Nos gustaría reconocer el apoyo financiero de la Legión británica real explosión lesiones estudios HA y financiación del Consejo de investigación médica (M01858X/1) al CAH.

1. cultivo de células y preparación de la muestra <ol><li>obtener una línea celular apropiado (p. ej., las células de la papila dérmica). 
	Nota: El protocolo actual ha sido diseñado para las células adherentes, con fibroblastos de la papila dérmica de rata aislados de vibrissae utilizado como modelo.</li>
	<li>De la cultura las células en un frasco de T-75 que contenga mínimo esencial α de (MEM) medio suplementado con 10% suero bovino fetal y 1% penicilina estreptomicina. Mantener las células en condiciones de cultivo estándar de 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado hasta llegar a confluencia del 80%.</li>
	<li>Aspire el medio y se lavan las células dos veces en Dulbecco &#39; solución salina s tampón fosfato (PBS). Disociar las células del frasco por incubación en 2 mL de tripsina/EDTA estándar cultura condiciones para 5 minutos comprobar brevemente para asegurar que las células han disociado con éxito del frasco usando un microscopio de contraste de fase/luz (con un objetivo de 10 X ).</li>
	<li>Añadir 4 mL de medio de cultivo para neutralizar la reacción de la tripsinización. Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 200 x g durante 4 minutos para que sedimenten las células. Lentamente, aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no para desalojar la pelotilla. Resuspenda el sedimento en 5 mL de medio.</li>
	<li>Transferir una alícuota de 20 μl de la suspensión de células en un hemocitómetro limpio y contar las células utilizando un microscopio con un objetivo de 10 X.</li>
	<li>Preparar las células para la explosión mediante la colocación de tres platos de 35 mm dentro de un plato de 90 mm. Etiquetarlos adecuadamente. Añadir 2 mL del medio de cada plato de 35 mm y un total de 5 x 10 4 células por plato, distribuir las células uniformemente alrededor de la fuente de la semilla. Incubar las muestras experimentales durante la noche en condiciones de cultivo estándar para permitir el accesorio de celular adecuada antes de la exposición de ondas de choque. 
	Nota: Imagen fluorescente, las células deben ser sembradas sobre cubreobjetos de vidrio estéril.</li>
</ol> 2. Conjunto de tubo de choque <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> figura 2 : EVOC la plataforma y descarga tubo conjunto. (A) imagen de la plataforma EVOC. (B) esquema de los aparatos de tubo de choque. Dimensiones de tubo de choque incluyen 59 mm y una longitud total, incluyendo la plataforma EVOC, 4,13 m de diámetro interior. La longitud del tubo conducido y los totales de la plataforma EVOC 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Usar botas de trabajo punta de acero y una capa de laboratorio durante los procedimientos de montaje.</li>
	<li>Insertar las barras de alineación de dos a través de los agujeros de dos perno encontraron en el plano horizontal de la brida de salida. Coloque una hoja de la Junta de caucho de nitrilo sobre el extremo de las barras de alineación para que se sienta entre el reborde del enchufe y el aparejo vivo ex órgano cultura (EVOC). 
	Nota: La plataforma de EVOC es un accesorio diseñado para uso con platos de Petri de 35 mm ( figura 2A).</li>
	<li>Fijar el aparejo EVOC a la brida de salida del tubo de descarga deslizando el accesorio sobre las barras de alineación, asegurándose que esté orientado correctamente para que la sección que contiene la caja Petri se encuentra en su base.</li>
	<li>Introduzca cuatro tornillos M24 y arandelas en los orificios restantes. Coloque las tuercas de manera que toquen la brida.</li>
	<li>Firmemente apriete las tuercas y los pernos secuencialmente de manera diagonal simétrica mientras que controlar visualmente que el tubo de la plataforma y el choque EVOC han alineado con éxito.</li>
	<li>Colocar un transductor de presión para la plataforma EVOC y conectarlo a la fuente de corriente mediante un cable sensor. Luego, usando un cable BNC, conecte la fuente de corriente para el osciloscopio.</li>
	<li>Asegúrese de que todos liberan válvulas y controles en el tubo de descarga de flujo está cerrados. Abra la línea de aire comprimido incorporado y manualmente gire el regulador de presión para cargar el solenoide a 2,5 bar</li>
	<li>Abrir la válvula de seguridad de la botella de gas comprimido en el 180° en sentido antihorario.</li>
	<li>Gire lentamente el regulador de presión, situado en la cima de la botella de gas, hacia la derecha para aumentar la presión a aproximadamente 15 bar 
	Nota: El punto de ajuste de este regulador debe estar ligeramente por encima de la más alta presión de ruptura del diafragma más grueso que debe ser utilizado en el experimento de.</li>
	<li>Preparar los diafragmas por una lámina de plástico 0.125 mm de espesor de corte en cuadrados de 10 cm x 10 cm. 
	Nota: El espesor del diafragma se correlaciona con las presiones de trabajo, alteración de la presión pico de la onda de choque (es decir, un diafragma más grueso se traducirá en una onda de choque con una presión máxima más grande; Tabla 1).</li>
</ol> < mesa fo:keep-together.within-página = "1" &gt; <tbody><tr><td>diafragma de Mylar dimensiones (cm)</td> <td>presión (bar) de la explosión</td> <td>3 Sensor de rango de presión (kPa)</td></tr> <tr><td>x 10 x 10 0.023</td> <td>2 ± 0.2</td> <td>47 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0.2</td> <td>72 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>± 9,5 0,5</td> <td>127 ± 12.5</td></tr></tbody> < /t capaz > tabla 1: explosión presión correspondiente al espesor de la membrana y la presión máxima.
<ol start="11"> <li>crear asas de cinta, fijan los mismos a la parte superior e inferior del diafragma y utilizarlos cuidadosamente colocar el diafragma junto a la brida pequeña delantera por la sala de la recámara. Asegúrese de que el diafragma esté recta y correctamente posicionados antes de cerrar la recámara.</li>
	<li>Esto asegure usando cuatro pernos M24 y tuercas. Apriete firmemente las tuercas y los pernos secuencialmente de manera diagonal simétrica.</li>
</ol> 3. Preparación de las células justo antes de la exposición de ondas de choque <ol><li>preparar una campana de flujo laminar de tejido al realizar la esterilización ultravioleta. Limpie con un desinfectante solución y 70% de etanol. Reunir todos los elementos necesarios para la manipulación de células previa a/post-choque de onda exposición y colocan dentro de la campana estéril. 
	Nota: Esto incluye el medio fresco, membranas permeables al gas adhesivo, tijeras estériles, pipetas y pipeta consejos.</li>
	<li>Transferencia de un plato de Petri de 90 mm que contienen tres muestras experimentales de la incubadora a la campana estéril.</li>
	<li>Corte de una membrana permeable al gas adhesivo de la hoja (véase la Tabla de materiales) en seis cuadrados, tales que cada uno es lo suficientemente grande como para cubrir la parte superior de un plato de Petri de 35 mm.</li>
	<li>Aspirar el medio de la placa de Petri de 35 mm, coloque la tapa a un lado y cubierta con dos tramos de adhesivo membranas permeables al gas, que haya un sello hermético entre la membrana y el borde del plato.</li>
	<li>Transferir la muestra a la plataforma EVOC y fijarlo a la base de la lámpara para que la parte superior del plato se alinea con la base interna del tubo de descarga.</li>
</ol> 4. Operación del tubo de choque <ol><li>usar orejeras, anteojos, botas de seguridad y una capa del laboratorio al presurizar el sistema de tubo de descarga.</li>
	<li>Gire la perilla de control de flujo en el regulador, permitiendo fluir en el tubo flexible, conectar el cilindro de aire comprimido al tubo de descarga de gas.</li>
	<li>En la parte inferior del panel de control, seleccionar la &#34; podálica doble &#34; entrada para un wav de choque de corta duracióne o la &#34; tubo conductor &#34; entrada para una duración de onda mayor.</li>
	<li>Encender la fuente de alimentación CC y osciloscopio para adquirir los datos de forma de onda. Ajustar el osciloscopio de muestreo a 50,0 m/s, con una longitud de registro de 1 M puntos. Establecer un rango de 50 mV para disparar a 2 bar y 100 mV por encima de 4 bar</li>
	<li>Encender las luces de seguridad usando el interruptor en la pared opuesta del panel de control. 
	Nota: Esto le dice a otros investigadores no para entrar en la habitación cuando se está cargando el tubo de descarga.</li>
	<li>Gire el interruptor en la caja de control de solenoide para cerrar el solenoide. 
	Nota: Esta función de seguridad cierra una válvula situada en el compartimiento trasero doble, permitiendo que el sistema cargará.</li>
	<li>En el panel de control, abra lentamente el control del flujo girando la perilla en sentido antihorario para aumentar gradualmente la presión dentro de la cámara de compresión. Medir la presión usando la pantalla del panel de control.</li>
	Se llega a <li>una vez que la presión de ruptura de la membrana, la membrana se rompa y un &#34; bang &#34; se escuchará. Cerrar rápidamente el control del flujo girando la perilla de. 
	Nota: La onda de choque viajará por el tubo sobre la muestra de la célula y hacia fuera el extremo del tubo.</li>
	<li>Abrir el solenoide girando el interruptor en la caja de control de solenoide y apagar la luz de seguridad (usando el interruptor en la pared opuesta del panel de control).</li>
	<li>Transferir la muestra de células para la campana estéril, retirar el adhesivo membranas permeables al gas y llenar el plato con 2 mL de medio de cultivo fresco. Las células pueden ser utilizadas inmediatamente para la evaluación, como se describe en el paso 5, o devuelta a la incubadora para estudios a largo plazo.</li>
</ol> 5. Viabilidad celular <ol><li>evaluar viabilidad de las células después de la exposición de ondas de choque mediante la combinación de un análisis de indicador redox y la proyección de imagen fluorescente de células vivas y muertas. 
	Nota: Imagen fluorescente, las células deben ser sembradas sobre cubreobjetos de vidrio estéril durante la sección 1: cultura y muestra la preparación de la célula. Estos pueden colocarse dentro de los platos de petri de 35 mm.</li>
	<li>Transferencia de 200 μL del reactivo indicador redox (véase la Tabla de materiales) a cada plato experimental directamente después de rellenar con 2 mL de medio choque posterior onda de exposición. Incubar en las condiciones de cultivo estándar para 4 h.</li>
	<li>Para cada plato, transvasar (en una campana estéril oscurezca) 2 x 100 μl a cada negro o claro placa de 96 pocillos, dependiendo de si la fluorescencia o la absorbancia se utiliza para evaluar viabilidad.</li>
	<li>Transferir la placa de 96 pocillos en un lector apropiado con los filtros correctos y leer utilizando bandas de excitación 530ex/590em por fluorescencia o 570 nm combinado con una referencia de 600 nm de absorbancia. Exportar y guardar los datos.</li>
	<li>Analizar los datos para identificar cualquier diferencia entre las muestras expuestas a ondas de choque y controles no expuestos, como esto puede indicar una disminución en la viabilidad celular. 
	Nota: Un control negativo debe incluirse también en el diseño experimental. Además, la interpolación de una curva estándar se puede usar para calcular el número de células.</li>
	<li>Aspire el medio que contiene el reactivo indicador de redox. Reemplazar con 2 mL de medio fresco e incubar las células en condiciones de cultivo estándar para 24 h.</li>
	<li>Repetir los pasos anteriores según sea necesario para obtener un segundo momento de viabilidad.</li>
	<li>Para la proyección de imagen fluorescente de células vivas y muertas, Aspire el medio y lavan las células dos veces en 1 mL de PBS. Transferir 100 μl del reactivo completo encontrado en la proyección de imagen kit (véase la Tabla de materiales) para cada muestra e incubar a temperatura ambiente protegido de la luz por 15 minutos</li>
	<li>Aspirar el reactivo y lavar una vez con 1 mL de PBS. Cuidadosamente con unas pinzas de punta fina, quitar el cubreobjetos de la fuente de 35 mm y colocarlo boca abajo sobre un portaobjeto de microscopio.</li>
	<li>Adquisición de imágenes para cada muestra usando un microscopio de fluorescencia (objetivo de 10 X, abertura numérica 0.50) equipado con los filtros de excitación y emisión correcta (ex / em 488 nm/515 nm y 570 nm nm/602). 
	Nota: Células vivas emite fluorescencia verde, intenso y uniforme. Las células muertas o moribundas con una membrana celular comprometida serán la absorción el componente muerto, dando por resultado la emisión de fluorescencia roja, encontró predominante en la región nuclear de la célula.</li>
	<li>Análisis de la imagen software ya sea manualmente o automáticamente, cuente el número de células vivas y muertas de cada imagen.</li>
</ol>

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Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Lesiones primarias de la exposición a eventos de explosión no se entienden todavía completamente. Identificación y comprensión de los mecanismos que desencadenan lesiones ráfaga-inducida, como lesión de cerebro traumática3,4 y osificación heterotópica6,7, son impotantes para el desarrollo de métodos eficaces de profilaxis. Para lograr este objetivo, han desarrollado un número de sistemas experimentales para replicar blast evento exposición11,12,13,14,18,19 . La técnica descrita aquí utiliza equipo de tubo de descarga (figura 2) capaz de disparar ondas de choque en un rango de presiones en todo el cuerpo (es decir, roedor), tejido o muestras de células. La capacidad de carga de tipos de células individuales en lugar de tejidos todo da la capacidad para analizar a distintas respuestas celulares, que puede dañar al mismo tiempo a través de una variedad de mecanismos1,2. Por ejemplo, para modelar traumática lesión cerebral, la evaluación de tipos de células individuales, tales como neuronas y astrocitos, pueden permitir la identificación de lesiones específicas de la célula. Además, la respuesta de todo órgano puede ser evaluada utilizando tejido cerebral. Los tipos de células individuales y los especímenes del tejido tienen valor y pueden dar información diferente. También es posible modificar la cantidad de aire que se presuriza para generar la descarga seleccionando la entrada de la recámara doble o tubo conductor. Controla la duración de la onda de choque. Otra posibilidad es cambiar el material del diafragma y el grosor para alterar la presión pico del25.
Otro factor a considerar son los efectos de final de interferencia que pueden estar presentes cuando la cubierta de la muestra se encuentra cerca de la salida del tubo de descarga, tales como los encontrados en la plataforma EVOC descrita en el presente. Chandra et al. vieron la explosión onda perfiles encontrados en diferentes lugares en un tubo de choque basada en la compresión y encontró que la forma de onda de Friedlander fue mejor representada en un lugar profundo dentro del tubo de descarga15. Kuriakose et al. también estudiaron carga secundaria de la muestra y que la colocación de una placa de extremo en el extremo del tubo de choque pudo eliminar ondas reflejadas no deseados16. Teniendo en cuenta los datos encontrados en estas publicaciones15,16, futuras modificaciones para mejorar el sistema de tubo de choque se describe en este artículo conlleva la colocación de la plataforma EVOC en una ubicación más profunda dentro del tubo conducido o, por otra parte, la inclusión de una placa de extremo del tubo de descarga. Limitaciones del método descrito podrían incluir el rendimiento relativamente bajo de muestras. Un solo usuario puede operar el tubo de descarga con seguridad en una salida de alrededor de 6 a 8 muestras por hora. En la actualidad, el sistema está diseñado alrededor del uso de platos de petri de 35 mm solo. Por lo tanto, los experimentos más grandes que contienen múltiples grupos y réplicas biológicas pueden ser difíciles de lograr.
Este artículo de métodos muestra cómo la viabilidad de células de la papila dérmica adherente fue afectada por la exposición a una sola onda de choque. Una onda de choque de corta duración (&#60; 10 ms) de ≤72 kPa no afectar la viabilidad en comparación con el control (figura 3 y figura 4). En cambio, una onda de choque en 127 kPa estimuló una gota significativa en viabilidad en ráfaga después de 24 h, como se muestra en un ensayo de indicador redox (figura 3) y el análisis de imagen fluorescente (figura 4). Miller et al. informó de una reducción similar en la viabilidad celular en cultivos de rebanada hippocampal organotypic rata cuando las células se exponen a una o un 147 kPa u ondas de choque de 278 kPa utilizando un tubo de descarga abierta, impulsado por helio14. En cambio, VandeVord et al informaron que no hubo efecto sobre viabilidad en los astrocitos de rata expuestas a una sobrepresión de corta duración de &#62; kPa 200, aunque un barochamber fue utilizado en lugar de un tubo de choque18. Cabe señalar que la presión externa depende de la onda de la explosión, aunque esto crea ondas de estrés complejo dentro del cuerpo, lo que la naturaleza del cargamento altamente dependiente de las propiedades mecánicas de los tejido o célula. Se requiere estudios adicionales de caracterización de la respuesta celular a los eventos de explosión. Además, por evaluación de la exposición de ondas de choque a nivel celular, como se muestra en esta técnica, se pueden identificar respuestas biológicas desencadenadas por la lesión, como la perturbación de la señalización de vías o cambios epigenéticos y explorar más.
En conclusión, este trabajo describe el uso de un tubo de descarga de acero inoxidable y un aparejo EVOC modificado para incorporar cultivos celulares primarios. Ondas de choque en un rango de presiones puede ser generadas y propagadas en células vivas para replicar los efectos que se producen por la exposición a una onda de la explosión. Este protocolo muestra cómo evaluar viabilidad celular, pero también se pueden estudiar cambios a largo plazo a tipos de células individuales. A futuro, tenemos la intención de evaluar los efectos diferenciales que pueden provocan complejas ondas de choque en diferentes tipos celulares, con el objetivo de fomentar nuestra comprensión de lesiones primarias inducida por la explosión.

Con la reciente tendencia hacia el uso de dispositivos explosivos improvisados en la guerra moderna y acciones terroristas contra civiles, entender los efectos de eventos explosivos en el cuerpo humano es de gran importancia. Lesiones obtenidas a través de la exposición a eventos de explosión pueden ser mortal y letal, con los procesos físicos de lesión se dividen en cuatro categorías. Resultado de lesiones primarias de exposición directa a la onda de la ráfaga, que interactúa localmente con el cuerpo de manera compresiva y posteriormente expansiva, causando la interrupción de las membranas y los tejidos blandos1. Lesiones secundarias incluyen trauma embotado o penetración heridas producidas por impacto con objetos de baja masa propulsados a gran velocidad por la onda de la explosión. Lesiones terciarias ocurren cuando la onda de la ráfaga tiene energía suficiente como para arrojar objetos de masa alta o individuos contra objetos. Por último, lesiones de la ráfaga cuaternario son definidos por otras lesiones misceláneas que no encajan en otras categorías, tales como quemaduras de flash2. Después de la exposición a acontecimientos de la explosión, lesiones primarias incluyen lesión de cerebro traumática3,4,5, osificación heterotópica6,7, blast pulmonar lesión8, pérdida de la audición 9y otros10.
Una forma de onda comúnmente observado de eventos de explosión es la onda de Friedlander, que representa una explosión de campo libre, en contraposición a un espacio cerrado. La forma de onda consiste en un frente de ráfaga que puede definirse como un aumento rápido y sostenido de presión positiva. Esto es seguido inmediatamente por un viento de ráfaga de aire que se mueve a alta velocidad y una ola de liberación que reduce la presión por debajo de los niveles atmosféricos. Deja un vacío parcial en la región de la explosión inicial, que se traduce en el lento reflujo de aire. Las fases positivas y negativas de la onda (figura 1A) resultan en el movimiento de vaivén de la explosión de la onda1. Para ayudar a dilucidar los mecanismos detrás de lesiones de la explosión primaria, modelos experimentales se han creado para producir formas de onda, como la ola de Friedlander, que las células y los tejidos se enfrentarán cuando se expone a un evento de verdadera explosión. Los sistemas actuales enumerados la literatura incluyen choque tubos11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, Kolsky bar20, blast avanzados simuladores21, el Split Hopkinson presión bar22y la recreación de los eventos de explosión alternativo en un ambiente controlado mediante Tetranitrato de pentaeritritol23. A pesar de la amplia gama de modelos disponibles, muchas variables influyen en la lesión de las ondas de explosión, incluyendo la pre-tensión aplicada y las propiedades mecánicas de los tipos de células individuales o tejidos bajo evaluación24. Mientras que el estudio de tejidos u órganos puede arrojar luz sobre la deformación del tejido y cambios morfológicos graves sufridos como consecuencia de eventos de explosión, análisis a nivel celular pueden revelar cambios transcripcionales y epigenéticos, influenciados por la onda de choque.
Este artículo de métodos describe una técnica para propagar ondas de choque en un rango de presiones sobre células vivas en una monocapa. Esto permite la caracterización inmediata de la viabilidad celular, elucidar los umbrales de daño potencial de las ondas de choque. Además, células viables pueden ser devueltos a condiciones de cultivo estándar, y pueden ser evaluados a largo plazo efectos biológicos en el evento de explosión. El protocolo que a continuación describe dos técnicas de viabilidad de la célula que pueden usarse sobre células en cultivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Figura 1: Aproximación de una onda de Friedlander. (A) una aproximación de una onda de Friedlander observada en 3 de sensor en el tubo de descarga. (B) datos representativos que muestran los perfiles de presión observados en sensores 1, 2 y 3 en el tubo de descarga. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>MEM &amp;alpha;, nucleosides</td><td>ThermoFisher</td><td>22571020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>15070-063</td><td>Supplement to create complete growth media.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Dilute 1 in 10 before use.</td></tr><tr><td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td><td>Starlab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Triple Red</td><td>TCD010035</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent</td><td>VWR UK</td><td>391-0453&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Alamarblue cell viability reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>13494309</td><td></td></tr><tr><td>Virkon tablets</td><td>VWR UK</td><td>115-0020</td><td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>SurgicalTools</td><td>11295-10</td><td>Use to remove coverslips from petri dish.</td></tr><tr><td>Cover glass, square</td><td>VWR UK</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR UK</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>96 Well plate, solid black</td><td>AppletonWoods</td><td>CC760</td><td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td></tr><tr><td>96 Well plate, clear, (PS)</td><td>VWR UK</td><td>734-1799</td><td>Plate to be used for absorbance measurments.</td></tr><tr><td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Optical microscope used for cell culture.</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010A</td><td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0782</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0786</td><td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Mylar Electrical &amp;amp; Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm&amp;nbsp;</td><td>RS Components</td><td>785-0798</td><td>Use to create shock tube diaphragm.</td></tr><tr><td>Current source power unit</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>4103C</td><td>Power source for 2300V1 sensor.</td></tr><tr><td>IEPE Pressure Sensor</td><td>Dytran Intruments Inc.</td><td>2300V1</td><td>Pressure sensor located on shock tube.</td></tr><tr><td>Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO 4104B</td><td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td></tr></tbody></table>

evaluating primary blast effects in vitro

La exposición a eventos de explosión puede causar un trauma severo a los órganos vitales como los pulmones, oídos y cerebro. Comprensión de los mecanismos detrás de tales lesiones ráfaga-inducida es de gran importancia teniendo en cuenta la tendencia reciente hacia la utilización de explosivos en la guerra moderna y los incidentes relacionados con el terrorismo. Para entender completamente la lesión inducida por la explosión, primero debemos ser capaces de replicar estos eventos de explosión en un entorno controlado utilizando un método reproducible. En esta técnica usando equipo de tubo de choque, ondas de choque en un rango de presiones puede ser propagadas en células vivas cultivadas en 2D, y marcadores de viabilidad celular pueden ser analizados inmediatamente usando un análisis de indicador redox y la proyección de imagen fluorescente de células vivas y muertas. Este método demostró que aumentar la sobrepresión de la ráfaga pico 127 kPa puede estimular una gota significativa en viabilidad celular en comparación con controles no tratados. Prueba de las muestras no se limitan a las células adherentes, pero pueden incluir suspensiones celulares, muestras de todo el cuerpo y el tejido, a través de pequeñas modificaciones a la instalación del tubo de descarga. Es difícil reproducir las condiciones exactas que células y tejidos cuando se expone a un evento de verdadera explosión. Técnicas como la que se presenta en este artículo pueden ayudar a definir los umbrales de daño e identificar los cambios transcripcionales y epigenéticos dentro de las células que surgen de la exposición de ondas de choque.

Usando el método descrito anteriormente, las células cultivadas en una monocapa fueron expuestas por triplicado a las ondas expansivas generadas usando un tubo de descarga (figura 2B). Se evaluaron los marcadores de viabilidad celular. Usando un análisis de indicador redox, se encontró que la aplicación de una onda de choque de 127 kPa fue capaz de reducir significativamente la viabilidad de células de la papila dérmica en comparación con los controles después de 24 h en cultivo (figura 3). La aplicación de una onda de choque ≤72 kPa no redujo la viabilidad. Para apoyar estas observaciones, un análisis de imagen fluorescente capaz de etiquetado fluorescencia células vivas o muertas con fluoróforos verde o rojo, respectivamente, fue utilizado. La cuantificación de las células vivas y muertas de 13 imágenes fluorescentes por repetición biológico demostró una reducción en la viabilidad celular en aquellos expuestos a la onda de choque de 127 kPa en comparación con el control (figura 4). El análisis estadístico se realizó mediante un ANOVA de una vía seguido de prueba de comparación múltiple de Tukey, p &#60; 0.05 como estadísticamente significativo. El tamaño de la muestra por grupo fue de 9 para el análisis de indicador redox y 39 para el análisis de imágenes de fluorescencia cuantitativa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Figura 3 : Datos de análisis indicador redox que muestra el curso del tiempo de viabilidad celular después de la exposición de ondas de choque. Significativamente menos células fueron observadas después de 24 h en el grupo de expuestos a ondas de choque 127 kPa en comparación con el control sin tratar. El control negativo que consistió en un tratamiento de 30-s con el 2% desinfectante (ver la tabla de materiales) mostraron significativamente menos células en T0 y 24 h en comparación con otros grupos. Cada barra representa la media ± 1 desviación estándar (SD); réplicas biológicas, N = 3; Replica de la técnica, n = 3. = p &#60; 0.0001. * = p &#60; 0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Figura 4 : Proyección de imagen de fluorescencia. (A) datos cuantitativos recogidos de imágenes fluorescentes de células vivas y muertas capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia en la exposición de ondas de choque después de 24 h. Significativamente menos células viables fueron observadas en el 127 kPa (significa = 93.42) muestra expuestos a ondas de choque en comparación con los 47 kPa (significa = 98.18), 72 kPa (significa = 98.87) y grupos de control (significa = 99,10). No hay células viables fueron observadas en el grupo control negativo después de 24 h (media = 0). (B) las imágenes representativas de la fluorescencia. Verde muestra células vivas, mientras que el rojo muestra las células muertas. Cada caja muestra los cuartiles superiores e inferiores con barbas de Tukey; réplicas biológicas, N = 3; Replica de la técnica, n = 13. = p &#60; 0.0001. Barra de escala = 300 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Entender cómo las células están moduladas por la exposición a ondas de choque puede ayudar a identificar los mecanismos detrás de lesiones activados de eventos de explosión. Este protocolo utiliza equipo del tubo de descarga a la medida para aplicar ondas de choque en un rango de presiones a monocapas de células e identificar los efectos subsiguientes sobre la viabilidad celular.

Evaluación primaria explosión efectos In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K vistas.  Imperial College London. Entender cómo las células están moduladas por la exposición a ondas de choque puede ayudar a identificar los mecanismos detrás de lesiones activados de eventos de explosión. Este protocolo utiliza equipo del tubo de descarga a la medida para aplicar ondas de choque en un rango de presiones a monocapas de células e identificar los efectos subsiguientes sobre la viabilidad celular.

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Blast Quantification Using Hopkinson Pressure Bars

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures up to many hundreds of megapascals. In this respect the simplicity of the Hopkinson pressure bar has a major advantage in that while the measurement end of the Hopkinson bar can endure and be exposed to harsh conditions, the strain gauge mounted to the bar can be affixed some distance away. This allows protective housings to be utilized which protect the strain gauge but do not interfere with the measurement acquisition. The use of an array of pressure bars allows the pressure-time histories at discrete known points to be measured. This article also describes the interpolation routine used to derive pressure-time histories at un-instrumented locations on the plane of interest. Currently the technique has been used to measure loading from high explosives in free air and buried shallowly in various soils.

This protocol details the use of Hopkinson pressure bars to measure reflected blast loading from near-field explosive events. It is capable of interpolating a pressure-time history at any point on a reflective boundary and as such can be used to fully characterize the spatial and temporal variations in loading produced.

Explosión Cuantificación Utilizando listones de presión de Hopkinson

Near-field blast load measurement presents an issue to many sensor types as they must endure very aggressive environments and be able to measure pressures ...

Investigación

Ingeniería

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Medio ambiente

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Medicina

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

Protocolo para el modelado de blastoides humanos Desarrollo e implantación de blastocistos

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Biología del Desarrollo

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Inmunología e Infección

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Un modelo de novela In Vitro de lesión cerebral traumática por explosión

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Neurociencias

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efectos de Neurotrauma inducido ráfaga en roedor a presión media de las arterias cerebrales

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

Modelo de onda blástica de baja intensidad para la evaluación preclínica de la lesión cerebral traumática leve de cabeza cerrada en roedores

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Método de tubo de choque para modelar explosiones de bajo nivel altamente repetitivas en ratones

Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are well understood, the effects of smaller blasts such as those that occur during military training are less understood. This small, low-level blast exposure also varies highly according to military occupation and training tempo, with some units experiencing few exposures over the course of several years whereas others experience hundreds within a few weeks. Animal models are an important tool in identifying both the injury mechanisms and long-term clinical health risks following low-level blast exposure. Models capable of recapitulating this wide range of exposures are necessary to inform acute and chronic injury outcomes across these disparate risk profiles.
Although outcomes following a few low-level blast exposures are easily modeled for mechanistic study, chronic exposures that occur over a career may be better modeled by blast injury paradigms with repeated exposures that occur frequently over weeks and months. Shown here are methods for modeling highly repetitive low-level blast exposure in mice. The procedures are based on established and widely used pneumatic shocktube models of open-field blast exposure that can be scaled to adjust the overpressure parameters and the number or interval of the exposures. These methods can then be used to either enable mechanistic investigations or recapitulate the routine blast exposures of clinical groups under study.

Autor destacado: Descifrando los efectos a largo plazo de las exposiciones a explosiones de bajo nivel en ratones

Presented here are methods for producing repeated low-intensity blast exposures using mice.

Modelado de la exposición a explosiones de bajo nivel altamente repetitivas en ratones

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are ...