Este trabalho foi possível graças a subvenções a JK dos Centros de Excelência de Ontário e do Fundo de Investigação Ontario. Gostaríamos de agradecer a Siddika Pardhan e Dr. Peter Ferguson para a assistência técnica durante as filmagens.

NOTA: O protocolo seguinte foi desenvolvido para utilização com células aderentes. As modificações são necessárias para aplicar o método com as células não-aderentes cultivadas em suspensão. Os ensaios de CAM descritas no protocolo são concebidos para utilização com células que expressam um marcador fluorescente (por exemplo, GFP, RFP, etc.). Nove dias de idade embriões de galinha são necessários no dia 2 do protocolo experimental para os experimentos CAM. 1. Preparação e transfecção de células de tumor com oligonucleótidos anti-sentido (ASOs) <ol><li> Aspirar o meio do frasco (s) contendo as células T75 de interesse, lavagem com PBS 1 X, e adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina / EDTA. Adicionar 10 ml de meio de crescimento completo a cada balão e transferir as células em solução para um tubo de 50 ml. Contar as células e ajustar o volume para que a concentração final é de 1,0x10 células por 5 ml. </li><li> Etiqueta de dois grupos de frascos T25: um grupo conterá oito frascos rotulados, 1-8, e irá ser used para o tempo real experiência de medição metabolismo; e o segundo grupo também conterá 8 frascos e irá ser utilizado para a experiência de CAM de embrião de galinha. Adicionar 2 ml de solução de células em cada balão e para lugar na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 O / N). </li><li> Na manhã seguinte (Dia 0, Tempo 0), etiqueta três 5 ml tubos da seguinte forma: controle (não-alvo ASO ou siRNA), &quot;alvo de interesse&quot; (ou seja, visando ASO ou siRNA), e Lipofectamine 2000 (ou um semelhante o reagente de transfecção). Dilui-se as soluções de estoque de ASO a uma concentração adequada por meio isento de soro no tubo apropriado. <ol><li> Adicionar a quantidade necessária de reagente de transfecção para o tubo apropriado e incubar em meio isento de soro, durante 5 min. Adicionar a solução de reagente de transfecção para os tubos de ASO e incubar durante 20 min. </li></ol></li><li> Adicionar 250 uL de solução de reagente de transfecção controlo ASO para cada um dos frascos de 1-4 em cada grupo, e 250ul da solução de reagente de transfecção &quot;alvo de interesse&quot; ASO para cada um dos frascos de 5-8 em cada grupo. Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2). <ol><li> Durante a incubação, siga os passos descritos na secção 2.1. Após a incubação, adicionar 3 ml de meio completo a cada frasco no grupo experimental CAM e retornar à incubadora S / N (37 ᵒC, 5% de CO 2). Processe o grupo experimento metabolismo de acordo com a descrição na seção 2.2. Processe o experimento CAM definido de acordo com a descrição na seção 4. </li></ol></li></ol> 2. Biosensor Chip Preparação e semeadura de células <ol><li> Em um ambiente estéril, lavar cuidadosamente seis chips biossensores com 400 ul de PBS. Esterilizar os chips com 400 mL de etanol a 70% para 20 min. Lavar três vezes com 400 ul de PBS. <ol><li> Coloque os chips dentro cultur tecido estérile pratos para evitar a contaminação. Coloque três chips em um prato chamado &#39;control&#39;, e três em um prato chamado &#39;alvo de interesse &quot;. </li></ol></li><li> Rotular dois tubos de 50 ml como &quot;controle&quot; e &quot;alvo de interesse&quot;. Lavar as células com PBS e adicionar um volume apropriado de 0,25% de tripsina / EDTA. Aguarde até que o separa de monocamada e recolher as células de cada frasco. Depositar a solução no tubo apropriado. <ol><li> Contar as células e ajustar o volume para que a concentração final é de 6.0x10 5 células / mL. Centrifuga-se e voltar a suspender as células se a concentração inicial é demasiado baixo. </li></ol></li><li> Adicionar 250 ul da solução de células para cada chip biossensor em que o grupo apropriado (para um total de 1.25x10 5 células por chip). Execute esta tarefa um grupo de cada vez para minimizar o risco de confundir os chips. Coloque os pratos estéreis contendo os chips dentro de uma câmara de umidade para evitar a evaporação, e colocar os cha umidadember na incubadora S / N (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li><li> Na manhã seguinte (Dia 1), aspirar cuidadosamente o meio de cada chip e substituí-la com 250 ul de meio de crescimento suplementado com soro 0,2% de bovino fetal (FBS) e 1x penicilina e estreptomicina (P / S). Incubar durante 4 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li></ol> 3. Metabolismo Sistema de Medição Preparação e Solution Preparação <ol><li> Durante a incubação, preparar as soluções de drogas necessárias e o sistema de medição de metabolismo para o próximo ensaio. NOTA: O sistema de medição metabolismo contém um total de seis módulos. Cada módulo acomoda um único chip a cada ensaio. <ol><li> Subdividir o ensaio nos seguintes grupos experimentais: um chip da cada um dos &quot;controlo&quot; e &quot;alvo de interesse&quot; grupos para receber veículo para a duração do ensaio; dois chips de cada grupo a receber tratamento droga durante um período de tempo definido durante o umssay, seguido pelo veículo durante o período de lavagem. </li><li> Para estudos de sensibilização de drogas, modificar o comprimento, tempo e concentração de tratamento de drogas para se adequar a droga particular em questão. NOTA: Para cisplatina, as seguintes etapas foram determinados empiricamente com células A549, e pode variar dependendo da linha celular. Executar todas as etapas, com a taxa de fluxo padrão de 4 l / min. 6 hr de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S 24 hr de 6 mM cisplatina em meio + 0,2% FBS 1x P / S 24 h de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S 18 horas de crescimento médio + 0,2% de FBS e 1x P / S 4 h de 0,1% de Triton-X NOTA: Os desvios estes passos exigirá cálculo para determinar o volume necessário de soluções a médio e drogas com base na vazão desejada e duração do experimento. As secções que se seguem baseiam-se os passos descritos acima. </li></ol></li><li> Etiqueta e preencher catorze 50 ml tubos com 50 ml de meio de crescimento + 0,2% de FBS umd 1x P / S. Coloque seis em um suporte para tubos de medição do metabolismo do sistema, de seis em outro, e os dois restantes de um terceiro suporte de tubos que também contém tubos com cisplatina. Selar as duas primeiras cremalheiras com uma membrana permeável ao ar para prevenir a evaporação. </li><li> Prepara-se uma solução de 6 pM de cisplatina (do volume apropriado) em meio + 0,2% de FBS com 1x P / S. Repartir o volume necessário de uma solução de cisplatina em quatro tubos de 50 ml marcados. <ol><li> Colocar os tubos nas restantes quatro slots no terceiro metabolismo suporte de tubos de medição. Certifique-se de que os tubos são colocados nas respectivas aberturas que correspondem aos biomodules desejados. Selar os tubos com uma membrana permeável ao ar. </li></ol></li><li> Preparar e rotular seis tubos de 50 ml e enchê-los com 20 ml cada uma solução 0,1% Triton-X no meio. A solução Triton-X vai lisar as células restantes e fornecer um valor &quot;zero&quot; para cada chip. Colocar os tubos em uma quarta medida metabolismo suporte para tubos de unidade e selar with uma membrana permable ar para evitar uma evaporação excessiva. </li><li> Coloque as fichas no biomodules e iniciar o experimento. </li></ol> 4. CAM Experiment tratamento medicamentoso e Injeção NOTA: As etapas e os procedimentos para a preparação embriões de galinha para um experimento CAM são descritos em outros lugares 19 <ol><li> Começar a processar o hr pós-transfecção CAM experimento 48 (Dia 2). Sub-dividir o &quot;controle&quot; e &quot;alvo de interesse&quot; grupos em dois frascos para o veículo, e dois para a cisplatina. Aspirar o meio dos frascos e reconstituir ou com 3 ml de meio fresco, ou 6? M cisplatina. Incubar durante 6 horas (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li><li> Aspirar o meio e, em seguida lavar e trypsinize as células; recolher as células tripsinizadas em solução em quatro rotulados apropriadamente tubos de 15 ml. <ol><li> Centrifugar e lavar as células três vezes com PBS. Re-suspender o sedimento de células em 5 ml de PBS umad contar as células. </li><li> Ajustar o volume de forma a que a concentração celular final é 1,0x10 6 células / ml. Transferir a solução de células marcadas em tubos de 5 ml por injecção, e colocar em gelo. Inverta os tubos suavemente antes da injecção para assegurar que as células são bem misturados. </li></ol></li><li> Separe um total de 24 embriões de galinha (9 dias de idade) para injeção (6 por grupo). Realizar a injecção utilizando uma agulha de vidro ligada a um tubo flexível ligado a uma seringa de 1 ml. O indivíduo que executa a injecção deve ser cegos ao grupo de tratamento. <ol><li> Usando um microscópio estéreo, injectar 1,0x10 5 células em um volume de 100 ul para a circulação venosa da CAM. Usar uma técnica lenta, pulsante para injectar o volume total das células. Passe suavemente o local da injecção com um wipe para conter o fluxo de sangue e absorver qualquer derrame. Escreva em cada recipiente embrião adequadamente após cada injecção. </li></ol></li><li> Confirme a presença e distribuição de células fluorescentes na vasculatura da CAM após a injecção, visualizando-os utilizando um microscópio de fluorescência. Tome nota de todos os embriões na qual o número de células tumorais parece baixo, ou a distribuição é pobre. </li><li> Coloque os embriões de galinha em uma câmara de umidade e armazená-los em uma incubadora (37 ° C, 60% de umidade). Aguarde 7-9 dias antes de enumerar focos metastáticos. </li></ol> 5. metastático Foco enumeração <ol><li> Durante o período de incubação de 7-9 dia, monitorar os embriões e descartar qualquer mortos. Certifique-se de que a câmara de umidade permanece úmido em todos os momentos durante o período de incubação. </li><li> Usando um microscópio estéreo fluorescente com ampliação de 20x, verificar toda a superfície superior da CAM de embriões em, um padrão tipo grelha regular. </li><li> Contar o número de focos de metástase em cada campo de visão, em seguida, contar o número para um total final por embrião. Se o fizer, para os seis embriões em cada grupo irá fornecer um número o médiof focos metastáticos por tratamento. </li></ol>

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P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+pH+in+live+cells+with+a+genetically+encoded+red+fluorescent+protein+sensor.">Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor.</a> J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2+inhibition+enhances+cisplatin-mediated+alterations+in+tumor+cell+proliferation,+metabolism,+and+metastasis.">BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis.</a> Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Devido ao custo inerente e os riscos associados com os ensaios clínicos, existe uma necessidade de desenvolver uma melhor e mais rigorosa metodologia de ensaio pré-clínico para avaliar adequadamente a novos regimes de tratamento anti-cancro. Atuais técnicas comumente usadas todas as fraquezas de exposição que podem limitar a sua capacidade de discriminar entre alvos terapêuticos potencialmente promissoras / agentes, e aqueles que podem ser menos eficaz. Eu inventei um protocolo para avaliar novas abordagens anti-...

A resistência adquirida ao alvo e / ou tratamento do cancro citotóxica é um problema clínico importante que pode levar ao fracasso do tratamento, recaída, e um aumento da mortalidade do paciente. Dado o elevado grau de heterogeneidade na maioria dos tumores, é uma certeza matemática que um tumor do número de células suficientemente elevado irá conter um subconjunto de células resistentes a terapias individuais ou combinadas de segmentação vias moleculares em que as referidas células dependem para a sobrevivência 2,3. Tais células tumorais podem ser seleccionadas positivamente por durante o tratamento, levando a recorrência da doença. O desenvolvimento de novas terapias que visam simultaneamente diferentes mecanismos de sobrevivência de células de cancro, quer antes ou depois da selecção mediada por tratamento, é, portanto, clinicamente importante. Um elevado nível de instabilidade do genoma e mutação no genoma de tumor é uma característica fundamental que distingue as células de cancro a partir de células hospedeiras não-tumorais 4. Consequentemente, uma useful estratégia para aumentar a eficácia da quimioterapia danos no DNA e para prevenir o desenvolvimento da resistência é inibir activamente a reparação do ADN em células tumorais 5. Este é um campo ativo de investigação e de uma variedade de alvos de reparo de DNA novos estão sendo exploradas em um cenário pré-clínica. Uma série de pequenas moléculas ou inibidores à base de anti-sentido de estas metas foram desenvolvidos e são submetidos a testes 6-8. O objectivo é o de identificar os candidatos pré-clínicos mais promissoras e avaliar a sua segurança e eficácia em ensaios clínicos. O alto custo dos ensaios clínicos e o risco de falha (para uma variedade de razões, incluindo a avaliação pré-clínica sub-ótima) são formidáveis ​​obstáculos ao progresso no desenvolvimento de novas terapias 9. A utilização de modelos adequados e rigorosos pré-clínico para avaliar adequadamente novos alvos terapêuticos e medicamentos candidatos podem diminuir a elevada taxa de insucesso de 10 ensaios clínicos </sup&gt;. Alguns métodos pré-clínicos comumente usados ​​para avaliar a eficácia de novos regimes anti-cancro são: a) medição da capacidade para reduzir a proliferação de células tumorais in vitro (ensaios de proliferação celular), b) redução induzida pela terapia da capacidade de as células tumorais colónias de cultura de tecidos de forma (ensaios de formação de colónias), c) redução induzida pela terapia da actividade metabólica das células tumorais in vitro (conversão de corante redox), d) induzida por terapia de indução de morte in vitro de células de tumor (por apoptose, necrótica, autophagic, associado com a mitose e outros) 11, e e) a redução in vivo de crescimento ou ablação de xenoenxertos humanos e de rato induzida por terapia 12-14. A principal deficiência dos métodos in vitro listados é que nenhum deles fornecer avaliação contínua em tempo real do efeito das terapias candidatos. Em vez disso, eles fornecem informações somente em pontos de tempo selecionado, amplamente separadosdurante o curso do tratamento. Tais medidas têm diminuído a capacidade para refletir com precisão a magnitude e tempo de respostas das células tumorais. In vivo modelos rato xenograft também são limitadas pelo alto custo, duração de tempo para ser concluído, e risco de dosagem e tratamento calendário abaixo do ideal (agendamento). Além disso, há evidências de que os modelos de xenoenxerto de roedor são preditores limitadas de eficácia clínica em seres humanos, em comparação com uma avaliação in vitro das respostas de células de tumores humanos primários e linhas celulares de tumores humanos estabelecidos a intervenções terapêuticas candidatos 15,16. Eu inventei um protocolo combinação novela para avaliar novas combinações de medicamentos pré-clínica, de forma que aborda os pontos fracos dos procedimentos mais comuns listados acima. Em lugar de proliferação, a formação de colónias, ou ensaios de conversão de corante redox, utilizou-se uma unidade de medição de metabolismo para analisar a adesão celular, a respiração, a acidificação e em tempo realdurante todo o período de tratamento de 17. Simultaneamente, foram investigados os efeitos da combinação de tratamento in vivo usando um modelo de membrana corioalantóica (CAM) de invasão e metástase 18,19 embrião de galinha. Utilizou-se estes métodos para avaliar a capacidade de um oligonucleótido anti-sentido (ASO) BRCA2 direccionamento para potenciar a eficácia da cisplatina utilizada fármaco quimioterapêutico.

<table><tbody><tr><td>A549 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td></tr><tr><td>AeraSeal film</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Antisense oligodeoxynucleotides</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 target sequence: 5&#039; - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3&#039; (bases 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Biosensor Chips</td><td>Bionas GmbH and Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>Bionas Discovery 2500 System&amp;nbsp;</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Fertilized chicken eggs</td><td>Sourced locally</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen - Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12566014</td><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.25%)/EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating the effectiveness of cancer drug sensitization in vitro and in vivo

Devido ao elevado nível de heterogeneidade e inerentes mutações em cancros humanos, as terapias de agente único, ou combinações de drogas que têm como alvo a mesma via, são propensos a falhar. Ênfase deve ser colocada sobre a inibição de vias, que são responsáveis ​​pela resistência intrínseca e / ou à terapia adaptativa. Um campo ativo de investigação é o desenvolvimento e teste de inibidores de reparo de DNA que promovem a ação de, e prevenir a resistência a, comumente usado quimioterapia e radioterapia. Utilizou-se um novo protocolo para avaliar a eficácia de inibição BRCA2 como um meio para sensibilizar células tumorais ao ADN prejudiciais cisplatina droga. O metabolismo das células do tumor (acidificação e respiração) foi monitorada em tempo real por um período de 72 h, para delinear a eficácia do tratamento em um minuto a minuto. Em combinação, foi realizada uma avaliação da freqüência metastático utilizando uma membrana corioalantóide embrião de galinha (CAM) modelo de extravasamento e invasão. Esteprotocolo aborda alguns dos pontos fracos dos comumente usados ​​in vitro e in vivo para avaliar métodos novos esquemas de terapia do câncer. Ele pode ser usado em adição aos métodos comuns, tais como ensaios de proliferação celular, ensaios de morte celular, e os estudos in vivo de xenoenxertos de murina, para discriminar entre alvos mais de perto e de agentes candidatos, e seleccionar apenas os candidatos mais promissores para posterior desenvolvimento.

Resultados e figuras adaptado com permissão de trabalho publicado em 22. Inibição BRCA2 induz uma diminuição na respiração cisplatina em células tumorais tratadas Células de câncer de pulmão humano A549 tratados com BRCA2-targeting ASO e cisplatina apresentaram uma diminuição precoce e irreversível na respiração, em comparação com as células que receberam o controlo ASO e cisplatina isolada; após 24 horas de tratamento com ...

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Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

evaluating-effectiveness-cancer-drug-sensitization-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

8.7K visualizações.  Western University. Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics. 

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Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to overcome this challenge. Here, a 2-step dose-escalation method for establishing dual-resistance to an epidermal growth factor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib, and a MET-TKI, PHA665752, is described. This method is based on simple stepwise dose-escalation of inhibitors for inducing acquired resistance in cell lines. The alternate method for generating resistant sublines involves exposing the cells to high concentrations of the inhibitor in one step. The stepwise dose-escalation method has a higher possibility of successfully inducing acquired resistance than this method. Activating EGFR mutations are biomarkers of a response to treatment with EGFR-TKI, which is an applied first-line treatment for non-small cell lung cancers (NSCLC) that harbor these mutations. However, despite reports of effective responses, the use of EGFR-TKI is limited because tumors inevitably acquire resistance. The major mechanisms behind EGFR-TKI resistance include a secondary mutation at the gatekeeper site, T790M in exon 20 of EGFR, and a bypass signal of MET. Thus, a potential solution for this issue would be a combination of EGFR-TKI and MET-TKI. This combined treatment has been shown to be effective in an in vitro study model. Acquired gefitinib-resistance was established through MET-amplification by stepwise dose-escalation of gefitinib for 12 months, and a cell line named PC-9MET1000 was generated in a previous study. To further investigate the mechanisms of acquired MET-TKI and EGFR-TKI resistance, a MET-TKI, PHA665752, was administered to these cells with stepwise dose-escalation in the presence of gefitinib for 12 months. This protocol has also been successfully applied for a number of combination therapies to establish acquired resistance to other inhibitor molecules.

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

An in vitro method for establishing dual resistance to an EGFR-TKI and a MET-TKI in cancer cells is described. This method is useful for developing treatments for patients with EGFR-mutations, who exhibit disease progression despite EGFR-TKI treatment with MET-amplification. It can also be modified for inhibitors targeting other molecules.

Estabelecimento de dupla resistência de EGFR-TKI e conheci-TKI em Lung Adenocarcinoma células In Vitro com um procedimento passo-2 Dose-escalada

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Pesquisa do câncer

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines respond to therapeutic compounds in 2D (dimensional) monolayer cell cultures, 3D culture systems were developed to understand the efficacy of drugs in more physiologically relevant models. In recent years, a paradigm shift was observed in pre-clinical research to validate the potency of new molecules in 3D culture systems, more precisely mimicking the tumor microenvironment. These systems characterize the disease state in a more physiologically relevant manner and help to gain better mechanistic insight and understanding of the pharmacological potency of a given molecule. Moreover, with the current trend in improving in vivo cancer models, zebrafish has emerged as an important vertebrate model to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents. Here, we investigated the therapeutic efficacy of hydroxycoumarin OT48 alone or in combination with BH3 mimetics in lung cancer cell line A549 by using three different 3D culture systems including colony formation assays (CFA), spheroid formation assay (SFA) and in vivo zebrafish xenografts.

Here, we present the preclinical screening of anticancer coumarins using 3D culture and zebrafish.

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and manufacturing optimizations. One challenge for these development efforts, however, has been the establishment of in vitro assays that can robustly inform selection of the optimal CAR T cell products for in vivo therapeutic success. Standard in vitro tumor-lysis assays often fail to reflect the true antitumor potential of the CAR T cells due to the relatively short co-culture time and high T cell to tumor ratio. Here, we describe an in vitro co-culture method to evaluate CAR T cell recursive killing potential at high tumor cell loads. In this assay, long-term cytotoxic function and proliferative capacity of CAR T cells is examined in vitro over 7 days with additional tumor targets administered to the co-culture every other day. This assay can be coupled with profiling T cell activation, exhaustion and memory phenotypes. Using this assay, we have successfully distinguished the functional and phenotypic differences between CD4+ and CD8+ CAR T cells against glioblastoma (GBM) cells, reflecting their differential in vivo antitumor activity in orthotopic xenograft models. This method provides a facile approach to assess CAR T cell potency and to elucidate the functional variations across different CAR T cell products.

Here, we describe an in vitro co-culture method to recursively challenge tumor-targeted T cells, which allows for phenotypic and functional analysis of antitumor T cell activity.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Resposta à radiação em organoides tumorais derivados de pacientes usando um ensaio clonogênico

Live Imaging to Quantify Cellular Radiosensitivity in Patient-Derived Tumor Organoids

Radiation therapy (RT) is one of the mainstays of modern clinical cancer management. However, not all cancer types are equally sensitive to irradiation, often (but not always) because of differences in the ability of malignant cells to repair oxidative DNA damage as elicited by ionizing rays. Clonogenic assays have been employed for decades to assess the sensitivity of cultured cancer cells to ionizing irradiation, largely because irradiated cancer cells often die in a delayed manner that is difficult to quantify with short-term flow cytometry- or microscopy-assisted techniques. Unfortunately, clonogenic assays cannot be employed as such for more complex tumor models, such as patient-derived tumor organoids (PDTOs). Indeed, irradiating established PDTOs may not necessarily abrogate their growth as multicellular units, unless their stem-like compartment is completely eradicated. Moreover, irradiating PDTO-derived single-cell suspensions may not properly recapitulate the sensitivity of malignant cells to RT in the context of established PDTOs. Here, we detail an adaptation of conventional clonogenic assays that involves exposure of established PDTOs to ionizing radiation, followed by single-cell dissociation, replating in suitable culture conditions and live imaging. Non-irradiated (control) PDTO-derived stem-like cells reform growing PDTOs with a PDTO-specific efficiency, which is negatively influenced by irradiation in a dose-dependent manner. In these conditions, PDTO-forming efficiency and growth rate can be quantified as a measure of radiosensitivity on time-lapse images collected until control PDTOs achieve a predefined space occupancy.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Radioterapia e ensaios clonogênicos para o avanço da pesquisa do câncer e medicina personalizada

Here, we detail a straightforward live imaging approach for quantifying the sensitivity of patient-derived tumor organoids to ionizing radiation.

Imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade celular em organoides tumorais derivados de pacientes

Radiation therapy (RT) is one of the mainstays of modern clinical cancer management. However, not all cancer types are equally sensitive to irradiation, ...

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização

Resumo

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A Tissue Combinada 3D Engineered

Imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade celular em organoides tumorais derivados de pacientes

Imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade celular em organoides tumorais derivados de pacientes

Imagens ao vivo para quantificar a radiossensibilidade celular em organoides tumorais derivados de pacientes