Name: precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Iain Drummond e ao Dr. Vladimir Korzh por compartilhar linhas transgênicas de GFP renal. Também gostaríamos de agradecer a NYITCOM por fornecer os recursos necessários para realizar este trabalho. Este estudo foi parcialmente apoiado por subvenções: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) e HSCI Pilot Grant (AV).

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade de NYIT College of Osteopathic Medicine (NYITCOM IACUC). Toda a cirurgia e experimentação in vivo foi realizada sob anestesia tricaína, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. 1. Obtendo e mantendo embriões <ol><li> Obter embriões atravessando o peixe zebra fluorescente GFP renal. NOTA: Exemplos de linhas transgênicas de peixe zebra com marcação fluorescente estão listadas na Tabela 1 . </li><li> Mantenha os embriões a 28,5 ° C na solução de E3 durante as 24 h após a fertilização. </li><li> Após 24 h, substitua o meio por uma solução E3 que contém 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU). NOTA: PTU é usado porque bloqueia os passos dependentes da tirosinase na melanogêneseE, portanto, evita a pigmentação. Aqui, esta solução é conhecida como E3-PTU. </li><li> Aumentar os embriões fertilizados a 28,5 ° C até atingir 6 dpf, altura em que os rins amadureceram. NOTA: É melhor usar larvas na janela 7-9 dpf. </li><li> Usando um microscópio de dissecação fluorescente com ampliação de 40X e filtros de emissão de fluorescência verde, selecione as larvas com fluorescência GFP renal brilhante. </li></ol> 2. Montagem do Zebrafish para imagens ao vivo <ol><li> Se fotografar os embriões antes de 3 dpf, remova o corion de qualquer peixe zebra desabotoado antes de montar o peixe zebra para imagens. <ol><li> Descarte manualmente com pinça (preferida) ou use um tratamento químico com uma mistura de protease. NOTA: Dechorinação permite os melhores resultados de imagem. </li></ol></li><li> Enxágüe os restos corais na placa Petri usando a solução E3-PTU e recarregue o prato com E3-PTU. </li><li> PrepaRe 1-2% de agarose de ponto baixo de fusão (LMP) com 0,2 mg / mL de solução de tricaína para montar o peixe zebra para fotoablação renal e imagens ao vivo. <ol><li> Se LMP agarose já estava preparado de antemão, reaqueie-o no microondas para derreter. </li></ol></li><li> Uma vez preparada a agarose LMP, coloque uma placa de petri de plástico de 35 mm num microscópio de dissecação. Coloque uma sonda de vidro puxada próxima para orientar adequadamente as larvas anestesiadas. NOTA: É importante fazer este passo em tempo hábil e ter tudo no lugar, porque os embriões devem ser orientados antes da agarose solidificar em cerca de 1-3 min. </li><li> Antes de transferir o embrião para a agarose, certifique-se de que a agarose esteja fresca ( ou seja , a temperatura corporal). Use uma pipeta de transferência de plástico ou vidro para colocar o embrião na solução de agarose-tricaína derretida arrefecida. NOTA: Isto é feito porque a agarose que é muito quente pode prejudicar o embrião, levando a parada cardíacaOu morte </li><li> Usando uma pipeta de transferência, redesenhe o embrião na solução de agarose e posicione o embrião / larva no meio de um prato de 35 mm. </li><li> Distribua rapidamente a agarose contendo o embrião / larva para cobrir uniformemente o fundo do prato de 35 mm; O melhor volume de agarose a utilizar é ~ 1-1,1 mL. </li><li> Use a sonda de vidro para orientar o embrião na melhor posição possível para fotoablação e imagem. NOTA: O filme 1 mostra a melhor orientação do embrião / larva para a fotoablação unilateral. Este passo é o mais sensível ao tempo e deve ser realizado rapidamente antes que a agarose comece a gelar, uma vez que qualquer tentativa de reorientar o peixe após o início da gelificação é prejudicial. <ol><li> Oriente a larva de modo que o segmento de interesse renal seja perpendicular ao caminho do feixe enquanto o segmento contralateral está longe do raio laser (veja o filme 1 ). NOTA: Isto pode ser conseguido girando a larva como mostrado no filme 1 . </lI&gt; </ol></li><li> Permitir cerca de 15 min para a agarose para solidificar. Cubra a placa de Petri para minimizar a evaporação. Uma vez que a agarose se solidificou, o embrião ou larva está pronto para a fotoablation. </li></ol> 3. Ablação a laser <ol><li> Operar o sistema de imagem confocal. NOTA: Ao usar a plataforma de imagem referenciada (veja a tabela de materiais), as configurações recomendadas incluem ampliação de 40X, uma lente de imersão de água de 0,8 NA e o primeiro espelho dicróico para permitir a iluminação de 488 e 405 nm da amostra. A detecção deve ser realizada no canal verde. </li><li> Posicione o prato contendo o peixe zebra imobilizado em uma fase confocal. NOTA: Este procedimento é otimizado para a configuração vertical usando uma lente de imersão de água de 40-60X. No entanto, deve ser possível modificar o procedimento para um microscópio invertido. </li><li> Na configuração vertical, posicione a placa de Petri contendo o embrião em cima de um microscDeslize e mantenha-o no lugar usando argila de modelagem ( por exemplo, plastilina). Posicione a lâmina de vidro com a placa de Petri no palco do microscópio confocal. </li><li> Adicione 3 mL da solução de imagem E3-PTU (ver passo 1.3) com 0,2 mg / mL de tricaína. NOTA: A solução de imagem também pode ser adicionada imediatamente antes de colocar o slide no palco. A adição de solução de imagem deve ser feita com muito cuidado para evitar que a agarose flute no fundo do prato. </li><li> Mude para a lente de imersão de água (40 ou 60X). Levante lentamente o palco, certificando-se de que a lente está ligeiramente inclinada para evitar que o ar fique preso no caminho do feixe. Uma vez que a lente toca a solução em um ângulo, centre-a para que ela esteja no campo de visão dos embriões. </li><li> Encontre o segmento de interesse usando a fonte de luz de fluorescência. Posicione superficialmente o ramo alvo de lesões para minimizar a dispersão da luz (veja o filme 1 ). NOTA: A subsequênciaT etapas fazem uso do software referenciado (veja a Tabela de Materiais), mas o procedimento pode ser facilmente adaptado a outras plataformas. </li><li> Abra o software. Navegue até &quot;Exibir&quot; | &quot;Controle de Aquisição&quot; | &quot;C2plus Compact GUI&quot; e defina &quot;pixel dwell time&quot; para &quot;1.9 μs&quot;, &quot;frame size&quot; para &quot;512 x 512 pixels&quot; e &quot;tamanho pinhole&quot; para &quot;90 μm&quot;. Ajuste &quot;405 nm (ou 408 nm em alguns sistemas) intensidade do laser&quot; para zero e &quot;488 intensidade do laser&quot; para &quot;baixo&quot; (de preferência &lt;1%). Ajuste o &quot;ganho&quot; para obter um bom alcance dinâmico, mas não para saturar o sinal. NOTA: Estes valores não são críticos e são usados ​​para consistência. Quando um laser de 405 nm é usado, isso resultará em aumentos na fluorescência de GFP. Para evitar a saturação do sinal durante o fotobloco (etapa 3.11), o valor do ganho do sinal deve ser reduzido no canal verde. O ganho do canal azul pode ser deixado em zero, pois não é usado para saMpling. </li><li> Clique em &quot;Digitalizar&quot; na interface do software para verificar o rim usando um laser de 488 nm. Encontre o segmento de interesse que é perpendicular ao caminho do feixe e que está bem visualizado, com boa fluorescência GFP. Uma vez que essa região foi identificada, desenhe uma região de interesse usando uma região de interesse elíptica (ROI). <ol><li> Navegue até &quot;ROI&quot; | &quot;Desenhe o ROI elíptico&quot;. NOTA: Isto será usado para medir continuamente a intensidade média de GFP enquanto ocorre o fotobloco, permitindo a administração de uma dose precisa de tratamento a laser. </li></ol></li><li> Navegue até &quot;Exibir&quot; | &quot;Controles de aquisição&quot; | &quot;Área de digitalização C2plus&quot; e escolha &quot;Área de digitalização de bandas&quot;. A máscara retangular aparecerá dentro dessa interface. Defina manualmente uma janela de varredura retangular usando o cursor ( ou seja , arraste, redimensione e gire a máscara) para cobrir o segmento segmentado para ablação a laser. Clique com o botão direito do mouse noÁrea de máscara para aceitar a seleção. NOTA: Somente a região selecionada será digitalizada. </li><li> Comece a medição do tempo enquanto monitoriza o canal verde usando apenas o laser de 488 nm para ativar o GFP. Certifique-se de que a intensidade do laser 488 seja relativamente baixa (~ 1%). Mude a intensidade média do GFP na região de interesse selecionando &quot;Medir&quot; | &quot;Medição de tempo&quot;. Use as abas &quot;Gráfico&quot; ou &quot;Dados&quot; para monitorar os valores médios de intensidade dentro do ROI. NOTA: A taxa de aquisição é definida pelo tempo de permanência de pixels e o tamanho da janela retangular configurada na etapa 3.9, mas, em geral, permite a monitoração rápida do sinal (~ 2-10 quadros / s). </li><li> Induzir danos nas células do rim com o laser violeta (405 nm), aumentando a intensidade para 100%, deslizando o controle de &quot;potência do laser&quot; todo o caminho para a direita. O laser de 488 nm pode permanecer ativo se a intensidade for baixa. <ol><li> Observe uma linha gUsando a guia &quot;Gráfico&quot; ou os valores numéricos da intensidade GFP usando a guia &quot;Dados&quot; e aguarde até que ele caia para um nível desejado, por exemplo, 50% da linha de base (como mostrado na Figura 1 ). NOTA: Um laser de 20 mW foi usado como parte da unidade laser referenciada (veja a Tabela de Materiais ); A intensidade máxima pode variar entre os sistemas. A intensidade mais baixa pode ser compensada por uma exposição mais longa ( ou seja, usando porcentagem de branqueamento de GFP como medida da exposição total). </li></ol></li><li> Uma vez que a intensidade GFP dentro do ROI elíptico (passo 3.8) caiu para um nível desejado, diminua imediatamente a intensidade do laser violeta (405 nm) para &quot;0&quot;, movendo o controle deslizante &quot;laser power&quot; todo o caminho para a esquerda em O painel de controle do software. <ol><li> Obter uma nova linha de base de fluorescência GFP. Confirme a ablação obtendo uma proporção de X / Y. NOTA: veja a figura1B; Y = intensidade média antes da ablação e X = intensidade média após a ablação, utilizando uma média de 4 amostras consecutivas dentro do ROI. A relação alvo exata (50%, 60%, etc. ) depende da quantidade de lesão desejada para uma determinada experiência. </li></ol></li></ol> 4. Microscopia de lapso de tempo com coloração com iodeto de propídio <ol><li> Aplicar considerações de lapso de tempo geral (delineado em um estudo anterior 15 ) para visualizar manchas de iodeto de propídio como correlação de lesão de células renais após a fotoablation. </li><li> Pré-incubar as larvas em 30 μM de solução de iodeto de propídio (1% de DMSO em E3-PTU) durante 3 h antes da incorporação e fotoablação, como descrito nos passos 2 e 3.7, respectivamente. NOTA: Não é necessário iodeto de propídio adicional na agarose ou na solução de imagem. </li><li> Induzir injúria renal segmentar, conforme descrito nas etapas 3.1-3.12. </li><li> Obter pilhas de tempo lapso de imagem, como descriCama em um estudo anterior 14 , usando um laser de 488 nm (GFP) e um laser de 461 nm (Iodeto de propídio, PI). NOTA: As duas cores são sobrepostas em pilhas confocais para correlacionar o desaparecimento da GFP e a aparência da coloração com iodeto de propídio. </li><li> Defina os parâmetros para a obtenção das pilhas de imagem de lapso de tempo da seguinte forma: espessura da fatia virtual = 4 μm, intervalo de pilha z = 2 μm, tempo de espera de pixels = 1,9 μs, dimensões da imagem = 512 x 512 e média = 2. NOTA: Estes parâmetros permitem gravação contínua de intervalos de até 10 a 15 minutos de até 4 larvas e garantem que haja uma fotovelavel mínima da amostra. </li><li> Use software de imagem compatível com o formato do arquivo de gravação para visualizar e analisar os dados. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Deve-se notar que a potência total do laser varia entre os sistemas. No entanto, o uso de porcentagem de fotoblocos GFP permite uma leitura da energia total entregue ao rim fluorescente, independente da variação na potência do laser e compensada pelo período de exposição. Tenha em mente, no entanto, que a resposta de diferentes tecidos a este método de fotoablação varia. Mesmo durante a maturação do rim, é significativamente mais difícil obter uma redução de 50% na fluorescência de GFP em embriões mais...

Lesão renal aguda (LRA) 1 , 2 , que também pode ser referida como insuficiência renal aguda, é amplamente definida como uma deficiência súbita na função renal 3 . Embora o nível de compreensão desta condição tenha sido melhorado notavelmente ao longo dos anos, as taxas de morbidade e mortalidade permaneceram altas 1 , 2 . O tratamento atual para esta condição é principalmente solidário, já que os resultados de vários ensaios clínicos de terapia medicamentosa foram negativos 4 , 5 . O rim é único, pois tem a capacidade de se reparar. Portanto, a terapia de suporte após um diagnóstico precoce da IRA é a melhor maneira de limitar a morbidade 6 . No entanto, é difícil detectar a IRA precoce e a taxa de mortalidade é um escalonamento de 50-80% para aqueles que necessitam de diálise 5. Com a capacidade dos rins para reparar e a falta de opções de tratamento para esta condição, é importante desenvolver métodos para melhorar este processo de regeneração de néphron. Houve muitos modelos diferentes utilizados para pesquisa de AKI que inclui diferentes agentes de lesões e modelos de animais. Em termos de agentes de danos nos rins, o antibiótico gentamicina aminoglicosídeo tem sido utilizado como agente nefrotóxico que leva a AKI 7 , 8 . No entanto, vários grupos descobriram que o tratamento com gentamicina é letal para o embrião de peixe-zebra 9 . Causa dano tubular muito grave para a recuperação do embrião, dificultando o estudo da regeneração sem algum tipo de intervenção. Os modelos de mamíferos, como o rato e o rato, também são considerados valiosos, mas enfrentam muitas limitações durante o estudo da IRA. Talvez a principal desvantagem dos modelos de roedores seja a dificuldade em visuaLizing o rim dos roedores e, assim, determinando os processos espaciotemporais precisos que levam à morte epitelial e ao reparo. Johnson et al. Relataram uma técnica baseada em ablação a laser para induzir lesão renal aguda em peixe zebra embrionário e larval 9 . Eles usaram ablação a laser pulsada para danificar o rim após uma injeção intramuscular com conjugados de dextrano. A fluorescência dos conjugados de dextrano permite a visualização de dano e regeneração no epitélio tubular 9 . Este modelo supera as duas limitações mencionadas acima, mas não permite níveis graduados de lesão e é difícil de realizar em grandes grupos de células arbitrárias. O novo modelo de AKI, descrito em ablação a laser, descrito aqui aborda todas as limitações acima. O rim pronefrico no peixe zebra larval é um órgão maduro e funcional que contém segmentos similares à nebulosa de mamíferoPhron, incluindo um glomérulo, túbulos proximais e distal, e um ducto colector 10 . As larvas de zebrafish também são opticamente transparentes, tornando possível observar o rim através de técnicas de fluorescência. Assim, o peixe-zebra é um valioso modelo in vivo de IRA, e o rim pronefrico larval (5-12 dias após a fertilização (dpf)) pode ser usado para estudar os processos celulares e moleculares envolvidos em lesão renal e reparação. Este artigo apresenta um método através do qual os segmentos de Nephron específicos de proteína fluorescente verde (GFP) podem ser fotoablados usando uma luz laser violeta de baixa energia (em comparação com um sistema de laser pulsado) (405 nm). A fluorescência GFP permite a segmentação de um grupo de células, tornando as mudanças que se tornam visíveis através da observação do fotobloco GFP. Além disso, o GFP (absorvendo a luz violeta) serve como um coletor de energia para potencializar a lesão em células renais que expressam GFP. Microfones de lapso de tempoA cópia pode então ser usada para estudar o processo de reparo. Estudos têm encontrado proliferação celular, migração celular e metaplasia celular 11 , 12 , 13 para todos ser processos potenciais que podem desempenhar um papel importante na reparação renal. No entanto, a importância relativa desses processos e os detalhes de sua interação foram difíceis de descobrir devido às limitações dos modelos existentes de AKI. Usando essa abordagem inovadora, foi possível mostrar que a migração celular desempenha um papel central no reparo renal após lesão aguda 14 .

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

Lesão renal aguda (LRA) é uma condição médica comum com alta taxa de mortalidade. Com as habilidades de reparo do rim, é possível restaurar a função renal adequada após o tratamento de suporte. No entanto, é necessária uma melhor compreensão de como ocorre morte e reparação de células nefronas no nível celular para minimizar a morte celular e melhorar o processo regenerativo. O pronephros do peixe-zebra é um bom sistema modelo para atingir esse objetivo, pois contém segmentos anatômicos que são semelhantes à nefrona dos mamíferos. Anteriormente, o modelo mais comum usado para estudar lesão renal em peixes era o modelo farmacológico de gentamicina. No entanto, este modelo não permite um controle espaciotemporal preciso da lesão e, portanto, é difícil estudar os processos celulares e moleculares envolvidos no reparo renal. Para superar esta limitação, este trabalho apresenta um método através do qual, em contraste com a abordagem gentamicina, uma Proteína Fuorescente Verde específica (GFP) -exPressionar o segmento nephron pode ser fotoablado usando uma luz laser violeta (405 nm). Este novo modelo de AKI oferece muitas vantagens que outros métodos de lesão epitelial não possuem. Suas principais vantagens são a capacidade de &quot;marcar&quot; o nível de lesão e o controle espaciotemporal preciso no modelo robusto animal in vivo . Este novo método tem potencial para avançar significativamente o nível de compreensão dos mecanismos de lesão renal e reparação.

Observe que este protocolo foi usado com sucesso com várias linhas transgênicas de GFP renal, incluindo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 e Tg (atp1a1a.4: GFP). Os exemplos de resultados apresentados aqui foram obtidos usando a linha ET (krt8: EGFP) sqet11-9. A Figura 1 mostra o exemplo de protocolo de fotoablação. A intensidade média de GFP é monitorada dentro da região ...

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Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Este trabalho apresenta um novo modelo in vivo de lesão renal segmentar usando peixe zebra transgênico GFP renal. O modelo permite a indução da ablação direcionada de células epiteliais renais para mostrar os mecanismos celulares de lesão e reparação de néphron.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K visualizações.  NYITCOM.  Este trabalho apresenta um novo modelo in vivo de lesão renal segmentar usando peixe zebra transgênico GFP renal. O modelo permite a indução da ablação direcionada de células epiteliais renais para mostrar os mecanismos celulares de lesão e reparação de néphron. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Microinjeção intravenosa de nefrotoxinas em embrião de peixe-zebra: uma técnica para administrar agentes nefrotóxicos na corrente sanguínea de embriões de peixe-zebra

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...