This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation של DNA חוד מעוגל באמצעות מסוף transferase (TDT) הערה: השתמש T4 DNA (166 KBP), שהינה DNA חוד מעוגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 2.5 מ&quot;מ 2 CoCl, 5 μl של 10 × חיץ התגובה, 0.5 μl של 10 מ&quot;מ ביוטין-11-dUTP, 0.5 μl של transferase הטרמינל (10 יחידות), ו -0.5 μl של ה- DNA T4 (0.5 מיקרוגרם / μl) לתערובת התגובה. הפוך לנפח סופי של 50 μl ידי הוספת 38.5 μl של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. הערה: זמן תגובה מורחבת עשוי להניב הדנ&quot;א הדו-קשור, כלומר, יתכן כי biotins מתויג בשני קצותיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ &#39;EDTA, pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylation של DNA הסתיימה דביק שימוש DNA האנזים הערה: DNA λ השתמש (48.5 KBP), שהינה DNA דביק-סוף. &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של ה- DNA האנזים T4, 5 μl של חיץ קשירת 10 ×, 1 μl של 25 ng / μl DNA הפאג λ, ולהוסיף 43 μl של מים כדי ליצור נפח סופי של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. derivatization Surface הפונקציונלי הערה:. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ&quot;א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1 תהליך PEGylation זה חשוב הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין אקראי רעש נוצר על ידי התקשרות של רצויי מולקולות משמעותיים על פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיראנה ניקוי הערה: פתרונות פיראנה להגיב נמרצות עם חומרים אורגניים, ולכן זה צריך להיות מטופל בזהירות, עמידה בהנחיות בטיחות נאותה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips על מדף polytetrafluoroethylene (PTFE), ולהחזיק אותם בy PTFE חותם חוט קלטת לאורכו, חצי על קצה משטחים וחצי על המדף. לאחר גלישה, להשאיר חתיכה ארוכה (~ 5 סנטימטרים) של סרט לטיפול המתל במהלך הליך הניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס זכוכית 1 ליטר עם 350 מ&quot;ל של H 2 SO 4 ו -150 מ&quot;ל של H 2 O 2 כדי להפוך פתרון פיראניה במנדף. מניחים את מתלה בתמיסה פיראניה במשך שעה 2.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פיראניה ריק מן הקנקן, ולשטוף coverslips ביסודיות עם מים ללא יונים עד pH של המים בכוס מגיע נייטרלי. השתמש רצועות נייר pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate המדפים של תלושים לכסות במים המכילים המבחנה, למשך 30 דקות. מים ריקים מהקנקן רק לפני silanization אמינו. השתמש 75 ואט sonication לנקות derivatize מצעי הזכוכית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aminosilanization על משטח זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine ו -10 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית 200 מ&quot;לשל מתיל אלכוהול במיכל פוליפרופילן נקי להכנת הפתרון aminosilanization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslips לנקות בתוך המיכל פוליפרופילן. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל&quot;ד ו החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate כוס עם מכסה מחליק derivatized במשך 15 דקות ב 75 W. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל&quot;ד ו מקום לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את הפתרון מן הקנקן, ולשטוף coverslips בזהירות, פעם עם אלכוהול מתיל, ופעמיים עם כוהל אתילי. coverslips אחסן כוהל אתילי ולהשתמש בהם תוך שבועיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PEGylation של coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 10 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;סודיום ביקרבונט (NaHCO 3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2 מ&quot;ג של קרבונט ביוטין-PEG-succinimidyl (ביוטין-PEG-SC) ו -80 מ&quot;ג של valerate PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) ב 350 μl של NaHCO 3. השתמש צינור הגנת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינור נמרצות במשך 10 שניות, צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × דקות 1 כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון, ואחריו שטיפה עם כוהל אתילי. אפשר את השקופית אוויר יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ירידה (50 μl) של פתרון PEG בשקופית הזכוכית הנקיה. מכסים את אגל בעדינות עם תלוש כיסוי silanized אמינו, מבלי ליצור בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית עבור 3 שעות עד לילה חשוך, גם מפולס בתא לח בטמפרטורת חדר. השתמש בעל קצה פיפטה וריק כמו התא, עם מים בתחתית. חותם פתרון PEG שיורית בצינור ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslip PEGylated ביסודיות עם מים ללא יונים. אחסן אותו במקום חשוך ויבש עד השימוש. </li></ol></li></ol> 3. הרכבת תא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק בעל אקריליק אגרוף, כמו באיור 2. ודא בקוטר של להכניס צינורות הוא 0.762 מ&quot;מ, וציין חור אחד הוא מפרץ קטן והשני הואלשקע (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רצועות סרט דביקות דו-צדדיות (רוחב 5-6 מ&quot;מ) על בעל אקריליק (איור 2), יישור בניצב חור כניסה ויציאה, לא מביך כל חורי ערוץ. השתמש רצועות קלטת אלה קירות רב ערוצית לעשות תאים. שפשפו את הקלטת באמצעות קצה pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip PEGylated על העליונה כדי ליצור תאי זרימה, כשהצד PEGylated עם הפנים כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע כל פתרון דליפה, לחץ על החלק העליון של coverslip על האזור שבו קלטות דו צדדית ממוקמות. להוסיף דבק אפוקסי מהיר יבש כדי לסגור את הקצוות של החדר בראש בתחתית (צבע צהוב באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קטע קצר (2.5 ס&quot;מ) של צינורות (קוטר חיצוני, OD, 0.042 &quot;) כדי מזרק חזק גז ולאטום המפרק עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות (OD: 0.03 &quot;) ארוכים וגמישים אל הצינורות צמודים המזרק ולאטום מפרק עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הטוביםng צמוד מזרק עם מים די. ודא שאין בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצינור לתוך החור של תא הזרימה חתום עם דבק אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפ צהוב (200 קצה μl) על החור אחרים כמאגר. </li></ol> 4. טוענים דוגמא אל לשכת התזרים הערה: Neutravidin ניתן להחליף חלבונים avidin אחרים כגון streptavidin. כל התגובות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם כן היא מוזכרת. קח פתרון מדגם טיפ צהוב, ולהתקין את הקצה עם הפתרון לתוך החור של בעל אקריליק (איור 2b). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מזרק ב 50 μl / min. טען 20 μl של חלבון avidin (25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתמיסה T50, טריס 10 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 8), ולשמור אותו במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של oligodeoxynucleotides biotinylated (100 מיקרומטר 1 × TE), ולשמור אותו במשך 10 דקות. אם transferase הטרמינל משמש, לדלג על הטעינהשל oligodeoxynucleotides. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של פתרון ה- DNA משלב 1 לתוך תא זרימה בקצב זרימה של 10 μl / min, ולשמור אותו במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את תא הזרימה עם 1 × TE, ולטעון 40 μl של 10 FP-DBP (~ 80 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זרימה רציפה של מולקולות מכתימות ב 1 × TE על עדשה אובייקטיבית 60X. השתמש 488 לייזר מצב מוצק ננומטר עירור של FP (eGFP) -DBP. עבור מתיחה מלאה של מולקולות DNA, להחיל ספיקות שונות לפי אורכי DNA בשימוש. לדוגמה, להחיל 50 μl / min 48.5 KBP של DNA λ, ו 100 μl / min 166 KBP של דנ&quot;א T4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מחזור של בעל אקריליק, להשרות תאי זרימה התאספו בתמיסת דטרגנט בית 12. הסר קלטות אפוקסי עם סכין גילוח ולשפשף עם ידות כדי לקחת אותם לגמרי. סתימה חורה עם מחטי מזרק. שמור על הבעלים במי deionized עד לשימוש נוסף. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מציגים פלטפורמה המאפשר הדמיה מולקולות דנ&quot;א ארוכות biotinylated לעיגון על משטחים. דיווחנו גישה עבור מולקולות DNA קשור על משטח מצופה חלבון avidin עם אלבומין בסרום שור biotinylated. 6 לפי הגישה קודם לכן, מצאנו נושא מכריע של מחשוף צילום DNA הנגרם על ידי צבעי bis-העיבור כי להכ?...

ויזואליזציה של מולקולות דנ&quot;א גדולות קשורות ברצועה על משטחי זכוכית או חרוז נוצלה על חקירת אינטראקציות חלבון דנ&quot;א, דינמיקת חלבון על מצע DNA, 1,2 ופיזיקת פולימר. 3,4 פלטפורמת מולקולות דנ&quot;א גדולות יחידות קשורות יש כמה ברור יתרונות בהשוואה לשיטות וקיבוע DNA אחרים. 5 ראשית, מולקולת דנ&quot;א גדולה הקשורה על פני השטח יש קונפורמציה טבעי אקראי סליל ללא אספקת גזירה, מהם החשיבות מכרעת עבור חלבון-DNA מחייבת להכיר אתר הקישור שלו. שנית, זה מאוד קל לשנות את הסביבה הכימית סביב מולקולות DNA לסדרת תגובות אנזימטיות בתא זרימה. שלישית, זרימת גזירת microfluidic גורמת DNA המולקולרית המתיח עד 100% של אורך המסלול המלא, וזה מאוד קשה להשיג באמצעות התארכות DNA גישות חלופית כגון משטח וקיבוע 6 וכליאת nanochannel. 7 מלא stretcheמולקולת הדנ&quot;א ד גם מספקת מידע מיקומית כי יכול להיות שימושי עבור ניטור תנועות האנזימטית על המפה הגנומי. אף על פי כן, גישת קשירת DNA יש חסרון קריטי כי לצבוע intercalating כגון YOYO-1 בדרך כלל גורם למולקולות DNA קשורות להישבר בקלות על ידי אור עירור קרינה. באופן כללי, מולקולות דנ&quot;א גדולות צריכות להיות מוכתמות עם פלורסנט לצבוע להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך, YOYO-1 או צבעי סדרת הטוטו אחרים משמשים בעיקר בגלל צבעים אלה לזרוח רק כשהם intercalate פעמיים גדילי דנ&quot;א. 8 עם זאת, ידוע כי bis-intercalating לצבוע גורם צילום מחשוף DNA האור הנגרמת בגלל של עיבור fluorophores. 9 יתר על כן, מולקולות DNA מוכתמות fluorescently הקשור על פני השטח הן יותר שבירות מאז תזרים גזירה יכול להפעיל שבירת כוחות על העברת מולקולות DNA באופן חופשי. לכן, פיתחנו FP-DBP כרומן DNA-מכתים חלבון לצבוע הדמית מולקולות דנ&quot;א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח. היתרון של שימוש FP-DBP הוא שזה לא לגרום צילום מחשוף של מולקולות DNA שאליו הוא נקשר. 10 בנוסף, FP-DBP אינה מגדילה את אורך קווי המתאר של ה- DNA, ואילו צבעים-intercalating bis להגדיל את אורך המסלול בכ -33%. שיטת וידאו זה מציגה את הגישה ניסיון אולי לקשירת מולקולות דנ&quot;א גדולות משטח PEG-ביוטין. איור 1 מדגים גישות שונות של קשירת DNA עם קצוות בוטים קצוות דביקים. לכן, שיטה מכתימה זה יכול להיות מיושמת על כל סוג של מולקולת הדנ&quot;א. איור 2 מתאר ייצוג סכמטי של הרכבת תא הזרימה שיכולה להיות נשלטה על ידי משאבת מזרק כדי ליצור תזרים גזירה למתוח מולקולות דנ&quot;א וכן לטעון כימיים אנזים פתרונות. איור 3 מדגים micrographs של מולקולות DNA נמתח מלא קשורה על PEGylatמשטח ed 11 ומוכתם FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

איור 1 מציג שתי שיטות קשירת DNA שונות בהתאם מבני מסוף של מולקולת הדנ&quot;א. האיור 1 א ממחיש כיצד מולקולות DNA הסתיימו הדביקות הם הכלאה עם oligonucleotides biotinylated משלים, אשר משותק על פני שטח PEG מצופה avidin. 1B איור מראה תוספת של biotinylated ddNTP או d...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide at JoVE.com

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Video: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Biochemistry

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetics

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunology and Infection

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>In Situ Nucleosome Reconstitution for Single-Molecule Studies

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הרכבה מחדש יעילה של נוקלאוזומים עבור טכניקות של מולקולה בודדת

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>התרת DNA בתיווך CMG שנצפתה על ידי צמיחת דרכי ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של שכפול דנ"א אאוקריוטי באמצעות הדמיה של מולקולה אחת

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG