This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA biotinilazione <ol><li> Biotinilazione di blunt DNA ended utilizzando Terminal transferasi (TdT) Nota: utilizzare T4 DNA (166 kbp), che è un DNA ended smussato. <ol><li> Aggiungere 5 ml di 2,5 mM CoCl 2, 5 ml di 10 × tampone di reazione, 0,5 ml di 10 mM biotina-11-dUTP, 0.5 ml di transferasi terminale (10 unità) e 0,5 ml di T4 DNA (0,5 mcg / ml) alla miscela di reazione. Rendere ad un volume finale di 50 ml aggiungendo 38,5 ml di acqua. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 1 ora. Nota: tempo di reazione totale può produrre DNA a doppia legato, cioè, è possibile che biotins vengono contrassegnati alle due estremità. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Tenere il tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Biotinilazione di DNA ended appiccicoso Utilizzando DNA Ligase Nota: utilizzare λ DNA (48,5 kbp), che è un DNA appiccicoso-end. &lt;ol&gt; <li> Aggiungere 1 ml di T4 DNA ligasi, 5 microlitri di 10 × tampone di legatura, 1 ml di 25 ng / ml DNA λ fago, e aggiungere 43 ml di acqua per fare un volume finale di 50 pl. </li><li> Tenere il tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. funzionalizzato Derivatizzazione Surface Nota:. Per legare una estremità di una molecola di DNA sulla superficie di vetro, un gruppo amminico primario è silanizzato su un vetrino seguita da rivestimento biotina-PEG come mostrato in Figura 1 Il processo PEGylation è importante per l&#39;imaging DNA a singola molecola perché può ridurre significativamente il rumore casuale creato da attaccamento di molecole indesiderate sulla superficie. <ol><li> Piranha Pulizia Nota: Le soluzioni Piranha reagire violentemente con materiali organici, pertanto, deve essere maneggiato con cura, seguendo le linee guida di sicurezza adeguate. <ol><li> Luogo coprioggetto su un politetrafluoroetilene (PTFE) cremagliera, e tenere premuto By PTFE nastro sigillante filo longitudinale, metà sul bordo delle superfici e per metà sul rack. Dopo il confezionamento, lascia un lungo pezzo (~ 5cm) di nastro per la movimentazione della rastrelliera durante la procedura di pulizia. </li><li> Riempire un bicchiere di vetro 1 L con 350 ml di H 2 SO 4 e 150 ml di H 2 O 2 per rendere soluzione piranha in una cappa aspirante. Inserire la griglia in soluzione piranha per 2 ore. </li><li> soluzione Piranha vuoto dal bicchiere, e coprioggetto risciacquo con acqua deionizzata fino a che il pH dell&#39;acqua nel bicchiere raggiunge neutra. Utilizzare strisce di carta pH. </li><li> Sonicare i rack di vetrini in acqua bicchiere contenente, per 30 min. acqua vuota dal bicchiere appena prima che amino silanizzazione. Utilizzare 75 W di potenza sonicazione per pulire e derivatize i substrati di vetro. </li></ol></li><li> Aminosilanization sulla superficie di vetro <ol><li> Aggiungere 2 ml di N - [3- (trimethoxysilyl) propil] etilendiammina e 10 ml di acido acetico glaciale a 200 mldi alcool metilico in un contenitore di polipropilene pulito per la preparazione della soluzione aminosilanization. </li><li> Mettere vetrini puliti nel contenitore in polipropilene. Agitare a 100 rpm e temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Sonicare il bicchiere con derivatizzati vetrini per 15 minuti a 75 W. scuoterli a 100 rpm e temperatura ambiente per almeno 30 minuti. </li><li> Svuotare la soluzione dal bicchiere, e risciacquare coprioggetto con attenzione, una volta con alcool metilico, e due volte con alcol etilico. coprioggetto Conservare in alcool etilico e utilizzarli entro due settimane. </li></ol></li><li> PEGylation del vetrino <ol><li> Rendere 10 ml di 0,1 M sodio bicarbonato (NaHCO 3). Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron. </li><li> Sciogliere 2 mg di carbonato di biotina-PEG-succinimidile (biotina-PEG-SC) e 80 mg di PEG-succinimidyl valerato (MPEG-SVG) in 350 ml di NaHCO 3. Utilizzare un tubo di protezione dalla luce. </li><li> Agitare la provetta con forza per 10 sec e centrifugare a 10.000 g per 1 min per rimuovere le bolle. </li><li> Risciacquare un vetrino con acetone, seguito da risciacquo con alcool etilico. Lasciare che il vetrino all&#39;aria asciugare completamente. </li><li> Mettere una goccia (50 ml) di soluzione di PEG sul vetrino pulito. Coprire la goccia delicatamente con un amino silanizzata copertura di slittamento, senza generare eventuali bolle. </li><li> Collocare i vetrini per 3 ore per una notte in un buio, ben livellato camera umida a temperatura ambiente. Utilizzare un titolare di punta della pipetta vuoto come la camera, con acqua sul fondo. Sigillare soluzione residua PEG nel tubo e la tiene a 4 ° C. </li><li> Sciacquare il vetrino PEGylated accuratamente con acqua deionizzata. Conservare in un luogo buio e asciutto fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 3. Assemblare una camera di flusso <ol><li> Realizzare un supporto acrilico perforato, come in Figura 2. Assicurarsi che il diametro dell&#39;inserto tubo è 0,762 millimetri e designare un foro è un ingresso e l&#39;altro èuna uscita (figura 2). </li><li> Posizionare nastri biadesivi Nastro adesivo (larghezza 5-6 mm) su un supporto acrilico (Figura 2), allineando perpendicolarmente ad un foro di ingresso e di uscita, senza perturbare fori canale. Utilizzare queste strisce di nastro come pareti multi-canale per rendere camere. Scrub il nastro utilizzando una punta di pipetta. </li><li> Posizionare un vetrino PEGylated sulla parte superiore per fare camere di flusso, con il lato rivolto verso il basso PEGylated. </li><li> Per evitare qualsiasi soluzione fuoriuscita, premere la parte superiore di un coprioggetto sopra la zona in cui vengono inseriti nastri biadesivi. Aggiungere colla quick-dry epossidica per chiudere i bordi della camera in alto e in basso (colore giallo nella figura 2). </li><li> Collegare un breve brano (2,5 cm) di tubo (diametro esterno, OD, 0,042 &quot;) per una siringa a tenuta di gas e sigillare il giunto con colla epossidica. </li><li> Collegare un lungo tubo flessibile (OD: 0.03 &quot;) per il tubo collegato alla siringa e sigillare il giunto con colla epossidica. </li><li> Riempire il tubing collegato alla siringa con acqua deionizzata. Assicurarsi che non vi è alcuna bolla d&#39;aria. </li><li> Inserire il tubo nel foro della camera di flusso sigillato con colla epossidica. </li><li> Mettere una punta gialla (200 microlitri punta), dall&#39;altro foro come un serbatoio. </li></ol> 4. Esempio Caricamento in camera di flusso Nota: neutravidina può essere sostituito con altre proteine ​​avidina come streptavidina. Tutte le reazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente, che sono menzionate. Prendere soluzione campione in una punta di colore giallo, e installare la punta con la soluzione sul foro del supporto acrilico (Figura 2b). <ol><li> Impostare la portata della pompa a siringa a 50 ml / min. Carico 20 ml di proteina avidina (25 ug / ml in soluzione T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e tenerlo per 10 min. </li><li> Carico 20 l di oligonucleotidi biotinilati (100 micron di 1 × TE), e tenerlo per 10 minuti. Se si utilizza transferasi terminale, saltare il caricodi oligonucleotidi. </li><li> Carico 20 ml di soluzione di DNA dal punto 1 nella camera di flusso ad una portata di 10 ml / min, e tenerlo per 30 min. </li><li> Lavare la camera di flusso con 1 × TE, e caricare 40 ml di FP-DBP 10 (~ 80 Nm). </li><li> Osservare DNA sotto un microscopio a fluorescenza con flusso continuo di molecole di colorazione in 1 × TE su una lente obiettivo 60X. Utilizzare 488 nm laser a stato solido per l&#39;eccitazione di FP (eGFP) -DBP. Per la piena tratto di molecole di DNA, si applicano diverse portate a seconda delle lunghezze di DNA utilizzati. Ad esempio, applicare 50 microlitri / min 48,5 kbp di DNA λ, e 100 microlitri / min per 166 kbp di T4 DNA. <ol><li> Per il riciclaggio del titolare acrilico, immergere camere a flusso assemblati in una soluzione detergente per la casa 12. Rimuovere nastri e resina epossidica con una lama di rasoio e strofinare con le mani per prendere completamente fuori. Sbloccare fori con aghi da siringa. Mantenere i titolari in acqua deionizzata fino a nuovo uso. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui vi presentiamo una piattaforma per la visualizzazione di molecole di DNA lunghe biotinilati per l&#39;ancoraggio sulle superfici. Abbiamo riportato un approccio per molecole di DNA impastoiati su una superficie rivestita proteina avidina con biotinilato albumina sierica bovina. 6 Nell&#39;approccio in precedenza, abbiamo trovato una questione cruciale del DNA foto-scissione causata da coloranti bis-intercalazione che macchiano molecole di DNA legato alla superficie. Poiché questi fluorofori continuamente...

La visualizzazione di grandi molecole di DNA impastoiati sulle superfici di vetro o perline è stato utilizzato per lo studio delle interazioni DNA-proteina, la dinamica delle proteine ​​su substrato di DNA, 1,2 e fisica dei polimeri. 3,4 Una piattaforma per le grandi molecole di DNA a singolo tethered ha pochi distinta vantaggi rispetto ad altri metodi di immobilizzazione DNA. 5 primo, una grande molecola di DNA legato sulla superficie ha una naturale conformazione random coil senza un flusso di taglio, che è criticamente importante per una proteina di legame al DNA di riconoscere suo sito di legame. In secondo luogo, è molto facile cambiare l&#39;ambiente chimico intorno molecole di DNA per una serie di reazioni enzimatiche in una camera di flusso. In terzo luogo, un flusso di taglio microfluidico induce DNA molecolare estende fino al 100% della lunghezza del profilo completo, che è molto difficile da ottenere con allungamento DNA approcci alternativi come superficie di immobilizzazione 6 e nanochannel confinamento. 7 Un completamente stretched molecola di DNA fornisce anche informazioni di posizione che può essere utile per il controllo dei movimenti enzimatici sulla mappa genomica. Tuttavia, l&#39;approccio tethering DNA ha una lacuna critica che tintura del intercalante come YOYO-1 provoca generalmente molecole di DNA legato ad essere facilmente rotto dalla luce di fluorescenza di eccitazione. Generalmente, grandi molecole di DNA devono essere colorato con un colorante fluorescente per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. A questo scopo, YOYO-1 o altri coloranti della serie TOTO sono utilizzati principalmente perché questi coloranti fluorescenti solo quando intercalare DNA a doppia elica. 8 Tuttavia, è ben noto che bis intercalanti colorante provoca DNA indotta dalla luce foto-scissione, perché della intercalazione di fluorofori. 9 Inoltre, molecole di DNA fluorescente macchiate impastoiati in superficie sono più fragili in quanto i flussi di taglio possono esercitare rottura forze sul liberi di muoversi molecole di DNA. Pertanto, abbiamo sviluppato FP-DBP come un romanzo Ddye proteina NA-colorazione per l&#39;imaging di grandi molecole di DNA impastoiati in superficie. Il vantaggio di utilizzare FP-DBP è che non provoca foto-scissione delle molecole di DNA a cui si lega. 10 Inoltre, FP-DBP non aumenta la lunghezza del profilo del DNA, mentre bis-intercalanti coloranti aumentano la lunghezza del profilo di circa il 33%. Questo metodo di video introduce l&#39;approccio sperimentale per legare grandi molecole di DNA ad una superficie PEG-biotina. La Figura 1 illustra i diversi approcci di legare il DNA con estremità smussata ed estremità appiccicose. Così, questo metodo di colorazione può essere applicato a qualsiasi tipo di molecola di DNA. La Figura 2 illustra una rappresentazione schematica del gruppo camera di flusso che può essere controllata da una pompa a siringa per generare flussi di taglio per allungare molecole di DNA e per caricare chimica ed enzimatica soluzioni. la figura 3 mostra micrografie di molecole di DNA completamente allungato impastoiati sul PEGylatdi superficie ed 11 e colorati con FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

La Figura 1 mostra due diversi metodi tethering DNA seconda strutture terminali della molecola di DNA. Figura 1a illustra come i appiccicose molecole di DNA ended sono ibridate con oligonucleotidi biotinilati complementari, che sono immobilizzati sulla superficie PEG avidina-rivestita. Figura 1b mostra l&#39;aggiunta di biotinilato ddNTP o dNTP al gruppo idrossilico 3 &#39;di un DNA ended smussato da transferasi terminale. Abbiamo aggiun...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Video: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Ricerca

Biochimica

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetica

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunologia e infezioni

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Biologia

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Ricostituzione nucleosomiale in situ per studi su singole molecole

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ricostituzione efficiente dei nucleosomi per tecniche a singola molecola

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>Svolgimento del DNA mediato da CMG osservato dalla crescita del tratto ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Svelare le dinamiche della replicazione del DNA eucariotico attraverso la visualizzazione di una singola molecola

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati singola molecola di monitoraggio

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati singola molecola di monitoraggio