und Oszilloskop die Wellenformdaten zu erwerben. Legen Sie die Oszilloskop Abtastrate bis 50,0 MS/s, mit einer Länge von 1 M Punkte. Stellen Sie einen Bereich von 50 mV für brennen bei 2 Bar und 100 mV für über 4 Bar</li>
	<li>Schalten Sie mit dem Schalter an der Wand gegenüber der Systemsteuerung Sicherheit Lichter. 
	Hinweis: Dies weist andere Forscher nicht um den Raum zu betreten, wenn der Schock-Tube aufgeladen wird.</li>
	<li>Schalten Sie den Schalter am Magnetventil Steuerkasten das Magnetventil geschlossen. 
	Hinweis: Dieses Sicherheits-Feature schließt ein Ventil befindet sich auf der doppelte Verschluss-Kammer, so dass für das System geladen werden.</li>
	<li>Auf dem Bedienfeld öffnen Sie langsam die Ablaufsteuerung durch Drehen des Drehknopfes, erhöhen Sie den Druck innerhalb der Verdichtungsraum gegen den Uhrzeigersinn. Überwachung des Drucks mit dem Control Panel Display.</li>
	<li>Sobald die Membran Druck platzen erreicht ist, wird die Membrane Bruch und eine &#34; bang &#34; ertönt. Schnell schließen die Ablaufsteuerung durch Drehen des Drehknopfes. 
	Hinweis: Die Schockwelle reist durch die Röhre über die Zellprobe und aus dem Ende des Rohres.</li>
	<li>Öffnen Sie die Magnetspule durch Drehen Sie den Schalter am Magnetventil Steuerkasten und schalten Sie die Sicherheits-Licht (mit dem Schalter an der Wand gegenüber der Systemsteuerung).</li>
	<li>Übertragen die Zellprobe auf der sterilen Haube, entfernen Sie die klebenden gasdurchlässigen Membranen und füllen Sie die Schale mit 2 mL frische Wachstumsmedium. Die Zellen können sofort für Bewertung, verwendet, wie in Schritt 5 beschrieben, oder zurück in den Inkubator für längerfristige Studien.</li>
</ol> 5. Handy-Lebensfähigkeit <ol><li>Assess Zellviabilität nach Schockwelle Exposition mit der Kombination von einem Redox-Indikator-Assay und der fluoreszierenden Bildgebung von lebenden und toten Zellen. 
	Hinweis: Für Fluoreszenz-Bildgebung, Zellen müssen werden gesät auf sterile Glasdeckgläser in Abschnitt 1: Handy-Kultur und Probe Vorbereitung. Diese können innerhalb der 35-mm-Petrischalen platziert werden.</li>
	<li>Transfer 200 µL der Redox-Statusanzeige-Reagenz (siehe die Tabelle der Materialien) zu jedem experimentellen Gericht direkt nach dem Wiederbefüllen sie mit 2 mL Medium nach dem Schock wave Exposition. Inkubation bei standard Kulturbedingungen für 4 Std.</li>
	<li>Für jedes Gericht übertragen (in einer dunklen sterilen Haube) 2 x 100 µL Aliquots, entweder schwarz oder klar 96-Well-Platte, je nachdem ob Fluoreszenz oder Absorption Beurteilungder Rentabilität verwendet werden wird.</li>
	<li>96-Well-Platte auf eine geeignete Platte Leser ausgestattet mit den richtigen Filter übertragen und lesen mit Erregung Bands 530ex/590em für Fluoreszenz oder 570 nm kombiniert mit 600 nm Referenz für Absorption. Exportieren und Speichern der Daten.</li>
	<li>Analysieren die Daten um keinen Unterschied zwischen Stoßwelle ausgesetzt Proben und nicht-exponierten Kontrollen zu identifizieren, wie dies einen Tropfen im Zellviabilität. 
	Hinweis: Eine negative Kontrolle sollte auch in den Versuchsplan aufgenommen werden. Darüber hinaus kann die Interpolation von einer Standardkurve verwendet werden, um Zelle Zahlen berechnen.</li>
	<li>Aspirieren der Redox-Indikator-Reagenz-haltigem Medium. Ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium und inkubieren Sie die Zellen am standard Kulturbedingungen für 24 h</li>
	<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte nach Bedarf zu einen zweiten Zeitpunkt Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
	<li>Für die Fluoreszenz Imaging von lebenden und toten Zellen, aspirieren Sie das Medium und die Zellen zweimal in 1 mL PBS waschen. Übertragen von 100 µL des kompletten Reagenz in der Bildgebung gefunden, jedes Sample kit (siehe die Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur lichtgeschützt für 15 min.</li>
	<li>Aspirieren das Reagenz und einmal mit 1 mL PBS waschen. Nehmen Sie das Deckglas aus der 35 mm-Schale mit feinen Spitze Pinzette, vorsichtig und legen Sie sie verdeckt auf einen Glasobjektträger Mikroskopie.</li>
	<li>Erwerben Bilder für jede Probe mit einem fluoreszierenden Mikroskop (10 X-Objektiv, 0,50 numerische Apertur) ausgestattet, mit der richtigen Anregung und Emission Filter (ex / Em 488 nm/515 nm und 570 nm nm/602). 
	Hinweis: Lebende Zellen werden intensive, gleichmäßige, grüne Fluoreszenz emittieren. Toten oder sterbende Zellen mit einer kompromittierten zellulären Membran werden Aufnahme der Toten Kit Komponente, wodurch die Emission von rote Fluoreszenz, überwiegend im nuklearen Bereich der Zelle gefunden.</li>
	<li>Verwenden Bildanalyse Software entweder manuell oder automatisch die Anzahl der lebenden und toten Zellen aus jedem Bild.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Primäre Verletzungen erhalten vor der Exposition gegenüber Explosion Ereignisse sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Identifizierung und das Verständnis der Mechanismen, die Explosion verursachte Verletzungen, z. B. Schädel-Hirn-Verletzung-3,auslösen sind4 und heterotopic Verknöcherung6,7, wichtige erste Schritte zur Entwicklung effektive Methoden der Prophylaxe. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden eine Reihe von experimentellen Systemen entwickelt, um die Explosion Ereignis Exposition11,12,13,14,18,19 replizieren . Die beschriebene Technik setzt hier Schock Röhre (Abbildung 2) in der Lage ist, feuert Schockwellen bei einer Reihe von Drücke bei Ganzkörper (d. h. Nagetier), Gewebe- oder Zellproben. Die Fähigkeit, einzelne Zelltypen, anstatt ganze Gewebe laden gibt die Möglichkeit, verschiedene zelluläre Reaktionen analysieren Schäden auftreten kann, gleichzeitig über eine Reihe von Mechanismen1,2. Beispielsweise um traumatische modellieren ermöglichen-Hirn-Trauma, die Bewertung der einzelnen Zelltypen, wie Neuronen und Astrozyten, die Identifizierung von zellspezifische Verletzungen. Außerdem kann die gesamte Orgel Antwort mit Hirngewebe beurteilt werden. Die einzelnen Zelltypen und Gewebeproben haben Wert und können unterschiedlichen Informationen geben. Es ist auch möglich, die Menge der Luft zu ändern, die unter Druck gesetzt wird, den Schock durch Auswahl Doppel-Verschluss oder Treiber-Schlauch Zulauf zu generieren. Dies steuert die Dauer der Stoßwelle. Eine weitere Möglichkeit ist die Membran Material und Dicke der Höhepunkt Druck25ändern ändern.
Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor sind Ende Interferenzeffekte vorliegen können, wenn das Probe-Gehäuse sich in der Nähe der Ausfahrt der Schock Röhre, wie auf das EVOC-Rig im derzeitigen System beschrieben gefunden befindet. Chandra Et al. Sie schaute Blast Wave Profile an verschiedenen Orten auf eine Komprimierung-driven Schock Tube gefunden und festgestellt, dass die Friedlander Wellenform am besten an einem Ort tief im Inneren der Schock Rohr15vertreten war. Michelle Et al. auch sekundäre Belastung der Probe untersucht und festgestellt, dass die Platzierung eine Endplatte am Ende des Rohres Schock unerwünschte reflektierten Wellen16beseitigen konnte. Unter Berücksichtigung der Daten in diesen Publikationen15,16, zukünftige Änderungen an das Schock-Rohr-System in diesem Artikel beschriebenen verbessern könnte die Platzierung von EVOC Rig an einer tieferen Stelle innerhalb der angetriebenen Röhre gefunden oder, Alternativ die Aufnahme eine Endplatte auf dem Schock-Rohr. Einschränkungen des beschriebenen Verfahrens könnte den relativ niedrigen Durchsatz von Proben enthalten. Ein einzelner Benutzer lässt das Schock-Rohr sicher bei einer Leistung von rund um 6-8 Proben pro Stunde. Derzeit ist das System um die Verwendung von einzelnen 35 mm Petrischalen geeignet. Daher können größere Experimente mit mehreren Gruppen und biologische Wiederholungen nur schwer zu erreichen sein.
Dieser Methoden-Artikel zeigt, wie die Lebensfähigkeit der dermalen Papille adhärente Zellen durch die Exposition gegenüber einer einzigen Schockwelle betroffen war. Einer kurzzeitigen Schockwelle (&#60; 10 ms) des ≤72 kPa hatte keinen Einfluss auf Rentabilität im Vergleich zu der Kontrolle (Abbildung 3 und Abbildung 4). Im Gegensatz dazu angeregt eine Schockwelle bei 127 kPa einen deutlichen Rückgang Lebensfähigkeit bei 24 h Post-Blast, dargestellt durch ein Redox-Indikator-Assay (Abb. 3) und fluoreszierende Bildanalyse (Abbildung 4). Miller Et Al. berichtet eine ähnliche Reduktion im Zellviabilität in Ratte organotypischen hippocampal Slice Kulturen wenn Zellen entweder ausgesetzt waren ein 147 kPa oder 278 kPa Stoßwelle mit einer offenen, Helium-driven Schock Rohr14. Im Gegensatz dazu VandeVord Et Al. berichtet, gab es keine Auswirkung auf Lebensfähigkeit in Ratte Astrozyten ausgesetzt zu einer kurzzeitigen Überdruck von &#62; 200 kPa, obwohl ein Barochamber anstatt eine Schock-Rohr-18verwendet wurde. Es sei darauf hingewiesen, dass der Druck von außen auf die Druckwelle angewiesen ist, obwohl dieses komplexen Belastung Wellen innerhalb des Körpers, wodurch die Art der Belastung stark abhängig von der mechanischen Eigenschaften von Geweben oder Zellen erzeugt. Zusätzliche Charakterisierung Studien über die zelluläre Reaktion auf Ereignisse der Explosion ist erforderlich. Darüber hinaus bewertet Druckwelle Exposition auf zellulärer Ebene, wie in dieser Technik dargestellt, können biologische Reaktionen ausgelöst, die aus der Verletzung, wie z. B. die Störung der Signalisierung Wege oder epigenetische Veränderungen identifiziert und weiter erforscht.
Diese Arbeit beschreibt zusammenfassend die Verwendung aus einem Rohr aus rostfreiem Stahl Schock und eine modifizierte EVOC-Rig, primären Zellkulturen zu integrieren. Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen können generiert und verbreitet in lebenden Zellen, die Effekte, die auftreten vor der Exposition gegenüber eine Druckwelle zu replizieren. Dieses Protokoll veranschaulicht die Zellviabilität bewerten, aber längerfristige Änderungen an einzelnen Zelltypen können auch untersucht werden. In Zukunft planen wir die unterschiedlichen Auswirkungen zu bewerten, die komplexe Stoßwellen in verschiedenen Zelltypen, mit dem Ziel fördern unser Verständnis von Blast-induzierten primären Verletzungen hervorrufen können.

Mit der jüngsten Trend zur Nutzung von improvisierten Sprengkörpern in modern Warfare und terroristische Aktionen auf Zivilisten ist das Verständnis der Auswirkungen von explosiven Ereignisse auf den menschlichen Körper von großer Bedeutung. Verletzungen durch Exposition gegenüber Explosion Veranstaltungen erhalten können tödliche und tödliche, mit den körperlichen Prozessen der Verletzung wird in vier Kategorien unterteilt werden. Primäre Verletzungen resultieren aus direkte Sonneneinstrahlung die Druckwelle, die lokal mit dem Körper in einer Druck- und anschließend expansive Weise interagiert, wodurch die Beeinträchtigung der Membranen und Weichteile1. Sekundäre Verletzungen gehören stumpfes Trauma oder durchdringenden Wunden verursachten Auswirkungen mit massearmen Objekte mit hoher Geschwindigkeit durch die Druckwelle angetrieben. Tertiäre Verletzungen auftreten, wenn die Druckwelle ausreichend Energie hat, um Gegenstände von Hochamt oder Einzelpersonen gegen Objekte zu werfen. Zu guter Letzt werden quartäre Blast Verletzungen durch andere sonstigen Verletzungen definiert, die nicht die anderen Kategorien, wie z. B. Flash Verbrennungen2passen. Nach Exposition gegenüber solchen Blast-Veranstaltungen sind primäre Verletzungen Schädel-Hirn-Verletzungen3,4,5, heterotopic Verknöcherung6,7, Explosion Lunge Verletzungen8, Verlust des Hörvermögens 9u.10.
Eine häufig beobachtete Wellenform von Blast Veranstaltungen ist die Friedlander Welle, vertritt eine Freifeld, im Gegensatz zu einer geschlossenen-Raum, Explosion. Die Wellenform besteht aus einer Explosion-Front, die als einen scharfen und schnellen Anstieg der positiven Druck definiert werden kann. Unmittelbar danach durch eine Explosion Wind der Luft mit hoher Geschwindigkeit und eine Release-Welle, die den Druck, unter dem atmosphärischen Niveau reduziert. Ein teilweises Vakuum bleibt in der Region der ersten Explosion, die Ergebnisse in den langsamen Rückfluss der Luft. Die positiven und negativen Phasen der Welle (Abbildung 1A) führen in der Push-Pull-Bewegung der Explosion Welle1. Experimentelle Modelle ist um zu helfen, die Mechanismen hinter primäre Blast Verletzungen erläutern, entstanden um Wellenformen, wie die Welle Friedlander, produzieren die Zellen und Gewebe konfrontiert sein wird wenn Sie eine echte Explosion Ereignis ausgesetzt. In der Literatur aufgeführten aktuellen Systeme umfassen Schock Röhren11,12,13,14,15,16,17, Barochambers18,19, Kolsky Bar20erweiterte Explosion Simulatoren21, Split Hopkinson Druck Bar22und die Erholung der alternative Explosion Ereignisse in einer kontrollierten Umgebung mit Pentaerythritol tetranitras23. Trotz der breiten Palette von Modellen zur Verfügung beeinflussen viele Variablen die Verletzung von Druckwellen, einschließlich der Vorspannung angewendet, und die mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zelltypen oder Gewebe unter Auswertung24erhalten. Während die Untersuchung von Gewebe oder Organe Gewebe Verformung und grob morphologischen Veränderungen erlitten infolge der Explosion Ereignisse beleuchten kann, kann Analyse auf zellulärer Ebene transkriptionelle und epigenetische Veränderungen beeinflusst durch die Schockwelle aufdecken.
Dieser Methoden-Artikel beschreibt eine Technik, um Schockwellen bei einer Reihe von Belastungen in lebenden Zellen in einem monomolekularen Film zu propagieren. Dies ermöglicht die sofortige Charakterisierung der Zellviabilität, Aufklärung potenzieller Schaden Schwellenwerte von Stoßwellen. Darüber hinaus lebensfähige Zellen an standard Kulturbedingungen zurückgegeben werden können, und langfristigen biologische Wirkungen von der Explosion Veranstaltung beurteilt werden können. Das Protokoll unten beschreibt zwei Zelle überleben Techniken, die auf Zellen in Kultur verwendet werden können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Approximation einer Welle Friedlander. (A) eine Annäherung an eine Friedlander Welle am Sensor 3 auf dem Schock-Schlauch beobachtet. (B) repräsentative Daten zeigen die unterschiedlichen Druckprofile bei Sensoren 1, 2 und 3 auf dem Schock-Schlauch beobachtet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>MEM &amp;alpha;, nucleosides</td><td>ThermoFisher</td><td>22571020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15070-063</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Dilute 1 in 10 before use.</td></tr><tr><td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td><td>Starlab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Triple Red</td><td>TCD010035</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent</td><td>VWR UK</td><td>391-0453&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Alamarblue cell viability reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>13494309</td><td></td></tr><tr><td>Virkon tablets</td><td>VWR UK</td><td>115-0020</td><td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>SurgicalTools</td><td>11295-10</td><td>Use to remove coverslips from petri dish.</td></tr><tr><td>Cover glass, square</td><td>VWR UK</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR UK</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>96 Well plate, solid black</td><td>AppletonWoods</td><td>CC760</td><td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td></tr><tr><td>96 Well plate, clear, (PS)</td><td>VWR UK</td><td>734-1799</td><td>Plate to be used for absorbance measurments.</td></tr><tr><td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Optical microscope used for cell culture.</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010A</td><td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0782</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0786</td><td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0798</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Current source power unit</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>4103C</td><td>Power source for 2300V1 sensor.</td></tr><tr><td>IEPE Pressure Sensor</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>2300V1</td><td>Pressure sensor located on shock tube.</td></tr><tr><td>Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO 4104B</td><td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td></tr></tbody></table>

evaluating primary blast effects in vitro

Exposition gegenüber Explosion Ereignisse kann schwere Traumata lebenswichtiger Organe wie Lunge, Ohren und Gehirn verursachen. Das Verständnis der Mechanismen hinter solche Explosion verursachten Verletzungen ist von großer Bedeutung, die in Anbetracht des jüngsten Trends zur Verwendung von Sprengstoffen in modern Warfare und Terrorist-Vorfälle. Um Explosion verursachten Verletzungen zu verstehen, müssen wir zuerst in der Lage, solche Explosion Ereignisse in einer kontrollierten Umgebung mit einer reproduzierbaren Methode replizieren sein. In diese Technik mit Schock Tube Equipment, Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen können in lebenden Zellen gewachsen in 2D propagiert und Marker der Zellviabilität können sofort analysiert werden, mit einem Redox-Indikator-Assay und der fluoreszierenden Bildgebung von lebenden und toten Zellen. Diese Methode zeigte, dass erhöht den Gipfel Explosion Überdruck bis 127 kPa einen deutlichen Rückgang im Zellviabilität im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen stimulieren kann. Proben sind nicht beschränkt auf adhärente Zellen, sondern zählen Zellsuspensionen, Ganzkörper- und Gewebe Proben durch geringfügige Änderungen im Schock-Rohr-Setup. Replizieren die genauen Bedingungen, die Gewebe und Zellen zu erleben, wenn Sie eine echte Explosion Ereignis ausgesetzt ist schwierig. Techniken wie die in diesem Artikel vorgestellten können helfen, Schäden Schwellenwerte definiert und identifiziert die transkriptionellen und epigenetischen Veränderungen in den Zellen, die von der Schockwelle Exposition auftreten.

Mit der oben beschriebenen Methode, wurden Zellen in einem monomolekularen Film gewachsen in dreifacher Ausfertigung, Schockwellen erzeugt mit einem Schock-Rohr (Abb. 2 b) ausgesetzt. Marker der Zellviabilität wurden bewertet. Mit einem Redox-Indikator-Assay, ergab, dass die Anwendung eine Schockwelle 127 kPa die Lebensfähigkeit der dermalen Papille Zellen im Vergleich zu Kontrollen nach 24 h in der Kultur (Abbildung 3) deutlich reduzieren konnte. Die Anwendung von einer Schockwelle ≤72 kPa reduzieren Lebensfähigkeit nicht. Um diese Beobachtungen zu unterstützen, wurde ein fluoreszierende Bild-Assay in der Lage, Eindringmittel Kennzeichnung lebenden oder tote Zellen mit grünen oder roten Fluorophore, bzw. eingesetzt. Die Quantifizierung von lebenden und toten Zellen aus 13 fluoreszierende Bilder pro biologische replizieren zeigte eine Reduktion im Zellviabilität in exponierten, 127 kPa Stoßwelle im Vergleich zu dem Regler (Abbildung 4). Statistische Auswertung erfolgte über eine einfache ANOVA, gefolgt von mehreren Tukey Vergleichstest mit p &#60; 0,05 gilt als statistisch signifikant. Die Stichprobengröße pro Gruppe belief sich auf 9 für die Redox-Indikator-Assay und 39 für die quantitative Fluoreszenz-imaging-Analyse.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Redox-Assay Indikatordaten zeigen zeitlichen Verlauf der Zelle Lebensfähigkeit nach Schockwelle Exposition. Nach 24 h in der 127-kPa Stoßwelle-exponierten Gruppe im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolle wurden deutlich weniger Zellen beobachtet. Die negativ-Kontrolle, die bestand aus einem 30-s-Behandlung mit 2 % Desinfektionsmittel (siehe die Tabelle Materialien) zeigte deutlich weniger Zellen an T0 und 24 h im Vergleich zu anderen Gruppen. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± 1 Standardabweichung (SD); biologischer Replikate, N = 3; technische repliziert, n = 3. = p &#60; 0,0001. * = p &#60; 0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Fluoreszenz-Imaging. (A) Quantitative Daten von fluoreszierenden Bilder von lebenden und toten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 24 h Post-Stoßwelle Exposition erfasst. Deutlich weniger lebensfähige Zellen verzeichneten die 127 kPa (bedeuten = 93,42) Stoßwelle ausgesetzt Probe im Vergleich zu den 47 kPa (bedeuten = 98.18), 72 kPa (bedeuten = 98,87), und Gruppen zu kontrollieren (bedeuten = 99.10). Keine lebensfähigen Zellen wurden nach 24 h auf die negative Kontrollgruppe beobachtet (bedeuten = 0). (B) repräsentative Fluoreszenzbilder. Grün zeigt lebende Zellen, während Rot abgestorbene Zellen zeigt. Jede Boxplot zeigt die obere und untere Quartile mit Tukey Schnurrhaare; biologischer Replikate, N = 3; technische repliziert, n = 13. = p &#60; 0,0001. Maßstabsleiste = 300 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Verstehen, wie Zellen durch die Einwirkung von Stoßwellen moduliert werden kann helfen, die Mechanismen hinter Verletzungen von Blast-Ereignisse ausgelöst. Dieses Protokoll verwendet speziell angefertigten Schock Röhre Ausrüstung Zelle Monolagen Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen zuweisen und die Folgewirkungen im Zellviabilität zu identifizieren.

Bewertende primäre Explosion Effekte In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

evaluating-primary-blast-effects-in-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K Aufrufe.  Imperial College London. Verstehen, wie Zellen durch die Einwirkung von Stoßwellen moduliert werden kann helfen, die Mechanismen hinter Verletzungen von Blast-Ereignisse ausgelöst. Dieses Protokoll verwendet speziell angefertigten Schock Röhre Ausrüstung Zelle Monolagen Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen zuweisen und die Folgewirkungen im Zellviabilität zu identifizieren.

Serie: Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Blast Quantification Using Hopkinson Pressure Bars

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures up to many hundreds of megapascals. In this respect the simplicity of the Hopkinson pressure bar has a major advantage in that while the measurement end of the Hopkinson bar can endure and be exposed to harsh conditions, the strain gauge mounted to the bar can be affixed some distance away. This allows protective housings to be utilized which protect the strain gauge but do not interfere with the measurement acquisition. The use of an array of pressure bars allows the pressure-time histories at discrete known points to be measured. This article also describes the interpolation routine used to derive pressure-time histories at un-instrumented locations on the plane of interest. Currently the technique has been used to measure loading from high explosives in free air and buried shallowly in various soils.

This protocol details the use of Hopkinson pressure bars to measure reflected blast loading from near-field explosive events. It is capable of interpolating a pressure-time history at any point on a reflective boundary and as such can be used to fully characterize the spatial and temporal variations in loading produced.

Explosion Quantifizierung Mit Hopkinson Pressure Bars

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures ...

Forschung

Ingenieurwesen

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

Eine neue Portable In-vitro- Exposition Kassette für Aerosol-Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Umwelt

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Medizin

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

Protokoll für menschliche Blastoide, die die Entwicklung und Implantation von Blastozysten modellieren

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Entwicklungsbiologie

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Immunologie und Infektion

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Eine neuartige In-vitro- Modell von traumatischen Hirnverletzungen Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Neurowissenschaften

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

Low-Intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-Head Mild Traumatic Brain Injury bei Nagetieren

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Bewertung der akuten Inhalationstoxizität von Luftpartikeln durch Aussetzen kultivierter menschlicher Lungenzellen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Shocktube-Methode zur Modellierung hochrepetitiver schwacher Explosionen bei Mäusen

Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are well understood, the effects of smaller blasts such as those that occur during military training are less understood. This small, low-level blast exposure also varies highly according to military occupation and training tempo, with some units experiencing few exposures over the course of several years whereas others experience hundreds within a few weeks. Animal models are an important tool in identifying both the injury mechanisms and long-term clinical health risks following low-level blast exposure. Models capable of recapitulating this wide range of exposures are necessary to inform acute and chronic injury outcomes across these disparate risk profiles.
Although outcomes following a few low-level blast exposures are easily modeled for mechanistic study, chronic exposures that occur over a career may be better modeled by blast injury paradigms with repeated exposures that occur frequently over weeks and months. Shown here are methods for modeling highly repetitive low-level blast exposure in mice. The procedures are based on established and widely used pneumatic shocktube models of open-field blast exposure that can be scaled to adjust the overpressure parameters and the number or interval of the exposures. These methods can then be used to either enable mechanistic investigations or recapitulate the routine blast exposures of clinical groups under study.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Langzeitwirkungen geringer Explosionsbelastungen bei Mäusen

Presented here are methods for producing repeated low-intensity blast exposures using mice.

Modellierung einer hochrepetitiven Explosionsexposition auf niedrigem Niveau bei Mäusen

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are ...