This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA 바이오 티 닐화 <ol><li> 터미널 트랜스퍼하여 블런트 엔드 DNA의 바이오 티 닐화 (TDT) 참고 : 무딘 엔드 DNA이다 사용 T4 DNA (166 KBP)를. <ol><li> 2.5 밀리미터의의 CoCl2, 10 × 반응 버퍼의 5 μL, 10 mM의 비오틴-11-dUTP를 0.5 μL, 터미널 전이 0.5 μL (10 대), 및 T4 DNA의 0.5 μL (0.5 μg의 / μL)을 5 μl를 추가 반응 혼합물에 관한 것이다. 물 38.5 μL를 첨가하여 50 ㎕의 최종 부피로 만든다. </li><li> 1 시간 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 주의 : 연장 반응 시간, 즉 이중 닿는 DNA를 얻을 수 있고, biotins이 양단 태그 것이 가능하다. </li><li> 0.5 M EDTA, pH가 8의 5 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. </li><li> 4 ° C에서 튜브를 유지합니다. </li></ol></li><li> DNA 리가 제를 사용하여 접착 종단 DNA의 바이오 티 닐화 참고 : 끈적 엔드 DNA이다 사용 λ DNA (48.5 KBP). &lt;올&gt; <li> T4 DNA 리가 아제의 1 μL, 10 × 내고 버퍼의 5 μl를 25 ng의 1 μl를 추가 / λ 파지 DNA μL, 50 μL의 최종 부피를 만들기 위해 물을 43 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 튜브를 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 기능화 표면 유도체 화 주 :.도 1에 도시 된 바와 같이 유리 표면에 DNA 분자의 말단 밧줄하기 위해, 차 아민기를 바이오틴 PEG 코팅 하였다 커버 슬립에 실란 화되고 이는 PEG 화 과정은 단일 분자 DNA 이미징에 중요한 그 때문에 크게 표면에 원하지 않는 분자의 부착에 의해 생성 된 랜덤 노이즈를 감소시킬 수있다. <ol><li> 피라냐 청소 참고 : 피라냐 솔루션 따라서는 적절한 안전 지침에 따라주의하여 취급해야한다, 유기 물질과 격렬하게 반응한다. <ol><li> 장소는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 랙 된 커버, 및 B을 길게Y PTFE 길이 스레드 인감 테이프, 랙에 표면의 가장자리 반에 반. 래핑 후, 세정 과정에서 랙을 처리 테이프의 긴 조각 (~ 5cm)를 떠난다. </li><li> SO H 2 O 2의 4, 150 ml의 흄 후드에서 피라 솔루션을 만들기 위해 H 2의 350 ml의 1 L의 유리 비커를 입력합니다. 2 시간 동안 피라냐 용액에 선반을 두십시오. </li><li> 비커에서의 pH까지 탈 이온수로 철저하게 빈 비커에서 피라 솔루션 및 린스 된 커버는 중립에 도달한다. 산도 종이 스트립을 사용합니다. </li><li> 30 분 동안 비이커에서 물을 함유 커버 슬립의 랙 초음파 처리. 비커에서 불과 아미노 실란 화하기 전에 빈 물. 유리 기판 청소 및 유도체 화하는 초음파 전력 75 W를 사용합니다. </li></ol></li><li> 유리 표면에 Aminosilanization <ol><li> N 2 ㎖를 추가 - [3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필] 에틸렌 디아민, 200 mL의 빙초산 10 ㎖aminosilanization 용액을 제조 깨끗한 폴리 프로필렌 용기에 메틸 알콜. </li><li> 폴리 프로필렌 용기에 세척 된 커버를 놓습니다. 30 분 동안 100 rpm으로 실온에서 그들을 흔들어. </li><li> W. 적어도 30 분 동안 100 rpm으로 실온에서 그들을 흔들어 75에서 15 분 동안 유도 된 커버 슬립으로 비이커를 초음파 처리. </li><li> 에틸 알코올로 두 번 비커에서 솔루션을 비우기, 메틸 알코올로 한번 신중 된 커버를 세척합니다. 저장 에틸 알콜 된 커버와 2 주 내에서 사용합니다. </li></ol></li><li> 커버 슬립의 PEG 화 <ol><li> 0.1 M 중탄산 나트륨 10 ㎖ (의 NaHCO3)을 만든다. 0.22 μm의 주사기 필터 솔루션 필터. </li><li> 비오틴-PEG 숙신 카보네이트 (비오틴-PEG-SC)과의 NaHCO3 350 μL에 PEG 숙신 발레 레이트 80 mg의 (MPEG-SVG)의 2 mg을 녹이고. 가벼운 보호 튜브를 사용합니다. </li><li> 1 적극적으로 튜브를 와동0 초 원심 분리는 1 분 거품을 제거하는 10,000 × g에서. </li><li> 에틸 알콜로 세척 한 다음 아세톤 유리 슬라이드를 헹군다. 공기 슬라이드가 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 유리 슬라이드에 PEG 용액의 방울 (50 μl를) 놓습니다. 모든 거품을 생성하지 않고, 아미노 실란 화 커버 슬립으로 부드럽게 방울을 커버. </li><li> 3 시간 동안 장소 슬라이드 밤새 어둠 속에서, 실온에서 습기 챔버를 잘 평준화합니다. 바닥에 물 챔버로 빈 피펫 팁 홀더를 사용합니다. 튜브에 잔류 PEG 용액을 밀봉하고 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수로 철저하게 PEG 화 coverslip에 린스. 사용할 때까지 어둡고 건조한 장소에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 유량 용기를 조립 <ol><li> .도 2에서와 같이, 펀칭 아크릴 홀더를 제작 튜브 인서트의 직경이 0.762 mm 인 것을 확인하고 하나의 구멍 입구 인 지정 다른 것은출구 (그림 2). </li><li> 모든 채널에 구멍을 교란하지, 입구와 출구 구멍에 수직으로 정렬 양면 접착 테이프 스트립 아크릴 홀더 (폭 5-6mm) (그림 2)를 놓습니다. 멀티 채널 벽 챔버를 만들기 위해 이러한 테이프 스트립을 사용합니다. 피펫 팁을 사용하여 테이프를 스크럽. </li><li> 인쇄면이 밑으로 가도록 PEG 화면이 흐름 챔버를 만들기 위해 상단에 PEG 화 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 누출되는 모든 솔루션을 방지하기 위해 양면 테이프가 배치되는 지역을 통해 커버 슬립의 상단을 누릅니다. 상단 및 하단 (그림 2 노란색)에서 챔버의 가장자리를 닫습니다 속건 에폭시 접착제를 추가합니다. </li><li> 기밀 주사기에 튜브 (외경, OD, 0.042 &quot;)의 짧은 조각 (2.5 cm)를 연결하고 에폭시 접착제와 공동 인감. </li><li> 주사기에 연결된 튜브와 에폭시 접착제와 공동 밀봉 : 긴 유연한 튜브 (0.03 &quot;OD)을 연결합니다. </li><li> TUBI 채우기NG는 DI 워터와 주사기에 연결. 공기 거품이없는 것을 확인합니다. </li><li> 에폭시 접착제로 밀봉 유량 용기의 구멍에 튜브를 삽입합니다. </li><li> 저수지와 다른 구멍에 노란색 팁 (200 μL 팁)을 놓습니다. </li></ol> 유량 용기에 4 샘플로드 주 : 뉴트라 비딘는 스트렙 아비딘과 같은 다른 단백질로 대체 될 수있다. 이 언급하지 않는 한 모든 반응을 실온에서 수행 될 수있다. 노란색 끝에서 시료 용액을 가지고, 아크릴 홀더 (그림 2b)의 구멍에 솔루션과 팁을 설치합니다. <ol><li> / min로 50 μL로 시린지 펌프의 유량을 설정한다. 로드 아비딘 단백질의 20 μL (T50 용액 25 μg의 / ㎖, 10 mM의 트리스, 50 mM의 염화나트륨, pH가 8), 10 분 동안 유지. </li><li> 로드 (20) 비오틴 올리고 데 옥시 뉴클레오티드의 μL (1 × TE 100 μM), 10 분 동안 유지. 터미널 트랜스퍼가 사용되는 경우,로드를 건너올리고 데 옥시 뉴클레오티드의. </li><li> 부하 (20) 10 μL / 분의 유속으로 유동 챔버로 1 단계의 DNA 용액 μL, 30 분 동안 유지. </li><li> 1 × TE와 유량 용기를 세척하고, FP-DBP (10) (~ 80 nm의) 40 μl를로드합니다. </li><li> 60X 대물 렌즈에 1 × TE에서 염색 분자의 연속적인 흐름과 형광 현미경으로 DNA를 관찰한다. FP (eGFP는) -DBP의 여기에 대한 488 nm의 고체 레이저를 사용합니다. DNA 분자의 전체 신장을 위해 사용되는 DNA의 길이에 따라 서로 다른 유속을 적용한다. 예를 들어, T4 DNA의 166 KBP에 대한 λ DNA의 48.5 KBP, 100 μL / 분 동안 50 μL / 분을 적용합니다. <ol><li> 아크릴 홀더의 재활용, 가정용 세제 (12)에 조립 흐름 챔버를 흡수. 완전히 벗고 손으로 면도날과 마찰와 테이프와 에폭시를 제거합니다. 주사기 바늘 구멍을 방해를 없애기. 더 사용할 때까지 탈 이온수의 소유자를 유지합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 우리가 표면에 고정을 위해 비오틴 긴 DNA 분자를 시각화 플랫폼을 제시한다. 우리는 바이오틴 소 혈청 알부민과 아비딘 단백질이 코팅 된 표면에 닿는 DNA 분자에 대한 접근 방식. 6 이전 방법에서보고, 우리는에 닿는 DNA 분자를 얼룩 비스 - 인터 염료에 의한 DNA의 사진 분열의 중요한 문제를 발견 표면. 이러한 지속적 여기 형광체는 여기 광 전력이 광 분열을 방지하기 위해 최소화?...

유리 구슬 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 시각화 DNA 기판 1,2- 고분자 물리학 DNA - 단백질 상호 작용, 단백질 역학 조사에 이용되었다. 3,4- 단일 닿는 큰 DNA 분자를위한 플랫폼 구별 몇 갖는다 이점, 다른 DNA의 고정화 방법으로 비교 하였다. (5) 우선, 표면에 닿는 큰 DNA 분자의 결합 부위를 인식하는 DNA 결합 단백질에 대한 중요하다 전단 흐름없이 자연스러운 임의 코일 형태를 갖는다. 둘째, 유동 챔버에서 일련의 효소 반응에 대한 DNA 분자 주위의 화학적 환경을 변경하는 것은 매우 쉽다. 셋째, 미세 유체 전단 흐름 대안 DNA 신장을 사용하여 달성하는 것은 매우 어렵다 전체 윤곽 길이의 100 %까지 연신 분자량 DNA는 표면 고정화 6 및 나노 채널 가둠으로 접근 유도한다.도 7a stretche 완전히D DNA 분자는 게놈지도에서 효소의 움직임을 모니터링하는 데 유용 할 수의 위치 정보를 제공한다. 그럼에도 불구하고, DNA 테 더링 방식은 YOYO-1은 일반적으로 닿는 DNA 분자가 용이 형광 여기 광에 의해 파손되게로서 그 인터 염료의 중요한 단점을 갖는다. 일반적으로, 많은 DNA 분자는 형광 현미경 시각화 형광 염료로 염색 될 수있다. 이를 위해, YOYO-1 또는 다른 TOTO 계 염료는 이중 가닥 DNA를 층간 삽입 할 때 이러한 염료 만 형광 때문에 주로 사용된다. (8) 단, 비스 인터 염료 광 - 유도 DNA의 광 분열로 인해 발생하는 것이 잘 알려져 형광체의 인터. 9 항, 표면에 닿는 형광 염색 DNA 분자는 전단 흐름이 자유롭게 DNA 분자 이동에 힘을 깨고 발휘할 수 있기 때문에 더 약하고. 따라서, 우리는 새로운 D-FP로 DBP 개발표면에 닿는 큰 DNA 분자 이미징 NA 단백질 염색 염료. FP-DBP를 사용하는 이점은 그것이 바인딩하는 DNA 분자의 광 분열이 발생하지 않는다는 것이다. (10) 또한 비스 인터 염료 윤곽 길이를 증가하면서, FP-DBP는 DNA의 윤곽 길이가 증가하지 않는다 약 33 % 정도. 이 비디오 방법은 PEG-비오틴 표면에 큰 DNA 분자를 테 더링에 대한 실험 방법을 소개합니다. (1) 평활 말단 스티커 끝으로 DNA를 테 더링의 서로 다른 접근 방식을 보여줍니다. 따라서, 이러한 착색 방법은 DNA 분자의 모든 유형에 적용 할 수있다. 2 DNA 분자를 늘릴뿐만 아니라 화학적 및 효소를로드하는 전단 흐름을 생성하기 위해 주사기 펌프에 의해 제어 될 수 유량 용기 조립체의 개략적 인 표현을 도시 한 도표 솔루션을 제공합니다. 그림 3은 PEGylat에 닿는 완전히 뻗어 DNA 분자의 현미경 사진을 보여줍니다에드면 (11) 및 FP-DBP로 염색.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

도 1은도 1b도.도 1a는 스티키 종단 DNA 분자가 아비딘 코팅 된 PEG 상에 고정화 상보 오티 닐화 올리고 뉴클레오티드 혼성화 방법을 도시한다. DNA 분자의 말단 구조에 따라 두 개의 서로 다른 DNA 테 더링 방법을 도시의 첨가를 보여준다 바이오틴 어떤 ddNTP 또는 터미널 전이에 의해 무딘 엔드 DNA의 3 &#39;히드 록실 그룹의 dNTP. ...

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Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Biology

10.7K 조회수.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

연구

생화학

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

유전학

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

면역학 및 감염병학

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

생물학

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

생체공학

<meta charset="utf8"></head><body>단일 분자 연구를 위한 현장 뉴클레오솜 재구성

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Efficient Nucleosome Reconstitution for Single-Molecule Techniques

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Tract Growth에서 관찰된 CMG 매개 DNA 풀기

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Dynamics of Eukaryotic DNA Replication Through Single-Molecule Visualization (단일 분자 시각화를 통한 진핵생물 DNA 복제의 역학 규명)

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

요약

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마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화