Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. Clonagem do tipo selvagem marcada com tdTomato e sem motor KIF5B Proteínas <ol><li> Amplificar o ADNc para a de tipo selvagem humano e proteínas KIF5B sem motor, utilizando os iniciadores na Tabela 1, a polimerase de ADN de Taq (5 unidades por 100 jil), mistura de dNTP (2 mM de cada desoxinucleótido) e o seu tampão 10X durante 30 ciclos. Cada ciclo consiste num passo de desnaturação (95 ° C durante 30 seg), um passo de recozimento (45 ° C durante 30 seg) e um passo de extensão (72 ° C durante 3 min). </li><li> Extrair o produto de ADN amplificado com igual volume de fenol / clorofórmio (1: 1). Nota: O fenol é combustível e pode causar queimaduras. O clorofórmio é perigoso. Evitar o contato direto com eles e usá-los sob uma coifa química. Alternativamente, os produtos de PCR podem ser purificados por vários kits. <ol><li> Girar a 18.000 x g numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 1 min. Transferir a solução aquosa para um novo tubo e extrai-se com um volume igual de clorofórmio. </li><li> Girara 18000 xg numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 0,5 min. Transferir a solução aquosa para um novo tubo. </li><li> Misture a solução aquosa com um décimo de volume de 3 M de acetato de Na e dois volumes de etanol absoluto. </li><li> Girar a 18.000 x g numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar a solução aquosa. </li><li> Lava-se a pelete de ADN com dois volumes de etanol a 75%. Descartar a solução aquosa e o ar seco o sedimento de DNA à temperatura ambiente durante 5 min. Ressuspender o sedimento de ADN em 34 ul de água. </li></ol></li><li> Digerir os produtos amplificados num volume final de 40 ul com as enzimas de restrição Sall (10 unidades) e BamHI (10 unidades) e 4 pi de tampão 10X sua a 37 ° C durante duas horas. Resolver os produtos digeridos em um gel de agarose (1,0% a 100 V) contendo brometo de etídio (0,2 ug / ml). Nota: O brometo de etídio é um agente mutagênico potente e pode ser absorvido pela pele. Portanto, é importante para evitar o contacto directo ou indirecto wom de brometo de etídio. </li><li> Cortar as faixas corretas para purificação por colunas. Pesa-se o gel de agarose contendo o fragmento de ADN. Em seguida, dissolvê-lo no tampão de solubilização (300 ul de 0,1 g) a 37 ° C durante cerca de 20 min. </li><li> Adicionar a solução resultante para uma coluna e centrifugação numa microcentrífuga à temperatura ambiente durante 5 seg. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Lavar a coluna com 0,5 ml de tampão de solubilização, repetindo o passo 1.5. Lava-se a coluna outra vez com 0,75 ml de tampão de lavagem repetindo o passo 1.5. Girar a coluna por 2 min para se livrar do tampão de lavagem restante. </li><li> Eluir o fragmento de DNA com 50 ul de água repetindo o passo 1.5. Estimar a concentração do fragmento de ADN, executando-se uma alíquota do mesmo tamanho contra uma escada de ADN num gel de agarose (1,0% a 100 V) contendo brometo de etídio (0,2 ug / ml). </li><li> Ligadura dos produtos purificados (cerca de 100 ng) com o vector ptdTomato-C1 17 (cerca de 100 ng) previamente digerido com the mesmo as enzimas de restrição em 10 ul usando DNA ligase de T4 (2000 unidades) e 1 ul de tampão de ligação 10X, à temperatura ambiente durante 16 h. Nota: A de tipo selvagem e mutante motorless contém os aminoácidos de 2 a 963 e 584-963, respectivamente. Anteriormente, a maior mutante KIF5B motorless foi usado para identificar a sua função 9. Um menor mutante KIF5B motorless foi utilizado para os presentes estudos para aumentar os seus níveis de expressão. </li></ol> 2. Imunofluorescência Microscopia <ol><li> Para-de células vivas ou imagens de fluorescência indirecta com a ampliação igual ou inferior a 40X, sementes 0,2-0,3 milhões de células HeLa em 1 ml de meio completo [por Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro fetal bovino a 10% (FBS)] em cada poço de uma placa de seis poços. Crescer a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Para os estudos de imunofluorescência indireta com ampliações acima de 40X, lavar copos de cobertura (18 mm x 18 mm; 1,5 espessura) em breve etanol absoluto e ar secá-las emos poços de uma placa de seis poços, dentro de uma cabine de segurança biológica para evitar a contaminação. <ol><li> Semente 0,2-0,3 milhões de células em 1 ml de meio completo DMEM em cada poço de uma placa de seis poços. </li></ol></li><li> Preparação do Complexo Transfecção <ol><li> No dia seguinte, dentro de uma cabine de segurança biológica, dilui-se 0,6 ug (total) do plasmídeo de expressão para tdTomato-etiquetado de tipo selvagem ou KIF5B motorless na presença ou ausência de um plasmídeo de expressão para uma proteína candidata carga (pTagCFP-c-Myc 5 ) com 0,1 ml de meio de transfecção de um tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. Nota: O vector pTagCFP-c-Myc expressa a TagCFP marcada com c-myc. </li><li> Adicionar 1,8 mL do reagente de transfecção para 0,1 ml de meio de transfecção de um outro tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. Normalmente, preparar uma mistura principal de reagente de transfecção suficientemente diluído para 12 amostras. </li><li> Incubar durante 5 min, à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a 0,1 ml de reagente diluído transfecção para as diluído 0,1 ml ADNs. Mix o conteúdo, invertendo os tubos. Gire os tubos durante 5 segundos numa microcentrífuga. </li><li> Incubar durante 45 min, à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavagem das Células <ol><li> Lavam-se as células inoculadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante o período de incubação para a formação do complexo de transfecção. </li><li> Substituir o meio das células semeadas em cada poço com 0,8 ml de meio de transfecção de pré-aquecido. Devolver as placas para o incubador a 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfecção de células <ol><li> Após a incubação de 45 min, adicionar 0,2 ml do complexo de reagentes ADN / transfecção (preparado no passo 2.3) gota a gota a cada poço da placa. </li><li> Balance a placa de 6 poços suavemente durante 5 segundos, antes de serem devolvidas à incubadora a 37 ° C. </li><li> Após 6-8 h, substituir o meio com o meio DMEM completo. </li></ol></li><li> Para Em células vivas, fluorescência de imagem 18 <ol><li> Após um adicional de 16 h de incubação umat 37 ° C, adicionar o corante de ADN Hoechst 33342 intercalante ao meio a uma concentração final de 1 uM. Nota: Hoechst 33342 é, um corante intercalante de ADN de células-permeável que mancha os núcleos celulares. </li><li> Incubam-se as células transfectadas durante 10 minutos na incubadora a 37 ° C antes de examinar-los para a expressão de proteínas fluorescentes por microscopia de fluorescência usando uma objectiva de 40x. Os conjuntos de filtros para DAPI, PCP, FITC e Cy3 são (nm Ex350 / Em460 nm), (nm Ex436 / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (nm Ex545 / Em605 nm), respectivamente. Nota: Se o fundo é elevado, devido à auto-fluorescência do meio DMEM completo, o meio sem vermelho de fenol é usada. </li></ol></li></ol> 3. Para Estudos de imunofluorescência indireta <ol><li> Preparação de solução de paraformaldeído <ol><li> Pesar paraformaldeído em pó (4 g por 100 ml de PBS) e adicioná-lo ao PBS. Nota: O paraformaldeído é um sólido inflamável e um hazar potencial cancrod. Isso irrita os olhos, vias respiratórias e pele. Portanto, é importante para evitar o contacto com a inalação de ou paraformaldeído. </li><li> Adicionar NaOH à solução (150 ul de NaOH 10 N / 100 ml). </li><li> Manter a solução a 37 a 42 ° C durante 2-3 horas com agitação ocasional. </li><li> Ajustar o pH para 7,0 por adição de ácido acético glacial para a solução (cerca de 75 ul / 100 ml), após o que o pó é dissolvido paraformaldeído. </li></ol></li><li> As proteínas alvo Coloração <ol><li> Após outra incubação durante 16 horas a 37 ° C, lavar as células transfectadas à temperatura ambiente uma vez com PBS, por agitação da placa de seis poços durante 5 seg. </li><li> Fixar as células com 1 ml de preparado de fresco, solução de paraformaldeído a 4% por poço. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar as células uma vez com PBS, através de agitação durante 5 seg a placa de seis poços. Descartar a solução. </li><li> Incubam-se as células com 1 ml de 0,1% de Triton X-100 (em PBS) à temperatura ambiente durante 30 min. o detergent Triton-X 100 vai permeabilizar a membrana celular para permitir o acesso dos anticorpos aos seus alvos intracelulares. </li><li> Lavam-se as células com PBS quatro vezes por rotação da placa de seis poços durante 5 segundos de cada vez. Descartar a solução após cada lavagem. </li><li> Incubam-se as células com 1 ml de anticorpos primários (anticorpo de coelho c-myc ou de anticorpo de ratinho de p53; 0,1 ug / ml) num FBS a 10% em solução de PBS à temperatura ambiente através de balanço durante 4 h. </li><li> Lavar com PBS quatro vezes por rotação da placa de seis poços durante 5 segundos de cada vez. Descartar a solução após cada lavagem. </li><li> Incubar com 1 ml de anticorpos secundário conjugado com corante fluorescentes (Alexa Fluor anti-coelho 488-conjugado ou de anticorpo anti-IgG de rato, 0,5 ug / ml) em 10% de FBS em PBS à temperatura ambiente no escuro por balanço durante 2 h. </li><li> Lavar com PBS quatro vezes por rotação da placa de seis poços durante 5 segundos de cada vez. Descartar a solução após cada lavagem. </li></ol></li><li> A coloração nuclear e de montagem <ol><li&gt; Incubar as células com o 1 ml de corante intercalante de ADN 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 0,5 ug / ml) em PBS à temperatura ambiente, no escuro, durante 10 min. Avance para o passo 3.4, quando não havia copos de cobertura são utilizados. Nota: DAPI é um corante de intercalação de ADN que mancha os núcleos celulares. </li><li> Aplicar 10 ml de solução de montagem em cada lâmina de microscópio. Montar cada tampa de vidro através da solução de montagem sobre uma lâmina de microscópio. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante a noite no escuro. </li><li> Selar as bordas dos vidros de cobertura com unha polonês. Coloque no escuro dentro de um exaustor durante a noite para remover os fumos de esmaltes. </li></ol></li><li> A microscopia de fluorescência 19 <ol><li> No dia seguinte, examine as células por microscopia de fluorescência usando uma objetiva de 40X. Os conjuntos de filtros para DAPI, PCP, FITC e Cy3 são (nm Ex350 / Em460 nm), (nm Ex436 / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (nm Ex545 / Em605 nm), respectivamente. </li></ol></li></ol>

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publicação de acesso livre e produção deste artigo é pago pela Roche.

O método descrito utiliza as propriedades do mutante KIF5B motorless, que não tem a capacidade para se mover ao longo dos microtúbulos, mas mantém a capacidade de formar dímeros com o tipo selvagem KIF5B e, desse modo, permitir que a proteína tetramérica para interagir com as mesmas proteínas de carga como o de tipo selvagem KIF5B. KIF5B motorless, portanto, atua como um mutante negativo dominante e formas mislocalized agrega com suas cargas. Este método é comprovado para identificar a cinesina-1 de carga de c-myc (Figura 1) 5. Neste artigo, o mesmo mutante KIF5B motorless foi usada para identificar a p53 como uma outra carga potencial de cinesina-1 (Figura 2). Isto demonstra que a metodologia é possível identificar outras cargas de cinesina-1. Além disso, a especificidade do mutante é fornecido pela falta de efeito do mutante na proteína de controlo negativo c-Fos (figura 3). Neste protocolo, o tdTomato-marcado wild-tyPE ou proteína KIF5B motorless é co-expressa com outra proteína carga candidato marcado com proteína fluorescente. Neste caso, a microscopia de fluorescência de células vivas e imagens são executadas. A formação dos agregados pode ser rastreada por imagem time-lapse. Alternativamente, a proteína marcada com tdTomato é expressa por si só e a proteína candidata carga nos seus níveis fisiológicos são visualizados por microscopia de imunofluorescência indirecta utilizando anticorpos específicos. O tdTomato proteína fluorescente é escolhido para o seu brilho e fotoestabilidade 17. Se o fundo é elevado, devido à auto-fluorescência do meio DMEM completo, o meio sem vermelho de fenol é usada. O mutante KIF5B motorless forma dímeros com o tipo selvagem KIF5B estequiometricamente. Portanto, é crítica para expressar a quantidade suficiente de mutante KIF5B motorless para formar dímeros com o homólogo do tipo selvagem para inibir a sua função e para formar agregados. Para abordar esta questão, otimização de exprESSÃO do mutante motorless é essencial. Isso é conseguido através de um pequeno motorless mutante contendo o domínio de dimerização. Além disso, a optimização da transfecção do reagente apropriado e o protocolo é também necessária. A duração da incubação das células HeLa com o reagente de ADN / transf ecção foi optimizada em células HeLa para a expressão de proteínas exógenas e a viabilidade celular. A duração da incubação pode ter que ser optimizado para outras linhas de células. Para ampliações entre 4X para 40X, não usa óculos de cobertura são necessários. As células podem ser examinadas directamente nos poços. Portanto, neste caso, o protocolo é barato e conveniente. Para ampliações acima de 40X, as células são cultivadas em vidros de cobertura nos poços e, após coloração, são montadas em lâminas de microscópio para exame no âmbito dos objectivos de imersão em óleo. Observação de agregados da proteína KIF5B motorless é limitado pelo tamanho do citoplasma. É fácil de detectar oagregados em muitas células de mamíferos. No entanto, é relativamente difícil de observar os agregados de células neuronais, quando o volume do citoplasma é pequena em torno dos núcleos e em neurites. O protocolo é utilizado para mostrar a associação entre KIF5B e as suas cargas, para além do in vivo de levedura de dois híbridos e bioquímicos ensaios suspensos 13-16. Todos estes ensaios determinar a associação sob diferentes condições físicas e seus resultados podem complementar-se mutuamente. Além disso, a vantagem de este ensaio de fluorescência em relação a outros ensaios é que ele pode mostrar a regulação da localização subcelular das cargas por KIF5B (Figuras 1 e 2). O protocolo não está limitado a KIF5B e pode ser usado para identificar outras proteínas de cargas do motor, tais como alguns outros motores de cinesina 3 e alguns dos motores de miosina 23,24 utilizadas no transporte intracelular de 3 cargas. Estas proteínas do motor também contêm domínios de motor para o movimento ao longo dos microtúbulos para motores cinesina e microfilamentos para motores de miosina e segmentos em espiral espiralada para oligomerização. A maioria deles formar homodímeros 3,23. Portanto, uma estratégia semelhante pode ser aplicada a elas, criando seus mutantes dominantes negativos sem motor para identificar as suas cargas.

Cinesina-1 é uma proteína que medeia o transporte de motor anterógrada das suas cargas 1,2. É um heterotetrâmero das duas subunidades de cadeia leve cinesina 1 (KLC1) e duas subunidades de Cadeias Pesadas cinesina (KHCs). KIF5B 1, um KHC, contém um domínio de motor na sua extremidade N-terminal, que hidrolisa ATP e converte a energia química em energia mecânica para o movimento ao longo dos microtúbulos. A sua região C-terminal contém o domínio de dimerização que interage com KLC1, que se associa com cargas. Cinesina-1 transporta cargas, tais como vesículas e organelas, mRNAs 3,4. Recentemente, foi mostrado KIF5B para transportar o factor de transcrição nuclear de C-MYC para a degradação no citoplasma proteossomal 5. Três metodologias (inibidor químico, siRNA / shRNA e mutantes dominante negativo) foram utilizados para inibir cinesina-1 função. Todos eles induzida agregação de c-myc no citoplasma. Para o último método, c-myc só foi afectada pela negat dominanteive mutante de KIF5B, mas não pela de uma outra proteína relacionada KIF5A do motor, o que sugere que o mutante não exerce efeitos gerais sobre os componentes intracelulares (tais como perturbação de microtúbulos) ou sobre a agregação de proteína. O mutante negativo dominante de KIF5B também não afectou outro factor de transcrição, sugerindo que não exercem efeitos gerais de factores de transcrição. Em vez disso, ele sugere que o mutante negativo dominante exerce efeitos específicos sobre suas cargas. A utilização de mutantes negativos dominantes é comum no campo das proteínas de motor. Similar mutantes sem motor de kinesins e myosins foram usadas anteriormente. Eles foram principalmente utilizados para demonstrar os efeitos dos mutantes nas localizações subcelulares das suas cargas ou sobre funções celulares 6-12. Menos ênfase foi colocada sobre a relação espacial entre os mutantes e as cargas afetadas por eles. No entanto, em alguns incidências, os mutantes foram observados para co-localizar com a sua cargos 6,10. A interacção entre KIF5B e suas proteínas associadas foi anteriormente confirmado pela levedura em ensaio in vivo de dois hridos e ensaios de pull-down bioquímicos, tais como co-imunoprecipitação e ensaios in vitro suspensos 13-16. Neste artigo, usando um método de microscopia de fluorescência visual adicional é descrito para identificar proteínas de carga KIF5B. O método faz uso de um mutante KIF5B motorless que actua como um mutante negativo dominante. Ele agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. A marcação de tipo selvagem e mutante KIF5B motorless com a proteína fluorescente tdTomato 17 permite a sua visualização por microscopia de fluorescência. As proteínas marcadas KIF5B pode ser co-expressa com uma proteína candidata fundido com uma proteína fluorescente diferente com propriedades espectrais adequadamente separados a partir da etiqueta KIF5B. As proteínas marcadas são observados directamente em células vivassob microscopia de fluorescência. A indução da agregação da proteína candidata por o mutante KIF5B motorless confirmará que a proteína candidata é uma carga in vivo de KIF5B. Além disso, as proteínas marcadas com KIF5B tdTomato pode ser expressa por si só nas células de estudar os seus efeitos sobre as proteínas endógenas da carga. Mais tarde, a microscopia de imunofluorescência é conduzida em que as células transf ectadas são fixadas e coradas com um anticorpo específico contra a proteína endógena candidato, seguido por um anticorpo secundário apropriado conjugado com um corante fluorescente. Neste caso, o candidato de proteína endógena no seu nível fisiológico é estudada. Similar mutantes sem motor de outras proteínas do motor podem estar preparados para identificar as suas cargas.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Exogenamente expresso de tipo selvagem KIF5B apareceu homogeneamente no citoplasma, ao passo que c-Myc surgiu principalmente no núcleo (Figura 1A). No entanto, o mutante KIF5B motorless agregados formados no citoplasma (Figura 1A). Agregação do KIF5B motorless induziu a agregação de c-MYC. A percentagem de células que expressam agregados TagCFP marcada com c-myc nas células que expressam o tipo selvagem KIF5B foi baixa. No entanto, era significativamente maior quando o KIF5B motorless foi co-expresso (Figura 1A). A co-localização observado de KIF5B mutante com c-myc (Figura 1) sugere que KIF5B regula a localização subcelular de c-myc e c-Myc é uma carga de cinesina-1. Os controlos negativos, em que as construções foram expressas isoladamente são incluídos no painel inferior da Figura 1A. Os resultados mostram que não houve sangria, de forma significativa emissio fluorescêncian. O KIF5B motorless também induziu a agregação do endógeno c-myc (Figura 1B) e o factor de transcrição de p53 (Figura 2), indicando que c-myc e p53 são tanto as cargas de cinesina-1 e KIF5B regula a localização subcelular das duas proteínas endógenas. Juntamente com os resultados de que o inibidor de cinesina-1 rose bengal lactona (RBL) 20 induz a formação de espécies de elevado peso molecular tanto para c-myc e p53 5, a p53 é provavelmente uma carga de cinesina-1. É interessante notar que o fator de transcrição nuclear p53, como c-MYC, também é exportado a partir do núcleo para o citoplasma para a degradação proteossómica 21,22. O movimento de factores de transcrição por KIF5B parece ser específica, porque a expressão do mutante KIF5B motorless não afectou a localização subcelular de c-fos ou provocar a agregação (Figura 3). Os dados anteriores demonstram que o metod empregues nesta publicação permite a identificação de alta especificidade de cinesina-1 cargas. Uma estratégia semelhante pode ser aplicado a outras proteínas do motor bem. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figura 1: Expressão do mutante KIF5B motorless induz a agregação de c-myc no citoplasma das células HeLa (A) foram transfectadas com tdTomato-etiquetado de tipo selvagem (WT) KIF5B (vermelho) e TagCFP marcada com c-myc (azul).. tdTomato-tagged WT KIF5B apareceu principalmente no citoplasma, enquanto TagCFP marcada com c-myc apareceu principalmente no núcleo. No entanto, o mutante KIF5B motorless tdTomato-etiquetado (vermelho) formados agregados filamentosos ou puntiformes no citoplasma. Expressão do KIF5B motorless induzida a agregação de c-myc. O KIF5B mutante e c-MYC co-localizada junto (rosa). As percentagens de células (%) indicando agregados de PFR-c-myc (%) são mostrados. Os resultados são apresentados comomédia ± DP (n = 3). Os controlos negativos com expressão de proteínas KIF5B tdTomato-tag ou TagCFP marcada com c-myc, juntamente com os vectores vazios (V) são mostrados no painel inferior. (B) Resultados semelhantes foram obtidos com o endógeno c-myc (verde) quando tdTomato-tagged WT ou proteínas KIF5B sem motor (vermelho) foram expressos. O mutante KIF5B motorless tdTomato-marcado agregados no citoplasma formada e induzida agregação da endógena c-MYC. Ambos os tipos de agregados co-localizada junto no citoplasma (laranja). Os núcleos foram corados com o corante Hoechst 33342 ou DAPI. Barra de escala; 20 um. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figura 2: Expressão do mutante KIF5B motorless induz a agregação de p53 endógeno em tele citoplasma. Em células HeLa, marcaram-tdTomato de tipo selvagem (WT) KIF5B exógeno (vermelho) apareceu principalmente no citoplasma, enquanto que o p53 endógena (verde) apareceu principalmente no núcleo. Em contraste, o mutante KIF5B motorless tdTomato-etiquetado (vermelho) agregados no citoplasma formado. Expressão do KIF5B motorless induzida a agregação da p53, resultando na co-localização de KIF5B e p53 no citoplasma (amarelo). O experimento foi realizado três vezes. Os núcleos foram corados com o DAPI corante. Barra de escala; 20 um. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figura 3:. Expressão do mutante KIF5B motorless não induzir a agregação da proteína c-Fos no citoplasma tdTomato-etiquetado de tipo selvagem (WT) KIF5B (vermelho) apareceuprincipalmente no citoplasma das células HeLa, enquanto EGFP-c-Fos (verde) apareceu principalmente no núcleo. Pelo contrário, o mutante KIF5B motorless tdTomato-etiquetado (vermelho) agregados no citoplasma formado. Expressão do KIF5B motorless não induzir a agregação da proteína c-Fos. O experimento foi realizado quatro vezes. Os núcleos das células foram coradas com o corante de DAPI. Barra de escala; 20 um. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> iniciador inverso comum </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> Do tipo selvagem iniciador directo KIF5B </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> KIF5B motorless iniciador directo </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabela 1: As sequências dos iniciadores para clonagem do tipo selvagem e proteínas KIF5B sem motor.

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Aqui, um protocolo é apresentada para identificar cinesina-1 cargas. Um mutante motorless da cinesina-1 de cadeia pesada (KIF5B) agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. Ambos os agregados são detectados por microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser empregue para identificar cargas de outras proteínas do motor.

Identificação de cinesina-1 Cargas Utilizando microscopia de fluorescência

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K visualizações.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Aqui, um protocolo é apresentada para identificar cinesina-1 cargas. Um mutante motorless da cinesina-1 de cadeia pesada (KIF5B) agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. Ambos os agregados são detectados por microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser empregue para identificar cargas de outras proteínas do motor. 

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

Uso de Nucleotídeos stopped-flow de fluorescência e rotulados para analisar o ciclo de rotatividade ATP de cinesinas

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Química

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Biologia do Desenvolvimento

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Montagem Molecular vaivéns alimentados por reversivelmente ligado Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Engenharia

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Bioquímica

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neurociência

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Embarque de carga para cinesina Produzido Shuttles Molecular

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biologia

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...