Name: visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA Biotinilaï¿½o <ol><li> A biotinilação de DNA de extremos cerses usando transferase terminal (TdT) Nota: O uso de T4 DNA (166 kpb), que é um DNA de extremos cerses. <ol><li> Adicionar 5 uL de 2,5 mM de CoCl2, 5 ul de 10 × tampão de reacção, 0,5 ul de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 ul de transferase terminal (10 unidades) e 0,5 ul de ADN de T4 (0,5 ug / uL) à mistura de reacção. Adicione a um volume final de 50 ul pela adição de 38,5 ul de água. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 1 h. Nota: o tempo de reacção prolongado pode produzir ADN de dupla presa, ou seja, é possível que biotinas são marcados em ambas as extremidades. </li><li> Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, pH 8. </li><li> Manter o tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> A biotinilação de ADN ended pegajoso utilizando ADN ligase Nota: O uso λ ADN (48,5 kpb), que é um ADN pegajosa-fim. &lt;ol&gt; <li> Adicionar 1 ul de DNA-ligase de T4, 5 uL de tampão de ligação 10 ×, 1 ul de 25 ng / ul de ADN de fago λ, e adicionar 43 ul de água para fazer um volume final de 50 ul. </li><li> Manter o tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. funcionalizados A derivação de superfície Nota:. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN na superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1 Este processo de PEGilação é importante para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente o ruído aleatório criado por ligação de moléculas indesejáveis ​​sobre a superfície. <ol><li> Limpeza Piranha Nota: As soluções Piranha reagir violentamente com materiais orgânicos, pelo que deve ser manuseado com cuidado, seguindo as orientações de segurança adequadas. <ol><li> Lugar lamelas em um rack de politetrafluoretileno (PTFE), e mantê-los by PTFE veda-rosca longitudinalmente, metade na borda das superfícies e metade na prateleira. Após acondicionamento, deixar uma parte longa (~ 5 cm) de fita adesiva para lidar com a grade durante o procedimento de limpeza. </li><li> Encher um copo de vidro de 1 L com 350 ml de H 2 SO 4 e 150 ml de H 2 O 2 para fazer a solução piranha numa hotte. Coloque o rack em solução piranha, durante 2 horas. </li><li> solução vazia piranha da taça, e lamelas enxaguar abundantemente com água deionizada até que o pH da água no copo atinge neutro. Utilizar as tiras de papel de pH. </li><li> Sonicar os suportes de lamelas na água proveta contendo, durante 30 min. água vazia do copo imediatamente antes amino silanização. Use 75 W de potência sonicação de limpar e derivar os substratos de vidro. </li></ol></li><li> Aminosilanization na superfície de vidro <ol><li> Adicionar 2 ml de N - [3- (trimetoxissilil) propil] etilenodiamina e 10 ml de ácido acético glacial em 200 mlde álcool metílico em um recipiente de polipropileno limpo para preparar a solução aminosilanization. </li><li> Coloque lamelas limpas no recipiente de polipropileno. Agite-los a 100 rpm e a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Sonicar a proveta com lamelas derivatizadas durante 15 minutos a 75 W. agitá-los a 100 rpm e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min. </li><li> Esvaziar a solução a partir do recipiente, e enxaguar lamelas cuidadosamente, uma vez com álcool metílico, e duas vezes com álcool etílico. lamelas de loja em álcool etílico e usá-los dentro de duas semanas. </li></ol></li><li> PEGilação da lamela <ol><li> Adicione 10 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO3). Filtra-se a solução com um filtro de seringa de 0,22? M. </li><li> Dissolve-se 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidil (biotina-PEG-SC) e 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) em 350 ul de NaHCO3. Use um tubo de proteção contra a luz. </li><li> Vortex do tubo vigorosamente durante 10 segundo, e centrifuga-se que a 10.000 × g durante 1 min para remover bolhas. </li><li> Lavar uma lâmina de vidro com acetona, seguido por lavagem com álcool etílico. Permitir o slide secar ao ar completamente. </li><li> Colocar uma gota (50 uL) de solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Cubra a gota suavemente com um amino silanizada lamela, sem gerar bolhas. </li><li> Colocar as lâminas para 3 horas durante a noite em um escuro, bem nivelado câmara húmida à temperatura ambiente. Use um suporte de ponta de pipeta vazia como a câmara, com água na parte inferior. Selar solução de PEG residual no tubo e mantê-lo a 4 ° C. </li><li> Lavar as lamelas PEGylated cuidadosamente com água deionizada. Armazená-lo em um lugar escuro e seco até o uso. </li></ol></li></ol> 3. Montagem de uma câmara de fluxo <ol><li> Fabricar um suporte de acrílico perfurados, como na Figura 2. Assegure-se que o diâmetro do tubo de inserção é 0,762 milímetros, e designa um orifício de entrada é um e o outro éuma saída (Figura 2). </li><li> Coloque tiras adesivas de dupla face de fita (largura 5-6 mm) sobre um suporte acrílico (Figura 2), alinhando perpendicularmente a um orifício de entrada e de saída, não perturbando quaisquer furos de canal. Use estas tiras de fita como paredes multi-canal para fazer câmaras. Esfregue a fita usando uma ponta de pipeta. </li><li> Coloque uma lamela PEGylated na parte superior para fazer câmaras de fluxo, com o lado da PEGylated bruços. </li><li> Para evitar qualquer solução de vazamento, pressione o topo de uma lamela sobre a área onde fitas de dupla face são colocados. Adicionar cola epoxi de secagem rápida, para fechar as extremidades da câmara na parte superior e na parte inferior (cor amarela na Figura 2). </li><li> Conectar uma peça curta (2,5 cm) de tubo (diâmetro externo, OD, 0,042 &quot;) para uma seringa estanque de gás e vedar a junta com cola epóxi. </li><li> Conecte um longo tubo flexível (OD: 0,03 &quot;) para a tubulação ligada à seringa e selar a junção com cola epóxi. </li><li> Encha o tubing ligada à seringa com água DI. Certifique-se de que não há bolha de ar. </li><li> Insira a tubulação no orifício da câmara de fluxo selada com cola epóxi. </li><li> Coloque uma ponta amarela (200 ul ponta) do outro furo como um reservatório. </li></ol> 4. Amostra Carregando no fluxo Câmara Nota: neutravidina pode ser substituído por outras proteínas avidina, tais como estreptavidina. Todas as reacções podem ser realizadas à temperatura ambiente, a menos que seja mencionado. Tome solução da amostra em uma ponta amarela, e instalar a ponta com a solução para o buraco do suporte de acrílico (Figura 2b). <ol><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de seringa a 50 ul / min. Carga 20 ul de proteína de avidina (25 ug / ml em solução T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e mantê-lo durante 10 min. </li><li> Carga 20 l de oligodesoxinucleï¿½idos biotinilados (100 mm em 1 × TE), e mantê-lo por 10 min. Se transferase terminal é utilizado, pule o carregamentode oligodesoxinucleï¿½idos. </li><li> Carga de 20 uL de solução de ADN a partir do Passo 1 para a câmara de fluxo a uma taxa de fluxo de 10 uL / ​​min, e mantê-lo durante 30 min. </li><li> Lava-se a câmara de fluxo com 1 x TE, e carregar 40 ul de FP-DBP de 10 (~ 80 nM). </li><li> Observar ADN sob um microscópio de fluorescência com o fluxo contínuo de moléculas de coloração em 1 × TE numa lente objectiva 60X. Use 488 nm laser em estado sólido para excitação do FP (eGFP) -DBP. Para a completa extensão de moléculas de DNA, aplicar diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA usadas. Por exemplo, aplicam-se 50? L / min durante 48,5 kpb de ADN λ, e 100 ul / min durante 166 kpb de ADN de T4. <ol><li> Para reciclagem do titular do acrílico, mergulhe câmaras de fluxo montados em uma solução de detergente doméstico 12. Retirar fitas ou epóxi com uma lâmina de barbear e esfregar com as mãos para levá-los completamente desligado. Desobstruir furos com agulhas de seringa. Mantenha os titulares em água deionizada até à sua utilização. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui nós apresentamos uma plataforma para visualização de moléculas de DNA longos biotinilados para a ancoragem em superfícies. Nós relatamos uma abordagem para moléculas de DNA amarrados em uma superfície revestida de proteína avidina com albumina sérica bovina biotinilado. 6 Na abordagem anterior, verificou-se uma questão crucial de DNA photo-clivagem causada por corantes bis-intercalação que mancham moléculas de DNA amarrados na superfície. Como estes fluoróforos continuamente animado têm ...

Visualização de moléculas de DNA grandes amarrados em superfícies de vidro ou talão tem sido utilizado para investigar as interações DNA-proteína, dinâmica de proteínas em substrato de ADN, 1,2 e física de polímeros. 3,4 Uma plataforma de moléculas de DNA grandes single-tethered tem um pouco distinta vantagens em comparação com outros métodos de imobilização de DNA. 5 primeiro, uma grande molécula de ADN amarrado na superfície tem uma conformação em espiral aleatória natural sem um fluxo de cisalhamento, o que é criticamente importante para uma proteína de ligação de ADN de reconhecer o seu local de ligação. Em segundo lugar, é muito fácil de alterar o ambiente químico em torno de moléculas de DNA para uma série de reacções enzimáticas em uma câmara de fluxo. Em terceiro lugar, um fluxo de cisalhamento de microfluidos induz ADN molecular do alongamento até 100% do comprimento do contorno completo, o que é muito difícil de conseguir utilizando o alongamento do ADN as abordagens alternativas, tais como a superfície de imobilização 6 e confinamento nanochannel. 7 Um totalmente stretchemolécula de DNA d também fornece informação de posição que pode ser útil para monitorizar os movimentos enzimáticas no mapa genómico. No entanto, a abordagem DNA tethering tem uma lacuna crítica em que a tintura a intercalação, tal como YOYO-1 geralmente provoca moléculas de DNA amarrados para ser facilmente quebrado pela luz de excitação de fluorescência. De um modo geral, moléculas de DNA grandes têm de ser marcadas com um corante fluorescente para a visualização sob um microscópio fluorescente. Para este efeito, YOYO-1 ou outros corantes da série TOTO são usadas principalmente porque estes corantes fluoresce apenas quando intercalar de ADN de cadeia dupla. 8 No entanto, é bem conhecido que a bis-intercalantes corante faz com que o ADN induzida pela luz foto-clivagem porque da intercalação de fluoróforos. 9 Além disso, as moléculas de ADN fluorescentes coradas amarrados na superfície são mais frágeis uma vez que os fluxos de cisalhamento pode exercer forças de quebra no movendo-se livremente moléculas de ADN. Por isso, desenvolvemos FP-DBP como um romance Dcorante proteína NA-coloração para imagiologia de grandes moléculas de ADN na superfície amarrados. A vantagem da utilização de FP-PAD é que ela não provoca foto-clivagem das moléculas de ADN ao qual se liga. 10 Além disso, FP-PAD não aumenta o comprimento do contorno do DNA, enquanto que corantes bis-intercalantes aumentar o comprimento do contorno por cerca de 33%. Este método de vídeo introduz a abordagem experimental para prender moléculas de DNA grandes a uma superfície PEG-biotina. A Figura 1 ilustra as diferentes abordagens de amarrar DNA com extremidades sem corte e extremidades pegajosas. Assim, este método de coloração pode ser aplicado a qualquer tipo de molécula de ADN. A figura 2 mostra uma representação esquemática da montagem de câmara de fluxo que pode ser controlada por uma bomba de seringa para gerar fluxos de cisalhamento para esticar moléculas de ADN, bem como a carga química e enzima soluções. a Figura 3 demonstra micrografias das moléculas de ADN esticadas inteiramente amarrados no PEGylatsuperfície ed 11 e corados com FP-PAD.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

A Figura 1 mostra dois métodos de ADN de ancoragem diferentes dependendo das estruturas terminais da molécula de DNA. A Figura 1a ilustra a forma como as moléculas de ADN casquilhos pegajosos são hibridados com os oligonucleótidos biotinilados complementares, que são imobilizadas na superfície de PEG a revestida com avidina. A Figura 1B mostra a adição de biotinilado ou ddNTP de dNTP para o grupo hidroxilo 3 &#39;de um ADN de ex...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K visualizações.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Vídeo: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Bioquímica

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genética

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Imunologia e Infecção

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Biologia

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstituição de nucleossomos in situ para estudos de molécula única

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Reconstituição eficiente de nucleossomos para técnicas de molécula única

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>Desenrolamento de DNA mediado por CMG observado pelo crescimento do trato ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a dinâmica da replicação do DNA eucariótico por meio da visualização de uma única molécula

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase