Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para a RAW a partir do seguinte: Institutos Nacionais de Saúde concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor iniciantes Scholar concessão de uma subvenção # 5 FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame College of Science e do Departamento de Ciências Biológicas; e uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame de Elizabeth e Michael Gallagher, em nome da família Gallagher para promover a investigação em células estaminais. Os financiadores não tinham qualquer papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa de peixe-zebra em Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar da nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros do nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho.

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos métodos que permitem a visualização dos componentes do segmento nefrónio no peixe-zebra adultos. A injeção de conjugados de dextran fluorescentes permite rotulagem PCT preferencial devido as propriedades de endocitose dessas células do túbulo proximal 30,38. Este método pode ser realizado com grande flexibilidade, devido à existência de dextranos que pode ser obtida com um grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Além disso, a utilização de dextranos de lisina-fixável é uma forma especialmente conveniente para rotular PCT segmentos, como procedimentos de marcação secundárias não são necessários. Isso permite a detecção do sinal relativamente simples e é compatível com muitas outras marcas fluorescentes, imunomarcação e uso de linhas repórter transgênicos. Rotulagem de fosfatase alcalina também marca o túbulo proximal, com forte reação no PCT e reactividade ligeiramente mais fraco no PST. Finalmente, a coloração com DBA permite rotulagem dos segmentos tubulares distais, que exibem um characteristic ramificada morfologia. Várias moléculas de lectina, que são proteínas de ligação de açúcar de origem não-imune, têm sido amplamente utilizados para distinguir os segmentos de nefrónios de mamíferos 47. É interessante que no peixe-zebra DBA correlaciona-se com os segmentos do túbulo distai, uma vez que é utilizado para marcar ductos coletores em rins de mamíferos 47. Tomados em conjunto, estes métodos podem ser utilizados em várias combinações para documentar composição e função renal. Uma vez que todos estes métodos podem ser usados ​​em preparações de rim de inteiros, eles fornecem ferramentas para avaliar estrutura nefrónios e função ao longo do órgão, sem depender exclusivamente a utilização de mais demorado, métodos tediosas, por exemplo, o trabalho de criocorte e imunomarcação. No entanto, os corantes descritos neste artigo métodos são viáveis ​​no criocorte. Análise cryosection gera amostras (em comparação com todo mount) que são mais adequadas para imunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, embora, naturalmente, este tipo de análise requer a disponibilidade de anticorpos primários adequados. Infelizmente uma grande limitação em trabalhar com o modelo animal peixe-zebra continua a ser a fraca disponibilidade de anticorpos. Assim DESEJO continua a ser o mais utilizado, ou seja, &quot;go-to&quot;, procedimento para a análise da expressão gênica. DESEJO usando reações de substrato BCIP, NBT, e / ou INT para produzir precipitados roxo ou vermelho não é compatível com coloração fluorescente em criossecções. Uma opção seria a utilização de invocar a detecção DESEJOS fluorescente, um procedimento que foi optimizado para as amostras de peixes-zebra embrionários e pode ser adaptado para uso com o rim de adulto. A descrição dos métodos neste artigo de vídeo deve permitir uma maior experimentação com técnicas como DESEJO fluorescente em combinação com linhas de peixes-zebra transgénicos em que os segmentos individuais são marcadas com um repórter como eGFP ou mCherry. Alternativamente, os métodos descritos aqui could ser testados em combinação com outros corantes vitais, por exemplo, outras lectinas. Assim, uma nova adaptação e ampliação dos métodos descritos aqui poderia ser invocado para atender às necessidades do investigador para preparações integrais renais montagem e análise. Como tal, estes métodos têm larga aplicação potencial de peixe-zebra com o modelo para os estudos de regeneração em curso e também em modelos de doença genética. Há uma necessidade premente de pesquisas inovadoras e tratamentos para males renais. Milhões de pessoas sofrem de algum tipo de doença renal a cada ano que resulta de causas congênitas, agudas e / ou crônicas. Além disso, a prevalência da doença renal continua a aumentar em todo o mundo, fazendo com que essas doenças um problema global de saúde pública 14,15. Tratamentos como a hemodiálise estão disponíveis através do qual uma máquina de diálise externo serve para livrar o sangue de resíduos metabólicos do paciente, se os seus rins não são capazes de desempenhar esse papel. Infelizmente, Esta intervenção tem limitações, como é necessário para a sobrevivência de tratamento contínuo. Além disso, os doentes irão eventualmente necessitar de um transplante de rim, o que pode levar anos para receber uma vez por paciente é colocado em uma lista de espera. Mesmo depois da obtenção de um transplante de rim, muitos pacientes sofrem efeitos adversos, como resultado do procedimento e deve lutar esses efeitos para o resto de suas vidas. Essas dificuldades demonstram a grande necessidade para o desenvolvimento de novos tratamentos para ajudar a prevenir qualquer doença renal ou talvez aumentar a regeneração dos tecidos 8,16,52,53. Dadas as limitações óbvias éticos da utilização de cobaias em laboratórios biomédicos humanos, os modelos animais são essenciais para o estudo da patogénese da doença humana e para o ensaio de novos tratamentos. Como um resultado da sua semelhança e proximidade anatómica evolutiva, o ratinho se tornou o modelo o mais amplamente usado para a doença humana 45. No entanto, existem algumas limitações com este animal, incluing incapacidade de visualizar o desenvolvimento de órgãos in vivo e praticidade de completar telas genéticos de larga escala. Peixe-zebra é um organismo modelo relevante e útil para o estudo do desenvolvimento dos órgãos e modelagem de doenças humanas 45,46. Em relação à doença humana, homólogos funcionais no peixe-zebra existem para quase 70% de todos os genes humanos 54,55. Trabalhos recentes destacaram a utilidade do peixe-zebra para muitas áreas de 31,37,56 pesquisa renal. Estudos de regeneração e reparo no peixe-zebra após AKI sugerem que a regeneração epitelial tubular e neonephrogenesis são dois processos que ocorrem e se sobrepõem ao longo da regeneração timecourse 30,37. A utilização de um antibiótico aminoglicósido gentamicina chamada tem sido utilizada como um paradigma da lesão, através do qual a estudar os resultados de LRA 29,30,37 em peixes-zebra adultos. Ao longo de aproximadamente duas semanas de período após lesão de gentamicina, a Tubul proximales regenerar, e, entretanto, novos néfrons formar por todo o órgão 29,30,37. Em geral, os mecanismos que regulam a regeneração epitelial permanecem altamente controversa. Em um mecanismo proposto para o processo de reparação, não é o evento lesão aguda inicial, seguido por um desprendimento de células mortas para o lúmen. Em seguida, há uma série de desdiferenciação, proliferação e migração de eventos, após o qual as novas células se diferenciam, o repovoamento da membrana basal lesada e restaurar a função para o local ferido. Alternativamente, outros estudos sugeriram que as células de substituição surgem a partir de células estaminais / progenitoras que residem dentro dos túbulos dos néfrons. No que respeita ao processo de neonephrogenesis no peixe-zebra, agregados celulares foram observadas após AKI pela injeção de gentamicina 29,30. Estes agregados depois amadurecer em novos néfrons que sondar em túbulos já existentes 29,30. O traço comum que une néfrons regeneração epitelial e neonephrogenesis é seu fator de mistério pura: no momento não são exponencialmente mais perguntas sobre como esses feitos regenerativos ocorrer do que há idéias disponíveis. Até o momento, no entanto, várias linhas emocionantes de evidências sustentam a noção de que a pesquisa de regeneração renal usando zebrafish pode realmente fornecer informações comparativas pertinentes para AKI humano que também pode ter direto de translação potencial 56-58. Rastreio químico para identificar pequenas moléculas que aumentam a proliferação das células progenitoras renais no embrião do peixe-zebra recentemente conduziu à identificação do inibidor de histona desacetilase butanoato de metilo-4 (feniltio) (m4PTB) 56,57. A administração desse composto de larvas do peixe com induzida por gentamicina AKI revelou que a sobrevivência larval aumentou e que a proliferação tubular renal foi melhorada 56,58. Quando os ratos com lesão renal aguda induzida por isquemia moderada foram tratados com m4PTB, sua recuperação foi acelerada em association com uma redução tanto atrofia e ciclo celular tubular prisão de proliferação de células tubulares renais 58. Estas descobertas sugerem que as vias responsáveis ​​para o normal desenvolvimento do peixe-zebra renal e / ou a resposta regenerativa de LRA será conservada com mamíferos 56. Assim, embora mais estudos são necessários para separar os mecanismos de regeneração, ou seja identificar as vias de sinalização que estão envolvidos e entender suas interações-o peixe-zebra fornece um caminho promissor para perseguir este objetivo importante na área de nefrologia. As ferramentas tais como as etiquetas de células nefrónio descritos neste protocolo representa um grupo de ensaios que podem ser utilizados para avaliar a composição e funcionalidade renal em modelos LRA. Além disso, eles podem ser utilizados para caracterizar os modelos transgénicos de doença renal e podem proporcionar formas para identificar agentes terapêuticos químicos capazes de promover a restauração da estrutura depois de nefrónio barragem renalidade.

O rim é um órgão complexo que cumpre uma série de funções fisiológicas no corpo. A função mais importante do rim é a excreção de resíduos metabólicos, e esta tarefa está intimamente entrelaçada com a manutenção da homeostase dos fluidos. O rim executa esses trabalhos por filtração do sangue e formação de urina, enquanto concomitantemente regulação da pressão arterial, os níveis de eletrólitos e equilíbrio ácido-base. Túbulos epiteliais altamente especializadas chamadas nefrónios servir como a unidade funcional de base do rim 1,2. Nos vertebrados adultos, néfrons são normalmente organizados em um arranjo bem enrolada em torno de um sistema de drenagem centralizada, permitindo, assim, muitos túbulos de embalar para o relativamente pequeno órgão. Por exemplo, cada rim humano pode conter mais de 1 milhão de néfrons 3. Outros mamíferos como o mouse possuem na ordem de 8-10000 néfrons por renal 4. O grau de complexidade renal difere entre esses mamíferos e outras vertebrates devido a variações no número total de néfrons e seu layout arquitetônico dentro do rim. Espécies de vertebrados formar até três sucessivas estruturas renais durante o desenvolvimento, e cada forma exibe uma complexidade crescente em relação à dotação de néfrons e disposição: os pronephros, mesonephros e metanefro. A última estrutura renal a ser retida serve como o rim adulto tipicamente um órgão ou um mesonefros metanefros 2. Cada forma de rim, no entanto, tem uma composição à base de nefrónio 2. O néfron é o carro-chefe do rim e é responsável pela filtragem do sangue, juntamente com secreção metabólito e reabsorção. Néfrons são estruturas tubulares simples formadas por células epiteliais e têm uma organização segmentar, em que domínios discretos, altamente especializados e de epitélios diferenciados executar tarefas específicas. Na ordem do fluxo de filtrado através do néfron, normalmente há três partes principais que comprise cada uma das unidades: (1) o corpúsculo renal, (2) um túbulo proximal com, intermédia, e distais, e (3) uma conduta de recolha 1. O túbulo proximal é responsável pela reabsorção de solutos orgânicos, mais notavelmente glicose e os aminoácidos 1. O túbulo intermediário (ou alça de Henle) é um importante local de sal e água a regra 1. Finalmente, ajuste fino de sal e outros íons ocorre no túbulo distal e ducto coletor e é altamente regulado pelo sistema endócrino 1. A partir daí, o filtrado viaja através do ureter e da bexiga, em última análise, que sai do corpo como um produto residual 1. A perda da função renal pode ser resultado de uma multiplicidade de causas que impedem a atividade de néfrons normal. Essas causas podem ocorrer durante o desenvolvimento do rim, por exemplo, defeitos congênitos que levam à má formação de néfrons 5 ou causas de diferentes tipos de lesão (decorrente tanto genética e environmeorigens ntal). Lesões adquiridas são amplamente classificados como lesão renal aguda (IRA) ou lesão renal crônica (DRC). LRA envolve uma perda abrupta da função renal, muitas vezes resultante de isquemia ou toxina exposição 6,7. Nos mamíferos, reparação epitelial de néfrons é possível após tais lesões 8, e muitas pessoas exibem a restauração completa da função renal após AKI. No entanto, AKI também está associada com alta morbidade e mortalidade que foram relatados através de uma ampla 30 - 70% de incidência 6,7. DRC, em contraste, está associada com a perda progressiva da função renal que resulta de anos de danos prolongado, tipicamente associada com fibrose 8,9. Além disso, existe uma interação entre AKI e CKD, como qualquer um pode predispor um indivíduo para o outro 10-12. Por exemplo, aqueles que sofreram AKI são mais suscetíveis à doença renal crônica e mesmo a morte 13. A incidência da doença renal, em ambos os EUA e em todo o mundo, atingiu epideproporções de microfone e está prevista a aumentar como a população idosa expande-, portanto, há uma necessidade crescente de identificar intervenções de medicina regenerativa para o rim 14,15. Apesar do conhecimento de que pacientes com LRA pode se recuperar, há muito tempo se pensou que o rim é um órgão sem poderes regenerativos inatas. Esta visão tradicional foi revisado drasticamente nos últimos anos 16. Estudos investigando dano renal em camundongos e ratos após AKI têm mostrado que as células epiteliais do túbulo do néfron podem proliferar e reconstruir néfrons funcionais 17-20. Embora os mamíferos possuem essa capacidade adaptativa para regenerar néfrons, existem limitações notáveis ​​e respostas inadaptadas podem ser desencadeadas que levam a fibrose renal e CKD 21. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que a ablação das células epiteliais repetido em nefrónios murino foi associada com a regeneração diminuída e nefrónios-sugerindo fibrose renal havea limitada limiar regeneração 22. Não há nenhuma evidência de que o rim de mamífero adulto forma novas nefrónios para substituir os perdidos ou danificados, assim, a sua destruição leva a um défice de 8,9 nefrónio permanente. Curiosamente, alguns vertebrados respondem a AKI regenerando néfrons epitélio e por também produzir novos néfrons, um processo conhecido como neonephrogenesis ou néfrons neogênese 23. Neonephrogenesis ocorre em peixes após exposição a uma toxina ou ressecção parcial e modelos de lesão incluíram historicamente o peixinho 24,25, tilápia 26, patim 27, medaka 28 e, mais recentemente, o peixe-zebra 29,30. Destes, peixe-zebra fornecer um modelo de pesquisa genética viável para descobrir as vias celulares e moleculares responsáveis ​​pela regeneração renal. Neste artigo de vídeo, demonstramos como rotular segmentos dos néfrons em peixe-zebra adulto. O conhecimento da anatomia de néfrons, as características moleculares,e características funcionais são essenciais para estudos renais futuro de sucesso usando zebrafish. O rim adulto do peixe-zebra é uma estrutura mesonefros e é inerentemente menos complexo, em termos de número de nefrónios e organização do que a estrutura de metanefros encontrada em mamíferos adultos, aves, répteis e 31. Contudo, a organização segmento nefrónio do peixe-zebra é análogo aos mamíferos, e foi documentada no rim embrionário com base em estudos de expressão de genes 31-35. Nefrónios de embriões de peixes-zebra conter segmentos lineares tubulares que incluem o túbulo proximal (PCT), túbulo proximal recta (PST), distal precoce (DE), e distal tarde (DL) 31-35 (Figura 1). Nefrónios adultos Zebrafish possuem segmentos tubulares semelhantes 30,31,36,37 (Figura 1). O PCT, também podem ser identificados por um fenótipo funcional: As células epiteliais na PCT irá incorporar compostos de dextrano marcados com fluorescência (10-70 kDa em tamanho) presentes nocirculação, que foi usado tanto no rim embrionário do peixe-zebra e adulto para avaliar a absorção de endocitose por essas células do túbulo proximal, 38-41 (Figura 1). Uma diferença em segmentos dos néfrons entre peixe-zebra e mamíferos é que carecem de um peixe-zebra túbulo intermediário, ou alça de Henle 30-37; uma vez que este segmento funciona em mamíferos para conservar a água e peixe-zebra são uma espécie de água doce, sem a urgência de concentrar a urina, não é de estranhar que zebrafish falta neste segmento 32,33. Assim, a composição global nefrónio é largamente conservada entre o peixe-zebra e rim de mamífero 32,33. Estas semelhanças permitiram peixe-zebra para ser uma ferramenta eficaz de investigação para investigar as funções dos genes expressos-renais durante nefrogênese desenvolvimento 32-35,42 e modelar inúmeras doenças renais 43,44, o que agrava a lista substancial das condições humanas que podem ser investigada usandozebrafish 45,46. Hoje, o rim adulto peixe-zebra é um modelo atraente para estudos comparativos de regeneração renal devido à sua rastreabilidade genética eo palato expansão dos recursos tecnológicos disponíveis para interrogar a função do gene e vias de sinalização nesta espécie. Vários estudos têm utilizado os mesonephros peixe-zebra para investigar os mecanismos de regeneração após AKI 29,30,37. Para a pesquisa AKI continuou usando o rim adulto peixe-zebra, é essencial dispor de métodos requintados para rotular diferentes regiões e métodos de néfrons para examinar a funcionalidade de néfrons. Existem vários métodos de análise de rim adulto foram adaptados a partir de protocolos de rim embrionário. A injecção intraperitoneal de dextrano marcado fluorescentemente no peixe-zebra adultos rótulos do epitélio em PCT Mesonefros nefrónios via endocitose 30, como em embriões de peixe-zebra 38-41 (Figura 1). Este método tem sido utilizado para visualize quando túbulos proximais recuperar a sua propriedade reabsorvendo seguinte AKI, o que permite uma avaliação das restaurado função fisiológica 30 (Figura 1). Outra característica do túbulo proximal nefrónio é que as células epiteliais deste segmento possuir uma borda em escova 37 que apresenta elevados níveis de actividade de fosfatase alcalina endógena. Assim, o epitélio proximal pode ser localizada visualmente no rim adulto peixe-zebra utilizando uma técnica de fluorescência com base conhecido como ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescência) -97 47. Aqui, nós descrevemos como realizar ensaios de captação de dextrano fluorescentes 30,48 no rim adulto peixe-zebra, de modo a obter uma avaliação funcional do túbulo proximal e mapear o tamanho e os contornos do segmento tubular. Em seguida, descreve-se técnicas para identificar as regiões do túbulo proximal do nefrónio adulto com a fosfatase alcalina marcador fluorescente. Em terceiro lugar, mostramos pela primeira vez que o Rhodamina marcada com lectina de aglutinina de Dolichos biflorus (DBA), a qual tem sido utilizada como um marcador geral das condutas de recolha no rim de mamíferos 49, marca os túbulos distais do rim adulto peixe-zebra. Como DBA é mutuamente exclusiva à coloração da fosfatase alcalina, esses rótulos fornecem uma maneira de distinguir amplamente pan-proximal contra trechos pan-distais do néfron zebrafish adulto. Ao longo da implementação destas manchas fluorescentes em todo tanto montagem e cortes histológicos criostáticas, nós correlacionar esses rótulos com domínios de genes transportadores de soluto que identificam cada um dos segmentos de néfrons de expressão. Portanto, este protocolo também contém um guia para os procedimentos de processamento de tecidos modificados para todo tecido adulto montagem de hibridação in situ (desejo) a análise com base em nosso protocolo DESEJO embrião 50. Estes procedimentos podem ser utilizados em combinações diferentes (Figura 2) para documentar características morfológicas e funcionais of adultos néfrons nos rins do peixe-zebra. Assim, estes protocolos podem ser aplicados a estudos de regeneração, a caracterização fenotípica dos outros modelos de doenças renais, e até mesmo utilizado para estudar a formação de rim adulto.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Made by diluting 10 X PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS with 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other modeling clays can be substituted and work similarly</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Optional: cardboard tray to store slides flat</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>Bleach mix formula (for a 20 ml solution):&lt;br/&gt; 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution&lt;br/&gt; 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution&lt;br/&gt; 100 &amp;mu;l of 20% Tween&lt;br/&gt; Fill to 20 ml with distilled water</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Solution (for a 10 ml solution):&lt;br/&gt; 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween&lt;br/&gt; 2 ml of fetal calf serum&lt;br/&gt; 150 &amp;mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase activity detection</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&amp;nbsp; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#039;s instructions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase wash solution</td><td></td><td></td><td>Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):&lt;br/&gt; 5 ml of 0.5 M EDTA&lt;br/&gt; 120 mg of Levamisole&lt;br/&gt; 95 ml of 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (for a 100 &amp;mu;l solution):&lt;br/&gt; 1 &amp;mu;l of DBA&lt;br/&gt; 99 &amp;mu;l of 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &amp;ndash; super PAP pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&amp;trade; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

O modelo de peixe-zebra tem emergido como um sistema relevante para estudar o desenvolvimento do rim, a regeneração e a doença. Ambos os rins de peixes-zebra embrionários e adultos são compostas de unidades de nefrónios funcionais conhecidos como, que são altamente conservadas com outros vertebrados, incluindo mamíferos. Pesquisa em zebrafish demonstrou recentemente que dois fenômenos distintos transpire após néfrons adultos estão sujeitos a danos: primeiro, não há regeneração robusta dentro de néfrons existentes que substitui as células epiteliais do túbulo destruídos; segundo, inteiramente novos nefrónios são produzidos a partir de células progenitoras renais em um processo conhecido como neonephrogenesis. Em contraste, os seres humanos e outros mamíferos parecem ter apenas uma capacidade limitada de regeneração epitelial nefrónio. Até à data, os mecanismos responsáveis ​​por esses fenômenos de regeneração renal permanecem pouco compreendidos. Desde rins peixe-zebra adulto sofrer tanto a regeneração epitelial néfrons e neonephrogenesis, eles fornecem um par experimental excelentedigma para estudar esses eventos. Além disso, há uma grande variedade de ferramentas genéticas e farmacológicos disponíveis no modelo de peixe-zebra que podem ser utilizadas para delinear os mecanismos celulares e moleculares que regulam a regeneração renal. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve um conjunto de técnicas de marcação que podem ser usadas para medir a composição e funcionalidade renal teste nefrónio do rim adulto peixe-zebra. Assim, estes métodos são amplamente aplicáveis ​​para o futuro caracterização fenotípica dos paradigmas de peixe-zebra adultos de lesão renal, que incluem mas não estão limitados a, os regimes de exposição nephrotoxicant ou métodos genéticos de morte celular-alvo, tais como a nitro-redutase mediada técnica de ablação celular. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para estudar a formação de perturbações genéticas em rim de adultos e pode também ser aplicado para avaliar o estado da doença renal crónica durante a modelação.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

43.9K visualizações.  University of Notre Dame.  O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal. 

Vídeo: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Biologia

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Source: McCampbell, K. K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/51644" target="_blank">Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2014)
In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.