腎臓のGFPトランスジェニック系統を共有してくださったIain Drummond博士とVladimir Korzh博士に感謝したいと思います。 NYITCOMにもこの作業を行うために必要なリソースを提供していただき、ありがとうございます。この研究の一部は、K08DK082782、R03DK097443（NIH）、およびHSCIパイロットグラント（AV）の助成金によって一部サポートされました。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドの勧告に従って実施された。このプロトコルは、NYITCOMのOsteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee（NYITCOM IACUC）によって承認されました。全ての手術および生体内実験は、トリカイン麻酔下で実施され、苦痛を最小限に抑えるためにすべての努力がなされた。 1.胚の入手と維持<ol><li>腎臓のGFP蛍光ゼブラフィッシュを横切って胚を得る。 注：蛍光標識ゼブラフィッシュトランスジェニック系の例を表1に示す 。 </li><li>受精後24時間にE3溶液に28.5℃で胚を保つ。 </li><li> 24時間後、培地を0.003％1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を含有するE3溶液と交換する。 注：メラニン形成におけるチロシナーゼ依存性のステップをブロックするため、PTUを使用する色素沈着を防止する。ここでは、この解決策をE3-PTUと呼ぶ。 </li><li>受精した胚を28.5°Cで6 dpf以上になるまで上げます。その時点で腎臓は成熟しています。 注：7-9 dpfウィンドウでは幼虫を使用することをお勧めします。 </li><li> 40倍の倍率および緑色蛍光発光フィルターで蛍光解剖顕微鏡を使用して、明るい腎臓GFP蛍光を有する幼虫を選択する。 </li></ol> 2.ライブイメージングのためのZebrafishのマウント<ol><li> 3 dpfの前に胚を光化する場合、画像化のためにゼブラフィッシュをマウントする前に、孵化していないゼブラフィッシュから絨毛膜を除去する。 <ol><li>手動で鉗子で脱着（推奨）するか、プロテアーゼ混合物で化学的処理をしてください。 注記：デコレーションにより、最良のイメージング結果が得られます。 </li></ol></li><li> E3-PTU溶液を用いてペトリ皿中の絨毛の破片を洗い流し、E3-PTUで皿を補充する。 </li><li> プレパ0.2 mg / mLのトリカイン溶液を含む1-2％低融点（LMP）アガロースでゼブラフィッシュを腎臓光切除およびライブイメージングにマウントします。 <ol><li>予めLMPアガロースが調製されている場合は、マイクロ波で再加熱して溶解します。 </li></ol></li><li> LMPアガロースが調製されたら、解剖顕微鏡上に35mmのプラスチックシャーレを置く。麻酔した幼虫を適切に方向付けるために、引っ張ったガラスプローブを近くに置く。 注：アガロースが約1〜3分で凝固する前に胚を配向させなければならないので、適時にこのステップを行い、すべてを整えることが重要です。 </li><li>胚をアガロースに移す前に、アガロースが冷えていることを確認してください（体温付近）。プラスチックまたはガラス転移ピペットを使用して、冷却した溶かしたアガロース - トリカイン溶液に胚を入れる。 注：これは、あまりにも高温のアガロースが胚に有害であり、心停止を引き起こす可能性があるために行われますまたは死</li><li>トランスファーピペットを使用して、アガロース溶液中の胚を再描画し、胚/幼虫を35mmディッシュの中央に配置する。 </li><li>胚/幼虫を含むアガロースを迅速に広げ、35mmの皿の底を均一に覆う。使用するアガロースの最善の量は~1.1mLである。 </li><li> ガラスプローブを使用して、胚を光切除および画像化のための最良の位置に向ける。 注：映画1は、片側光切除のための胚/幼虫の最良の向きを示す。このステップは、最も時間に敏感であり、ゲル化開始後に魚を再指向させる試みは有害であるため、アガロースがゲル化し始める前に迅速に実施されるべきである。 <ol><li>関心のある腎臓セグメントが、対側の部分がレーザービームから離れている間に、ビーム経路に対して垂直になるように幼虫を向ける（ 映画1参照）。 注：これはムービー1のように幼虫を回すことで実現できます。 </li&gt; </ol></li><li>アガロースが凝固するのに約15分を要する。ペトリ皿を覆って蒸発を最小限に抑えます。アガロースが凝固すると、胚または幼虫は光切除の準備が整う。 </li></ol>レーザーアブレーション<ol><li>共焦点イメージングシステムを操作する。 注記：参照画像プラットフォーム（材料の表を参照）を使用する場合、40倍の倍率、0.8 NA水浸レンズ、およびサンプルの488および405 nm照明の両方を可能にする第1のダイクロイックミラーセットが推奨設定に含まれます。検出はグリーンチャネルで実行する必要があります。 </li><li>固定化ゼブラフィッシュを含むディッシュを共焦点ステージ上に置く。 注：この手順は、40〜60倍の水浸レンズを使用した直立構成に最適です。しかしながら、倒立顕微鏡の手順を変更することは可能であるべきである。 </li><li>直立構成では、胚を含むペトリ皿を顕微鏡の上に配置するモデリングクレイ（ 例えば、プラシーネ）を使用して、その場所にスライドさせて保持してください。ペトリ皿でガラススライドを共焦点顕微鏡のステージ上に置く。 </li><li> 0.2mg / mLのトリカインを用いて3mLのイメージング溶液E3-PTU（工程1.3参照）を加える。 注：スライドをステージ上に置く直前にイメージングソリューションを追加することもできます。イメージング溶液の添加は、アガロースが皿の底から浮かぶのを防ぐために非常に慎重に行わなければならない。 </li><li>水浸レンズ（40または60X）に切り替えます。ゆっくりとステージを上げ、空気がビーム経路に閉じ込められないようにレンズがわずかに傾いていることを確認します。レンズがある角度で溶液に触れたら、それが胚の視野に入るように中心に置く。 </li><li>蛍光光源を使用して目的のセグメントを見つけます。光散乱を最小限に抑えるために、怪我の対象となる支店を表面的に配置します（ 映画1を参照）。 注：サブシーケンサーtステップでは参照ソフトウェア（表の表を参照）を使用しますが、この手順は他のプラットフォームにも容易に適用できます。 </li><li>ソフトウェアを開きます。 「表示」| &quot;獲得コントロール&quot; | 「C2plus Compact GUI」に設定し、「ピクセル滞留時間」を「1.9μs」、「フレームサイズ」を「512x512ピクセル」、「ピンホールサイズ」を「90μm」に設定します。 「405nm（またはいくつかのシステムでは408nm）レーザー強度」をゼロに、「488レーザー強度」を「低」（好ましくは1％未満）に設定します。良好なダイナミックレンジを得るために「ゲイン」を調整しますが、信号を飽和させないように調整してください。 注：これらの値は重要ではなく、一貫性のために使用されます。 405 nmレーザーを使用すると、GFP蛍光が増加します。光退色（ステップ3.11）中の信号の飽和を避けるために、信号利得値は緑チャネル上で縮小されるべきである。青色チャネル利得は、saには使用されないので、ゼロのままにすることができますmpling。 </li><li> 488 nmレーザーを使用して腎臓をスキャンするには、ソフトウェアインターフェイスで[スキャン]をクリックします。ビーム経路に垂直で、良好なGFP蛍光を伴ってよく視覚化されている関心のあるセグメントを見つけます。その領域が特定されたら、楕円形のRegion-of-Interest（ROI）を使用して関心領域を描画します。 <ol><li> &quot;ROI&quot;に移動| 「楕円ROIを描く」 注：これは、光退色が起こっている間に平均GFP強度を連続的に測定するために使用され、正確な線量のレーザー治療の投与を可能にする。 </li></ol></li><li> 「表示」| &quot;獲得コントロール&quot; | &quot;C2plus Scan Area&quot;を選択し、 &quot;Band Scan Area&quot;を選択します。長方形のマスクがそのインターフェイス内に表示されます。レーザーアブレーションの対象となるセグメントをカバーするために、カーソルを使用して長方形のスキャンウィンドウを手動で定義します（ つまり 、マスクのドラッグ、サイズ変更、回転）。右クリックしてマスク領域を使用して選択を受け入れます。 注記：選択したリージョンのみがスキャンされます。 </li><li>緑色チャンネルを監視しながら、488 nmレーザーを使用してGFPを起動しながら時間測定を開始します。 488レーザーの強度が比較的低い（〜1％）ことを確認します。 &quot;Measure&quot;を選択することにより、関心領域内のGFPの平均強度を測定する。 「時間測定」 [グラフ]タブまたは[データ]タブを使用して、ROI内の平均強度値を監視します。 注：取得速度は、ピクセルドウェル時間とステップ3.9で設定された長方形ウィンドウのサイズによって定義されますが、一般的に、信号の高速監視（約2〜10フレーム/秒）が可能です。 </li><li> 「レーザーパワー」コントロールを右端にずらして強度を100％に増やし、バイオレットレーザー（405nm）で腎臓細胞を損傷させます。強度が低い場合、488 nmレーザーはアクティブのままです。 <ol><li>線gを観察する「グラフ」タブを使用するか、「データ」タブを使用してGFP強度の数値を使用し、所望のレベル、例えばベースラインの50％（ 図1に示す ）まで低下するのを待ちます。 注記：20mWレーザーは、参照レーザーユニットの一部として使用されています（材料表を参照 ）。最大強度はシステムによって異なることがある。より低い強度は、より長時間の暴露（ すなわち 、総暴露の尺度としてのパーセントGFP漂白を用いる）によって補うことができる。 </li></ol></li><li> 楕円ROI内のGFP強度（ステップ3.8）が所望のレベルに低下したら、「レーザー出力」スライダを左にずっと移動させることによって、紫色（405nm）レーザの強度を直ちに「0」に減少させるソフトウェアコントロールパネル。 <ol><li> GFP蛍光の新しいベースラインを得る。 X / Yの比を求めることによってアブレーションを確認する。 注： 図を参照してください図1Bに示す。 Y =アブレーション前の平均強度、X =アブレーション後の平均強度、ROI内の4つの連続サンプルの平均を用いる。正確な標的比率（50％、60％ など ）は、所与の実験に望まれる損傷の量に依存する。 </li></ol></li></ol> 4.ヨウ化プロピジウム染色による経時顕微鏡検査<ol><li>光分解後の腎細胞傷害の相関として、ヨウ化プロピジウム染色を視覚化するための一般的な時間経過の検討（前の研究15で概説）を適用する。 </li><li>ステップ2および3.7にそれぞれ記載されているように、埋め込みおよび光切除の前に、30μMヨウ化プロピジウム溶液（E3-PTU中の1％DMSO）中の幼虫を3時間プレインキュベートする。 注：ヨウ化プロピジウムは、アガロースまたはイメージング溶液には必要ありません。 </li><li>段階3.1~3.12に記載されているように、部分腎障害を誘発する。 </li><li>時間経過イメージスタックを取得する488 nmレーザー（GFP）および461 nmレーザー（Propidium Iodide、PI）を使用して、前の研究14のベッドを使用した。 注：GFPの消失とヨウ化プロピジウム染色の出現を相関させるために、2色を共焦点スタックに重ねる。 </li><li>仮想スライス厚さ=4μm、z-スタック間隔=2μm、画素滞留時間=1.9μs、画像寸法= 512x512、および平均= 2のように、タイムラプス画像スタックを得るためのパラメータを設定する。 注：これらのパラメータは、最大4匹の幼虫の連続的な10〜15分の間隔記録を可能にし、試料の光退色が最小限であることを保証する。 </li><li>記録ファイル形式と互換性のあるイメージングソフトウェアを使用して、データを視覚化して分析します。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

全レーザ出力はシステムによって異なることに留意されたい。しかし、％GFP光退色を使用すると、レーザー出力の変動とは無関係に、蛍光腎臓に送達され、暴露の長さによって補償される総エネルギーの読み出しが可能になる。しかし、この光切除法に対する異なる組織の応答は様々であることに留意してください。腎臓の成熟中でさえ、成熟した幼虫よりも若い胚でGFP蛍光の50％の減少を?...

急性腎不全とも呼ばれる急性腎障害（AKI） 1,2 は、腎機能の突然の障害として広く定義されている3 。この状態の理解のレベルは長年にわたって著しく向上しているが、罹患率と死亡率は高いままである 1,2 。この状態の現在の治療法は、薬物治療の複数の臨床試験の結果が陰性であったため、ほとんど支持的である4,5 。腎臓は、それ自身を修復する能力を有する点で独特である。したがって、AKIの早期診断後の支持療法は、罹患率を制限する最良の方法である6 。しかし、早期にAKIを検出することは困難であり、死亡率は透析が必要な患者では50-80％。腎臓が自分自身を修復する能力およびこの状態の治療選択肢の欠如により、このネフロン再生プロセスを強化する方法を開発することが重要である。 傷害や動物モデルのさまざまなエージェントを含むAKIの研究に使用される多くの異なるモデルがありました。腎臓障害の薬剤に関して、アミノグリコシド抗生物質ゲンタマイシンは、AKI7,8に至る腎毒性剤として使用されている。しかし、いくつかのグループは、ゲンタマイシン処理がゼブラフィッシュ胚9に対して致命的であることを見出した。それは、胚の回復にはあまりにも深刻な管状の損傷を引き起こし、何らかのタイプの介入なしに再生の研究を困難にする。マウスやラットのような哺乳類のモデルも貴重だと考えられていますが、AKIの研究では多くの制限があります。おそらく、げっ歯類モデルの主な欠点は、視覚障害げっ歯類の腎臓を結紮し、上皮の死および修復に至る正確な時空間的過程を決定する。 Johnson ら胚および幼生のゼブラフィッシュにおいて急性腎障害を誘発するためのレーザーアブレーションベースの技術を報告している9 。彼らは、デキストラン結合体を筋肉内注射した後、腎臓に損傷を与えるためにパルスレーザーアブレーションを使用した。デキストラン結合体からの蛍光は、細管上皮9の損傷および再生の可視化を可能にする。このモデルは、上記の2つの制限を克服するが、傷害の段階的なレベルを許容せず、大きな、任意の細胞群で実施することは困難である。 ここに記載されているAKIの新しいレーザーアブレーションベースのゼブラフィッシュモデルは、上記のすべての制限に対応しています。幼虫ゼブラフィッシュの前腎臓腎臓は成熟した機能的器官であり、哺乳類のne糸球体、近位および遠位尿細管、および収集ダクト10を含む 。ゼブラフィッシュの幼虫もまた光学的に透明であり、蛍光技術によって腎臓を観察することが可能になる。したがって、ゼブラフィッシュは、AKIの貴重なインビボモデルであり、幼生期腎臓（受精後5〜12日）は、腎臓傷害および修復に関与する細胞および分子プロセスを研究するために使用することができる。 この論文では、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するネフロンセグメントを、低エネルギー（パルスレーザシステムと比較して）紫色レーザ光（405nm）を用いて光結合させる方法を提示する。 GFP蛍光は、細胞のグループの標的化を可能にし、GFP光退色の観察によって可視化される変化を生じさせる。さらに、GFP（紫色光を吸収することによって）は、GFP発現腎細胞における損傷を増強するエネルギーシンクとして働く。時差マイクロコピーを使用して修復処理を調べることができます。研究により、細胞増殖、細胞移動、および細胞化生11,12,13がすべて腎臓修復において重要な役割を果たす可能性のあるプロセスであることが判明している。しかし、これらのプロセスの相対的重要性とその相互作用の詳細は、AKIの既存モデルの限界のために明らかにすることは困難でした。この新規アプローチを用いて、急性損傷後の腎臓修復において細胞移動が中心的役割を果たすことを示すことが可能であった14 。

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

急性腎臓傷害（AKI）は、高い死亡率を有する一般的な病状である。腎臓の修復能力により、支持療法後に適切な腎機能を回復させることが可能である。しかし、細胞死を最小限に抑え、再生プロセスを強化するためには、細胞レベルでネフロン細胞の死滅および修復がどのように起こるかをより良く理解することが必要である。 zebrafish pronephrosは、哺乳動物ネフロンに類似した解剖学的セグメントを含むため、この目標を達成するための良いモデルシステムです。以前は、魚の腎障害を研究するために使用された最も一般的なモデルは、薬理学的ゲンタマイシンモデルであった。しかしながら、このモデルは、損傷の正確な時空間制御を可能にせず、したがって、腎臓修復に関与する細胞プロセスおよび分子プロセスを研究することは困難である。この制限を克服するために、この研究は、ゲンタマイシンアプローチとは対照的に、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）-ex青色レーザ光（405nm）を用いてネフロンセグメントをプレスすることができる。このAKIの新規モデルは、上皮損傷の他の方法が欠けている多くの利点を提供する。その主な利点は、強いインビボ動物モデルにおいて、損傷レベルと正確な時空間制御を「ダイヤル」する能力である。この新しい方法は、腎障害および修復機構の理解のレベルを有意に高める可能性を有する。

このプロトコルはET（krt8：EGFP）sqet11-9、ET（krt8：EGFP）sqet33-d10、およびTg（atp1a1a.4：GFP）を含む多くの腎臓GFPトランスジェニック系統でうまく使用されたことに注意してください。ここに示されている例の結果は、ET（krt8：EGFP）sqet11-9系統を用いて得られた。 図1は、光切断プロトコルの例を示す。?...

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Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K ビュー.  NYITCOM. この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

発生生物学

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

生物学

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

医学

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...