نود أن نشكر الدكتور إيان دروموند والدكتور فلاديمير كورز لتقاسم خطوط غفب الكلى المعدلة وراثيا. ونود أيضا أن نشكر نيتكوم على توفير الموارد اللازمة للقيام بهذا العمل. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من المنح: K08DK082782، R03DK097443 (نيه)، والمنحة التجريبية هسي (أف).

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها في المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل كلية نيت كلية الطب العظمي المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (نيتكوم إاكوك). وأجريت جميع العمليات الجراحية والتجريب في الجسم الحي تحت التخدير تريكين، وبذلت كل الجهود للحد من المعاناة. 1. الحصول على الأجنة والحفاظ عليها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الأجنة عن طريق عبور الكلى غفب الفلورسنت الزرد. ملاحظة: وترد أمثلة من خطوط المعدلة وراثيا الزرد فلورزنتلي المسمى في الجدول 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأجنة في 28.5 درجة مئوية في حل E3 خلال 24 ساعة بعد الإخصاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، استبدل الوسط بمحلول E3 يحتوي على 0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (بتو). ملاحظة: يستخدم بتو لأنه يمنع الخطوات التي تعتمد على التيروزيناز في الميلانوجينيسوبالتالي يمنع تصبغ. هنا، يشار إلى هذا الحل باسم E3-بتو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة المخصبة في 28.5 درجة مئوية حتى هم&gt; 6 دبف، عند هذه النقطة قد نضجت الكلى. ملاحظة: من الأفضل استخدام اليرقات في النافذة 7-9 دبف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر تشريح الفلورسنت في 40X التكبير والمرشحات الانبعاثات مضان الخضراء، حدد اليرقات مع مشرق الكلى غفب مضان. </li></ol> 2. تركيب الزرد لايف التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا فوتوابلاتينغ الأجنة قبل 3 دبف، إزالة المشيماء من أي الزرد لم يسبق لها مثيل قبل تركيب الزرد للتصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدويا ديكورينات مع ملقط (المفضل) أو استخدام العلاج الكيميائي مع خليط البروتياز. ملاحظة: ديستوريناتيون يسمح لأفضل نتائج التصوير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الحطام المشيماء في طبق بتري باستخدام حل E3-بتو وإعادة ملء الطبق مع E3-بتو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعداداتإعادة 1-2٪ نقطة انصهار منخفضة (لمب) الاغاروز مع 0.2 ملغ / مل حل تريكين لتركيب الزرد ل فوتوابلاتيون الكلى والتصوير الحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تحضير الاغاروز لمب مسبقا مسبقا، تسخينه في الميكروويف لإذابة عليه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إعداد الاغاروز لمب، وضع 35 ملم طبق بتري البلاستيك على المجهر تشريح. وضع مسبار الزجاج سحبت القريبة لتوجيه بشكل صحيح اليرقات تخدير. ملاحظة: من المهم أن تفعل هذه الخطوة في الوقت المناسب وأن يكون كل شيء في مكان، لأن الأجنة يجب أن تكون موجهة قبل الاغاروز يتصاعد في حوالي 1-3 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل نقل الجنين إلى الاغاروز، تأكد من أن الاغاروز هو بارد ( أي في حوالي درجة حرارة الجسم). استخدام ماصة نقل البلاستيك أو الزجاج لوضع الجنين في تبريد أسفل ذاب حل الاغاروز تريكين. ملاحظة: يتم ذلك لأن الاغاروز التي حار جدا يمكن أن تكون ضارة للجنين، مما يؤدي إلى السكتة القلبيةأو الوفاة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل، إعادة رسم الجنين في حل الاغاروز وموقف الجنين / يرقة في منتصف طبق 35 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتشار بسرعة الاغاروز التي تحتوي على الجنين / يرقة لتغطية بالتساوي الجزء السفلي من طبق 35 مم. أفضل حجم من الاغاروز للاستخدام ~ 1-1.1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مسبار الزجاج لتوجيه الجنين في أفضل موقف ممكن ل فوتوابلاتيون والتصوير. ملاحظة: الفيلم 1 يظهر أفضل اتجاه الجنين / يرقات ل فوتوابلاتيون من جانب واحد. هذه الخطوة هي الأكثر حساسية للوقت ويجب أن يتم بسرعة قبل الاغاروز يبدأ هلام، كما أن أي محاولة لإعادة توجيه الأسماك بعد بدء التبلور هو ضار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه اليرقة بحيث قطاع الكلى من الفائدة هو عمودي على مسار شعاع في حين أن الجزء المقابل هو بعيدا عن شعاع الليزر (انظر الفيلم 1 ). ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحويل اليرقة كما هو مبين في الفيلم 1 . </lط&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح حوالي 15 دقيقة لالأغاروز لتصلب. تغطية طبق بتري للحد من التبخر. مرة واحدة وقد عززت الاغاروز، الجنين أو اليرقة مستعدة ل فوتوابلاتيون. </li></ol> 3. الليزر الاجتثاث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل نظام التصوير مبائر. ملاحظة: عند استخدام منصة التصوير المشار إليها (انظر جدول المواد)، وتشمل الإعدادات الموصى بها 40X التكبير، 0.8 نا غمس عدسة المياه، والمرآة مزدوج اللون الأول مجموعة للسماح كل من 488 و 405 نانومتر إضاءة العينة. وينبغي إجراء الكشف على القناة الخضراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق يحتوي على الزرد يجمد على مرحلة مبائر. ملاحظة: هذا الإجراء هو الأمثل لتكوين تستقيم باستخدام 40-60X عدسة غمس المياه. ومع ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن تعديل الإجراء للمجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التكوين تستقيم، ووضع طبق بتري تحتوي على الجنين على رأس المجهرأوب، والحفاظ عليها في مكانها باستخدام الطين النمذجة (على سبيل المثال، البلاستيسين). وضع الشريحة الزجاجية مع طبق بتري على مرحلة المجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل من حل التصوير E3-بتو (انظر الخطوة 1.3) مع 0.2 ملغ / مل تريكين. ملاحظة: ويمكن أيضا أن يضاف حل التصوير على الفور قبل وضع الشريحة على خشبة المسرح. وينبغي أن يتم إضافة حل التصوير بعناية فائقة لمنع الاغاروز من العائمة قبالة الجزء السفلي من الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى عدسة غمس المياه (40 أو 60X). ببطء رفع المرحلة، والتأكد من أن العدسة زوايا قليلا لمنع الهواء من أن تصبح محاصرين في مسار شعاع. وبمجرد أن تلمس العدسة الحل في زاوية، مركز ذلك بحيث يكون في مجال الرؤية من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على شريحة من الفائدة باستخدام مصدر ضوء مضان. سوبيرفيسيالي موقف الفرع المستهدفة للإصابة لتقليل تشتت الضوء (انظر الفيلم 1 ). ملاحظة: ذي سوبلوسنt استخدام الخطوات من البرمجيات المشار إليها (انظر جدول المواد)، ولكن الإجراء يمكن تكييفها بسهولة لمنصات أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج. انتقل إلى &quot;عرض&quot; | &quot;التحكم في الاستحواذ&quot; | &quot;C2plus واجهة المستخدم الرسومية المدمجة&quot; وضبط &quot;بكسل الوقت يسكن&quot; إلى &quot;1.9 μs،&quot; &quot;حجم الإطار&quot; إلى &quot;512 × 512 بكسل&quot;، و &quot;حجم الثقب&quot; إلى &quot;90 ميكرون&quot;. مجموعة &quot;405 نانومتر (أو 408 نانومتر في بعض النظم) كثافة الليزر&quot; إلى الصفر و &quot;488 كثافة الليزر&quot; إلى &quot;منخفضة&quot; (ويفضل &lt;1٪). ضبط &quot;كسب&quot; للحصول على مجموعة ديناميكية جيدة ولكن ليس لتشبع إشارة. ملاحظة: هذه القيم ليست حاسمة ويتم استخدامها للاتساق. عندما يتم استخدام ليزر 405 نانومتر، وسوف يؤدي إلى زيادات في مضان غفب. ولتجنب تشبع الإشارة أثناء فوتوبلاشينغ (الخطوة 3.11)، ينبغي خفض قيمة كسب الإشارة إلى القناة الخضراء. ويمكن ترك كسب القناة الزرقاء عند الصفر، حيث أنه لا يستخدم في ساmpling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;مسح&quot; في واجهة البرنامج لمسح الكلى باستخدام الليزر 488 نانومتر. العثور على شريحة من الفائدة التي عمودي على مسار شعاع وهذا هو تصور جيد، مع جيدة مضان غفب. وبمجرد تحديد هذه المنطقة، رسم منطقة ذات فائدة باستخدام منطقة بيضاوي الشكل من الفائدة (روي). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;عائد الاستثمار&quot; | &quot;رسم العائد على الاستثمار الإهليلجي&quot;. ملاحظة: سيتم استخدام هذا لقياس مستمر كثافة غفب في حين أن فوتوبلاشينغ يحدث، مما يسمح لإدارة جرعة دقيقة من العلاج بالليزر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;عرض&quot; | &quot;عناصر التحكم في الاستحواذ&quot; | &quot;C2plus سكان أريا&quot; واختر &quot;باند سكان أريا&quot;. سوف يظهر قناع مستطيلة داخل تلك الواجهة. يدويا تحديد إطار مسح مستطيلة باستخدام المؤشر ( أي السحب، تغيير الحجم، وتحويل القناع) لتغطية الجزء المستهدف للتذرية الليزر. انقر بزر الماوس الأيمن داخلمنطقة قناع لقبول الاختيار. ملاحظة: سيتم مسح المنطقة المحددة فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء قياس الوقت أثناء مراقبة القناة الخضراء فقط باستخدام الليزر 488 نانومتر لتنشيط غفب. تأكد من أن شدة الليزر 488 منخفضة نسبيا (~ 1٪). قياس متوسط ​​كثافة غفب في المنطقة ذات الاهتمام عن طريق اختيار &quot;قياس&quot; | &quot;قياس الوقت&quot;. استخدم علامات التبويب &quot;الرسم البياني&quot; أو &quot;البيانات&quot; لمراقبة قيم الشدة المتوسطة ضمن عائد الاستثمار. ملاحظة: يتم تعريف معدل الاستحواذ من قبل بكسل يسكن الوقت وحجم نافذة مستطيلة المنصوص عليها في الخطوة 3.9، ولكن بشكل عام، فإنه يسمح للرصد السريع للإشارة (~ 2-10 إطارات / ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسبب الضرر إلى خلايا الكلى مع الليزر البنفسجي (405 نانومتر) عن طريق زيادة شدة إلى 100٪ عن طريق تحريك &quot;قوة الليزر&quot; السيطرة على طول الطريق إلى اليمين. الليزر 488 نانومتر يمكن أن تبقى نشطة إذا كانت شدة منخفضة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة خط gالجراف باستخدام علامة التبويب &quot;الرسم البياني&quot; أو القيم العددية لشدة غفب باستخدام علامة التبويب &quot;البيانات&quot; وانتظر حتى ينخفض ​​إلى المستوى المطلوب، على سبيل المثال 50٪ من خط الأساس (كما هو مبين في الشكل 1 ). ملاحظة: تم استخدام ليزر 20 ميغاواط كجزء من وحدة ليزر المشار إليها (انظر جدول المواد )؛ قد تختلف الشدة القصوى بين الأنظمة. يمكن تعويض كثافة أقل عن طريق التعرض لفترة أطول ( أي باستخدام نسبة مئوية تبييض غفب كمقياس للتعرض الكلي). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن انخفضت كثافة غفب داخل العائد على الاستثمار بيضاوي الشكل (الخطوة 3.8) إلى المستوى المطلوب، على الفور خفض شدة البنفسجي (405 نانومتر) ليزر إلى &quot;0&quot; عن طريق تحريك شريط &quot;قوة الليزر&quot; المنزلق على طول الطريق إلى اليسار في لوحة التحكم البرمجيات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على خط أساس جديد من مضان غفب. تأكيد الاجتثاث من خلال الحصول على نسبة من X / Y. ملاحظة: انظر الشكل1B؛ Y = متوسط ​​الكثافة قبل الاجتثاث و X = متوسط ​​الكثافة بعد الاجتثاث، وذلك باستخدام متوسط ​​4 عينات متتالية داخل عائد الاستثمار. نسبة الهدف المحدد (50٪، 60٪، الخ ) يعتمد على مقدار الإصابة المرغوب فيها لتجربة معينة. </li></ol></li></ol> 4. الوقت الفاصل بين المجهري مع بروبيديوم يوديد تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق اعتبارات الفاصل الزمني العامة (المبينة في دراسة سابقة 15 ) لتصور تلطيخ يوديد بروبيديوم كعلاقة من إصابة خلية الكلى بعد فوتوابلاتيون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل احتضان اليرقات في 30 ميكرومتر محلول يوديد بروبيديوم (1٪ دمسو في E3-بتو) لمدة 3 ساعات قبل التضمين و فوتوابلاتيون، كما هو موضح في الخطوات 2 و 3.7، على التوالي. ملاحظة: لا يتطلب أي يوديد بروبيديوم إضافية في الاغاروز أو حل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسبب إصابة الكلى القطاعية، كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مداخن صورة الفاصل الزمني، كما وصفسرير في دراسة سابقة 14 ، وذلك باستخدام ليزر 488 نانومتر (غفب) وليزر 461 نانومتر (بروبيديوم يوديد، بي). ملاحظة: يتم فرضه لونين في مداخن مبائر لربط اختفاء غفب ومظهر تلطيخ يوديد بروبيديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات للحصول على مداخن صورة الفاصل الزمني على النحو التالي: شريحة شريحة الظاهري = 4 ميكرون، z- الفاصل الزمني = 2 ميكرون، بكسل الوقت يسكن = 1.9 μs، أبعاد الصورة = 512 × 512، ومتوسط ​​= 2. ملاحظة: تسمح هذه المعلمات لمواصلة، 10-15 دقيقة تسجيل الفاصلة تصل إلى 4 اليرقات والتأكد من أن هناك فوتوبلاشينغ الحد الأدنى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برامج التصوير متوافق مع تنسيق ملف التسجيل لتصور وتحليل البيانات. </li></ol>

<ol>
	<li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury,+Mortality,+Length+of+Stay,+And+Costs+In+Hospitalized+Patients.">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan.">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li><li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury.">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li><li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury.">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li><li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis.">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).</li><li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+Acute+Kidney+Injury.">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li><li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish:+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease.">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration.">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li><li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis.">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li><li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen,+Vimentin,+C-Fos,+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments,+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells.">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure.">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li><li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury.">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).</li><li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish.">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li><li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development:+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+.">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li><li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity.">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li><li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene.">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).</li><li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

وتجدر الإشارة إلى أن قوة الليزر الإجمالية تختلف بين النظم. ومع ذلك، باستخدام النسبة المئوية غفب فوتوبلاشينغ يسمح لقراءة من إجمالي الطاقة تسليمها إلى الكلى الفلورسنت، مستقلة عن الاختلاف في قوة الليزر وتعويض عن طول التعرض. نضع في اعتبارنا، ومع ذلك، أن استجابة الأنسجة...

إصابة الكلى الحادة (أكي) 1 ، 2 ، والتي يمكن أيضا أن يشار إليها بالفشل الكلوي الحاد، يتم تعريفها على نطاق واسع بأنها ضعف مفاجئ في وظائف الكلى 3 . في حين أن مستوى فهم هذا الشرط قد تعزز بشكل ملحوظ على مر السنين، ظلت معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة 1 ، 2 . العلاج الحالي لهذه الحالة هو في الغالب داعمة، كما كانت نتيجة التجارب السريرية متعددة من العلاج بالعقاقير السلبية 4 ، 5 . الكلى هي فريدة من نوعها في أن لديها القدرة على إصلاح نفسها. لذلك، العلاج الداعم بعد التشخيص المبكر لل أكي هو أفضل وسيلة للحد من الاعتلال 6 . ومع ذلك، فإنه من الصعب الكشف عن أكي في وقت مبكر، ومعدل الوفيات هو مذهل 50-80٪ لأولئك الذين يحتاجون إلى غسيل الكلى 5. مع قدرة الكلى على إصلاح أنفسهم وعدم وجود خيارات العلاج لهذا الشرط، فمن المهم لتطوير أساليب لتعزيز هذه العملية تجديد نيفرون. كانت هناك العديد من النماذج المختلفة المستخدمة لأبحاث أكي التي تشمل عوامل مختلفة للإصابة والنماذج الحيوانية. من حيث وكلاء تلف الكلى، وقد استخدم جينتاميسين المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد كعامل كلوي يؤدي إلى أكي 7 ، 8 . ومع ذلك، وجدت عدة مجموعات أن العلاج الجنتاميسين هو قاتلة إلى الجنين الزرد 9 . أنه يسبب الضرر أنبوبي الذي هو خطير جدا لاستعادة الجنين، مما يجعل دراسة تجديد صعبة من دون نوع من التدخل. وتعتبر نماذج الثدييات، مثل الفئران والفئران، قيمة أيضا، ولكنها تواجه العديد من القيود أثناء دراسة أكي. ولعل العيب الرئيسي لنماذج القوارض هو صعوبة فيسواليزينغ الكلى القوارض وبالتالي تحديد العمليات المكانية الزمانية دقيقة مما يؤدي إلى الموت الظهاري وإصلاح. جونسون وآخرون. قد ذكرت تقنية القائم على التذرية الليزر للحث على إصابة الكلى الحادة في الزرد الجنينية واليرقات 9 . واستخدموا التذرية الليزر نابض لتلف الكلى بعد الحقن العضلي مع تقارن ديكستران. مضان من يقارن ديكستران يسمح لتصور الضرر وتجديد في ظهارة نبيب 9 . هذا النموذج يتغلب على اثنين من القيود المذكورة أعلاه، لكنه لا يسمح لمستويات متدرجة من الاصابة ويصعب القيام بها على مجموعات الخلايا التعسفية الكبيرة. نموذج الزرد القائم على الاجتثاث الليزر الجديد من أكي وصفها هنا يتناول كل القيود المذكورة أعلاه. إن الكلى الليمونية في الزرد اليرقي هي ناضجة، وهي الجهاز الذي يحتوي على شرائح مشابهة للثدييات نفرون، بما في ذلك الكبيبات، والأنابيب القريبة والقاصية، وقناة تجميع 10 . اليرقات الزرد هي أيضا شفافة بصريا، مما يجعل من الممكن لمراقبة الكلى من خلال تقنيات مضان. وهكذا، الزرد هي قيمة في نموذج الجسم الحي من أكي، والكلى اليرقات الليمون (5-12 يوما بعد التسميد (دبف) يمكن استخدامها لدراسة العمليات الخلوية والجزيئية المعنية في إصابة الكلى وإصلاح. تعرض هذه الورقة طريقة يمكن من خلالها تصوير بروتينات الفلورسنت الأخضر (غفب) محددة، بقطع نفرون باستخدام طاقة منخفضة (بالمقارنة مع نظام ليزر نابض) ضوء الليزر البنفسجي (405 نانومتر). و غفب مضان يسمح لاستهداف مجموعة من الخلايا، مما يجعل التغييرات التي تحدث مرئية من خلال مراقبة فوتوبلاشينغ غفب. وبالإضافة إلى ذلك، غفب (عن طريق امتصاص الضوء البنفسجي) بمثابة بالوعة الطاقة لتحفيز الإصابة في غفب معربا عن خلايا الكلى. الفاصل الزمني الفاصل بين الوقتثم يمكن استخدام نسخة لدراسة عملية الإصلاح. وقد وجدت الدراسات تكاثر الخلايا، وهجرة الخلايا، وحؤول الخلايا 11 ، 12 ، 13 إلى أن تكون العمليات المحتملة التي قد تلعب دورا هاما في إصلاح الكلى. ومع ذلك، فإن الأهمية النسبية لهذه العمليات وتفاصيل تفاعلها كان من الصعب كشف بسبب القيود المفروضة على النماذج الحالية من أكي. باستخدام هذا النهج الرواية، كان من الممكن أن تظهر أن الهجرة الخلية تلعب دورا رئيسيا في إصلاح الكلى بعد إصابة حادة 14 .

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

إصابة الكلى الحاد (أكي) هو حالة طبية شائعة مع ارتفاع معدل الوفيات. مع قدرات إصلاح الكلى، فمن الممكن لاستعادة وظائف الكلى الكافية بعد العلاج الداعم. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم أفضل لكيفية موت الخلايا نيفرون وإصلاح على المستوى الخلوي للحد من موت الخلايا وتعزيز عملية التجدد. و برونيفروس الزرد هو نظام نموذج جيد لتحقيق هذا الهدف لأنه يحتوي على شرائح التشريحية التي تشبه نفرون الثدييات. في السابق، كان النموذج الأكثر شيوعا لدراسة إصابة الكلى في الأسماك نموذج جنتاميسين الدوائية. ومع ذلك، فإن هذا النموذج لا يسمح للسيطرة الزمانية الزمانية دقيقة من الإصابة، وبالتالي فمن الصعب دراسة العمليات الخلوية والجزيئية المعنية في إصلاح الكلى. للتغلب على هذا القيد، يعرض هذا العمل طريقة يمكن من خلالها، على النقيض من النهج جنتاميسين، بروتين أخضر فوريسنت محددة (غفب) -exوالضغط على جزء نيفرون يمكن تصويرها باستخدام ضوء الليزر البنفسجي (405 نانومتر). هذا النموذج الرواية من أكي يوفر العديد من المزايا التي أساليب أخرى من الإصابة الظهارية تفتقر. مزاياه الرئيسية هي القدرة على &quot;الاتصال الهاتفي&quot; مستوى الإصابة والتحكم الزماني الزماني الدقيق في قوية في نموذج الحيوان الحي . هذه الطريقة الجديدة لديها القدرة على تحقيق تقدم كبير في مستوى فهم إصابات الكلى وآليات إصلاح.

يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول استخدمت بنجاح مع عدد من الخطوط المعدلة وراثيا غفب الكلى، بما في ذلك إت (krt8: إغف) sqet11-9، إت (krt8: إغف) sqet33-d10، و تغ (atp1a1a.4: غفب). تم الحصول على نتائج المثال الموضح هنا باستخدام خط إت (krt8: إغف) sqet11-9. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

يعرض هذا العمل الجديد في نموذج الجسم الحي من إصابة الكلى القطعي باستخدام الكلى غفب المعدلة وراثيا الزرد. نموذج يسمح لتحريض الاجتثاث المستهدفة من الخلايا الظهارية الكلى لإظهار الآليات الخلوية للإصابة نيفرون وإصلاح.

دقة الخلوية طريقة الاجتثاث لنمذجة إصابة الكلى الحادة في تطوير الزرد

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  NYITCOM.  يعرض هذا العمل الجديد في نموذج الجسم الحي من إصابة الكلى القطعي باستخدام الكلى غفب المعدلة وراثيا الزرد. نموذج يسمح لتحريض الاجتثاث المستهدفة من الخلايا الظهارية الكلى لإظهار الآليات الخلوية للإصابة نيفرون وإصلاح. 

Video: Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biology

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

نموذج إصابة الكلى الحادة الناجمة عن سيسبلاتين في حمار وحشي الكبار

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicine

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

الحقن المجهري للسموم الكلوية في الوريد في جنين الزرد: تقنية لتوصيل العوامل السامة للكلية إلى مجرى الدم لجنين الزرد

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...