Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

שיבוט 1. של wild-type-tagged tdTomato ו Motorless KIF5B חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את cDNAs עבור wild-type האדם וחלבונים KIF5B motorless באמצעות פריימרים בטבלה 1, DNA פולימרז תקי (5 יחידות עבור 100 μl), תמהיל dNTP (2 מ&quot;מ לכל deoxynucleotide) חיץ 10X שלה במשך 30 מחזורים. כל מחזור מורכב צעד denaturation (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), צעד חישול (45 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ו צעד ארכה (72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את מוצר ה- DNA מוגבר עם נפח שווה של פנול / כלורופורם (1: 1). הערה: פנול הוא דליק ועלול לגרום לכוויות. כלורופורם מהווים סכנה. יש להימנע ממגע ישיר עם אותם ולהשתמש בהם תחת במנדף כימי. לחלופין, מוצרי ה- PCR יכול להיות מטוהר על ידי ערכות שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. מעבירים את הפתרון מימית לצינור חדש ולחלץ עם נפח שווה של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְסוֹבֵבב 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 0.5 דקות. מעביר את הפתרון מימי לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בתמיסה מימית עם נפח לעשירית 3 M Na-אצטט ושני כרכים של אתנול אבסולוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון המימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור DNA עם שתי נפח של אתנול 75%. מחק את פתרון המימי ואוויר יבש גלולת DNA בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. Resuspend גלולה DNA ב -34 מים μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר המוצרים המוגברים נפח הסופי של 40 μl עם הגבלת אנזימי סאלי (10 יחידות) ו BamHI (10 יחידות) ו -4 μl של חיץ 10X שלהם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי שעות. פתור את המוצרים מתעכל ג&#39;ל agarose (1.0% ב 100 V) המכיל (מ&quot;ל 0.2 מיקרוגרם /) ethidium ברומיד. הערה: ברומיד Ethidium הוא mutagen חזק והוא יכול להיספג דרך העור. לכן, חשוב להימנע ממגע ישיר או עקיף wה- i ethidium ברומיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הערוצים המתאימים לניקוי לפי עמודות. לשקול את הג&#39;ל agarose המכיל את קטע DNA. ואז לפזר אותו למאגר solubilization (300 μl עבור 0.1 גרם) ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון הביא לעמודה ספין ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 5 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם חיץ solubilization 0.5 מ&quot;ל על ידי חזרה על שלב 1.5. לשטוף את העמודה שוב עם חיץ 0.75 מ&quot;ל לשטוף על ידי חזרה על שלב 1.5. ספין בעמודה למשך 2 דקות כדי להיפטר למאגר לשטוף הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute שבר DNA עם 50 מים μl ידי חזרה צעד 1.5. להעריך את הריכוז של קטע DNA על ידי הפעלת aliquot של זה נגד סולם גודל ה- DNA ג&#39;ל agarose (1.0% ב 100 V) המכיל ברומיד ethidium (0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את המוצרים מטוהרים (כ -100 ng) עם וקטור ptdTomato-C1 17 (כ -100 ng) מתעכל בעבר עם הדואר באותו הגבלה אנזימים 10 μl באמצעות האנזים T4 DNA (2,000 יחידות) ו 1 μl 10X חיץ קשירת בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. הערה: סוג-בר מוטציה motorless מכיל חומצות אמינו מ 2 כדי 963 ו 584 כדי 963, בהתאמה. בעבר, מוטצית KIF5B motorless גדולה שמשה לזיהוי תפקידיו 9. מוטצית KIF5B motorless קטנה שמשה המחקרים הנוכחיים להגדיל את רמות הביטוי שלה. </li></ol> 2. מיקרוסקופי Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חיים או דימות פלואורסצנטי עקיף עם הגדלה או מתחת 40X, זרע 0.2-0.3 מיליון תאים הלה ב 1 מ&quot;ל בינוני שלם [בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS)] בכל טוב של צלחת שש היטב. לגדול ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מחקרים immunofluorescence עקיף עם בהגדלה מעל 40X, לשטוף כוסות כיסוי (18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ; 1.5 עובי) בקצרה אתנול אבסולוטי ואוויר-לייבש אותםהבארות של צלחת שש היטב, בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 0.2-0.3 מיליון תאים ב 1 מ&quot;ל להשלים בינוני DMEM בכל טוב של צלחת שש היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת קומפלקס Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, לדלל 0.6 מיקרוגרם (סה&quot;כ) של פלסמיד ביטוי wild-type-tagged tdTomato או KIF5B motorless בנוכחות או בהיעדר פלסמיד ביטוי חלבון מועמד מטענים (pTagCFP-c-myc 5 ) עם המדיום transfection 0.1 מ&quot;ל צינור 1.6 מ&quot;ל microcentrifuge. הערה: וקטור pTagCFP-c-myc מבטא את c-myc-tagged TagCFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.8 μl של מגיב transfection עד בינוני 0.1 מ&quot;ל transfection ב עוד צינור 1.6 מ&quot;ל microcentrifuge. בדרך כלל, להכין תערובת אב של מגיב transfection מדולל מספיק 12 דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מגיב transfection 0.1 מ&quot;ל מדולל אל DNAs 0.1 מ&quot;ל מדולל. מִיx את התוכן על ידי היפוך הצינורות. ספין צינורות במשך 5 שניות ב microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 45 דקות, בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמי התאים שנזרעו עם בופר פוספט (PBS) במהלך תקופת הדגירה של ההיווצרות של מתחם transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום של תאים זורעים בכל טוב עם 0.8 מ&quot;ל בינוני transfection מחומם מראש. החזר את הצלחות אל האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 45 דקות, להוסיף 0.2 מ&quot;ל של המתחם מגיב DNA / transfection (מוכן בשלב 2.3) dropwise היטב כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rock the צלחת 6 היטב בעדינות במשך 5 שניות, לפני שהם מוחזרים החממה ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6-8 שעות, להחליף בינוני עם מדיום DMEM המלא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דימות פלואורסצנטי Live- תא 18 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 16 ​​שעות של נוספיםt 37 ° C, להוסיף את הכתם intercalating DNA Hoechst 33342 למדיום לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. הערה: Hoechst 33342 הוא צבע intercalating תא חדיר, DNA כי כתמי גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי transfected במשך 10 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס לפני לבחון אותם על מנת לתת ביטוי חלבוני ניאון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 40X. הסטים מסנן DAPI, CFP, FITC ו Cy3 הם (ננומטר Ex350 / Em460 ננומטר), (ננומטר Ex436 / Em480 ננומטר), (ננומטר Ex470 / Em525 ננומטר) ו- (ננומטר Ex545 / Em605 ננומטר), בהתאמה. הערה: אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש. </li></ol></li></ol> 3. מחקרי Immunofluorescence עקיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון Paraformaldehyde <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול אבקת paraformaldehyde (4 גרם לכל 100 מ&quot;ל PBS) ולהוסיף אותו PBS. הערה: Paraformaldehyde הוא מוצק דליק וכן hazar הסרטן פוטנציאליד. זה מעצבן את העיניים, דרכי הנשימה והעור. לכן, חשוב להימנע ממגע עם או שאיפה של paraformaldehyde. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת NaOH לפתרון (150 μl 10 N NaOH / 100 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הפתרון על 37 42 ° C במשך 2-3 שעות עם רעד מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 7.0 ידי הוספת חומצה אצטית קרחונית לפתרון (כ -75 μl / 100 מ&quot;ל) לאחר אבקת paraformaldehyde נמס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעד חלבונים מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה נוספת עבור 16 שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים transfected בטמפרטורת החדר פעם עם PBS על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 1 מ&quot;ל של שהוכן זה עתה, פתרון paraformaldehyde 4% בכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS פעם על ידי מתערבל במשך 5 שניות צלחת שש היטב. מחק את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 1 מ&quot;ל של 0.1% Triton-X 100 (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. detergent Triton-X 100 יהיה permeabilize קרום תא כדי לאפשר גישה של נוגדני המטרות התאיות שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 1 מ&quot;ל של נוגדנים ראשוניים (נוגדן ארנבת c-myc או נוגדן עכבר p53; 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בתוך FBS 10% בפתרון PBS בטמפרטורת החדר על ידי נדנדה עבור 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 1 מ&quot;ל של נוגדנים משני ניאון מצומדות צבע (נוגדן 488 מצומדות נגד ארנב או אנטי עכבר IgG אלקסה פלואוריד; 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב 10% FBS ב PBS בטמפרטורת החדר בחושך ידי נדנדה עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני מכתים שמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; דגירה התאים עם 1 מ&quot;ל של צבע intercalating DNA 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 10 דקות. עבור לשלב 3.4 כשאף משקפי כיסוי מנוצלים. הערה: DAPI הוא צבע intercalating DNA כי כתמי גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10 μl של פתרון גובר על כל שקופית מיקרוסקופ. הר כל זכוכית מכסה על הפתרון גובר על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה האפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של משקפי הכיסוי עם לק. מניחים בחושך בתוך במנדף לילה להסיר את האדים לק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרה 40X. הסטים מסנן DAPI, CFP, FITC ו Cy3 הם (ננומטר Ex350 / Em460 ננומטר), (ננומטר Ex436 / Em480 ננומטר), (ננומטר Ex470 / Em525 ננומטר) ו- (ננומטר Ex545 / Em605 ננומטר), בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

פרסום והפקה וגישה חופשית של מאמר זה הוא שילם על ידי רוש.

השיטה המתוארת מנצלת את המאפיינים של מוטצית KIF5B motorless, אשר חסרה את היכולת לנוע לאורך microtubules, אך שומרת לעצמה את היכולת ליצור דימרים עם KIF5B wild-type, ובכך לאפשר את חלבון tetrameric לקיים אינטראקציה עם אותם חלבוני המטען כמו wild-type KIF5B. KIF5B Motorless, ולכן, משמש מוטציה וצורות שליליות דומיננטיות mislocalized אגרגטים עם המטענים שלה. שיטה זו מוכחת לזהות את המטען Kinesin-1 c-myc (איור 1) 5. במאמר זה, באותו מוטציה KIF5B motorless שימש לזיהוי p53 כעוד מטען הפוטנציאל של Kinesin-1 (איור 2). זה מראה כי המתודולוגיה אינו ריאלי לזהות מטענים אחרים של Kinesin-1. יתר על כן, את הספציפיות של המוטציה מסופקת על ידי חוסר ההשפעה של המוטציה על חלבון הבקרה השלילי c-Fos (איור 3). בפרוטוקול זה, tdTomato מתויג-טאי ברPE או חלבון KIF5B motorless הוא coexpressed עם חלבון אחר מטען מועמד חלבון מתויג ניאון. במקרה זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי Live- תא הדמיה מבוצעים. ההיווצרות של אגרגטים ניתן לייחס ידי הדמית זמן לשגות. לחלופין, חלבון מתויג tdTomato מתבטא לבד ואת חלבון מטען המועמד ברמות הפיזיולוגיות שלה היא דמיינה ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עקיפה באמצעות נוגדנים ספציפיים. TdTomato חלבון פלואורסצנטי נבחר הבהירות שלה בצילום 17. אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש. מוטצית KIF5B motorless יוצרת דימרים עם KIF5B wild-type stoichiometrically. לכן, חשוב להביע כמות מספקת של מוטצית KIF5B motorless ליצירת דימרים עם עמיתו wild-type כדי לעכב את התפקיד וכדי ליצור אגרגטים. כדי לטפל בבעיה זו, אופטימיזציה של expression של מוטציה motorless חיוני. זו מושג באמצעות מוטצית motorless קטנה המכילה את תחום dimerization. בנוסף, אופטימיזציה של מגיב ופרוטוקול transfection המתאימים גם הכרחית. משך הדגירה של תאים הלה עם מגיב DNA / transfection היה מותאם בתאים הלה לביטוי של חלבונים אקסוגני כדאיות התא. משך הדגירה ייתכן שיהיה צורך מותאם במיוחד שורות תאים אחרות. לקבלה בהגדלה בין 4X ל 40X, לא משקפי כיסוי נדרשים. תאים יכול להיבחן ישירות במי קידוחים. לכן, במקרה זה, הפרוטוקול הוא זול ונוח. לקבלה בהגדלה מעל 40X, תאים גדל על משקפי כיסוי הבארות, לאחר מכתים, הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ לבדיקה תחת מטרות-טבילת שמן. תצפית של אגרגטים של חלבון KIF5B motorless היא מוגבלת על ידי גודל של הציטופלסמה. נקל לזהות אתאגרגטים בתאי יונקים רבים. עם זאת, הוא יחסית קשה להתבונן המצרפים בתאים עצביים כאשר היקף בציטופלסמה קטן סביב הגרעינים והן neurites. הפרוטוקול משמש כדי להראות את הקשר בין KIF5B והמטענים שלה בנוסף שמרי in vivo השנייה היברידי מבחני נפתח ביוכימיים 13-16. כל אלה מבחני לקבוע את הקשר בתנאים פיזיים שונים ותוצאותיהם יכולים להשלים אחד את השני. יתר על כן, היתרון של assay הקרינה הזאת על מבחני אחרים היא שזה יכול להראות את הסדרת לוקליזציה subcellular של מטענים ידי KIF5B (איורים 1 ו -2). הפרוטוקול אינו מוגבל KIF5B וניתן להשתמש בו כדי לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים, כגון כמה מנועי kinesin אחרים 3 וחלק מנועי השרירן 23,24 בשימוש בתחבורה תאית של מטענים 3. חלבונים המנועים אלה מכילים גם תחומי מנוע לתנועה לאורך microtubules עבור מנועי kinesin ו microfilaments עבור מנועי שרירן, ומגזרי סליל מפותלים עבור oligomerization. רובם יוצרים homodimers 3,23. לכן, אסטרטגיה דומה ניתן ליישם אותם על ידי יצירת המוטציות השליליות הדומיננטיות motorless שלהם לזהות המטענים שלהם.

Kinesin-1 הוא חלבון מנוע שמתווך תחבורת האנטרוגרד של המטענים שלה 1,2. זהו heterotetramer של שתי יחידות המשנה של Kinesin אור שרשרת 1 (KLC1) ושתי יחידות משנה של שרשרות כבדות Kinesin (KHCs). KIF5B 1, KHC, מכיל תחום רכב בבית שלה N-terminal, אשר hydrolyzes ATP ו ממיר את האנרגיה הכימית לאנרגיה מכנית לתנועה לאורך microtubules. באזור C-terminal שלה מכיל את תחום dimerization כי אינטראקציה עם KLC1, אשר מקשר עם מטענים. Kinesin-1 משלוחי מטענים כגון שלפוחית, אברונים mRNAs 3,4. לאחרונה, KIF5B הוצגה להובלת גורם שעתוק גרעיני c-myc השפלה proteosomal בציטופלסמה 5. שלוש מתודולוגיות (מעכב כימי, siRNA / shRNA ו מוטציה שלילית דומיננטית) שמשו לעכב פונקצית Kinesin-1. כולם המושרה צבירה של c-myc בציטופלסמה. לחישוב על פי השיטה האחרון, c-myc הושפע רק על ידי negat הדומיננטיive מוטציה של KIF5B, אבל לא על ידי זה של חלבון אחר מנוע קשור KIF5A, הדבר המצביע כי המוטציה לא להשפעות כלליות על הרכיבים התאיים (כמו שיבוש microtubule) או על הצטברות חלבון. המוטציה השלילית הדומיננטית של KIF5B גם לא השפיעה גורם שעתוק אחר, דבר המצביע על כך זה לא להשפעות כלליות על גורמי שעתוק. במקום זאת, הוא טוען כי המוטציה השלילית הדומיננטית מפעילה השפעות ספציפיות על המטענים שלה. שימוש מוטציות שליליות דומיננטיות נפוץ בתחום חלבוני מנוע. מוטציות motorless דומה kinesins ו myosins שימשו בעבר. הם שימשו בעיקר כדי להדגים את ההשפעות של מוטציות על localizations subcellular של מטענים שלהם או על תפקודים תאיים 6-12. פחות דגש הושם על הקשר המרחבי בין מוטנטים המטענים המושפעים מהם. עם זאת, בכמה מקרים, המוטציות נצפו לשתף למקם עם ca שלהם6,10 rgos. האינטראקציה בין KIF5B והחלבונים הקשורים אליו אושרה בעבר על ידי שמרי in vivo assay השני היברידי מבחני הנפתח ביוכימיות כגון שיתוף immunoprecipitation וב מבחני נפתח במבחנת 13-16. במאמר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשיטה חזותי נוסף מתואר לזהות חלבוני מטען KIF5B. השיטה עושה שימוש מוטצית KIF5B motorless שפועלת מוטציה שלילית דומיננטית. גוגל מאגד בציטופלסמה ומשרת צבירה של המטענים שלה. התיוג של wild-type ו מוטציה KIF5B motorless עם חלבון פלואורסצנטי tdTomato 17 מאפשרת הדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבוני KIF5B מתויגים יכולים להיות שותף הביע עם חלבון מועמד התמזג חלבון פלואורסצנטי שונה עם תכונות ספקטרליות מופרדות כראוי מתג KIF5B. החלבונים מתויגים הם נצפו ישירות בתאים חייםתחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אינדוקציה של אגרגציה של החלבונים המועמדים על ידי מוטצית KIF5B motorless תאשר כי חלבון המועמד הוא מטען in vivo של KIF5B. יתר על כן, חלבוני KIF5B מתויג tdTomato יכולים להתבטא לבד בתאים ללמוד והשפיעו על חלבוני מטען אנדוגני. מאוחר יותר, מיקרוסקופיה immunofluorescence מתנהלת שבו תאי transfected הם קבועים מוכתם נוגדן ספציפי נגד חלבון מועמד אנדוגני, ואחריו נוגדנים משני מתאימים מצומדות עם פלורסנט לצבוע. במקרה זה, חלבון מועמד אנדוגני ברמה הפיזיולוגית שלו נלמד. מוטציות motorless דומות חלבוני מנועים אחרים יכולות להיות מוכן לזהות המטענים שלהם.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

אקסוגני הביע KIF5B wild-type הופיע בצורה הומוגנית בציטופלסמה, בעוד c-myc הופיע בעיקר בגרעין (איור 1 א). עם זאת, מוטציה KIF5B motorless יצרו אגרגטים ב (איור 1 א) בציטופלסמה. אגרגציה של KIF5B motorless המושרה צבירה של c-myc. אחוז התאים המבטאים מצטברים TagCFP מתויג c-myc ב התאים המבטאים KIF5B wild-type היה נמוך. עם זאת, זה היה משמעותית גבוה יותר כאשר KIF5B motorless היה שיתוף הביע (איור 1 א). שיתוף לוקליזציה שנצפה KIF5B מוטציה עם c-myc (איור 1) עולה כי KIF5B מסדיר את לוקליזציה subcellular של c-myc ו c-myc הוא מטען של Kinesin-1. בקרות שליליות שבו המבנים התבטאו לבד כלולים ב- הפאנל התחתון של איור 1A. התוצאות מראות כי אין דרך לדמם משמעותי emissio הקרינהn. KIF5B motorless הנגרמת גם אגרגציה של c-myc אנדוגני (איור 1B) ואת p53 גורם שעתוק (איור 2), המציין כי c-myc ו- p53 הם המטענים של Kinesin-1 ו KIF5B מסדיר את לוקליזציה subcellular של שני חלבונים אנדוגניים. יחד עם התוצאות כי מעכב Kinesin-1 עלה lactone בנגל (RBL) 20 גורם להיווצרות מינים משקל מולקולרי גבוה הן c-myc ו- p53 5, p53 עשוי מטען של Kinesin-1. מעניין לציין כי p53 גורם שעתוק הגרעיני, כמו c-myc, מיוצא גם מהגרעין אל הציטופלסמה שפל proteasomal 21,22. התנועה של גורמי שעתוק על ידי KIF5B מופיע להיות ספציפי כי הביטוי של מוטציה KIF5B motorless לא השפיע על לוקליזציה subcellular c-Fos או לגרום לו לצבור (איור 3). הנתונים לעיל מוכיחים כי methoד מועסק בפרסום זה מאפשר זיהוי-הסגולי הגבוהה של מטעני Kinesin-1. אסטרטגיה דומה ניתן להחיל חלבוני מנועים אחרים גם כן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> איור 1: הביטוי של מוטציה KIF5B motorless גורם צבירה c-myc בציטופלסמה (א) תאים הלה היו transfected עם tdTomato מתויג wild-type (WT) KIF5B (אדום) ו TagCFP מתויג c-myc (כחול).. tdTomato מתויג WT KIF5B הופיע בעיקר בציטופלסמה, בעוד TagCFP מתויג c-myc הופיע בעיקר בגרעין. עם זאת, מוטציה KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרו אגרגטים filamentous או punctate בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless המושרה צבירה של c-myc. KIF5B המוטציה ו c-myc השותף המקומי יחד (ורוד). אחוזים של תאים (%) המציין אגרגטים של CFP-c-myc (%) מוצגים. התוצאות מוצגות כפיממוצע ± סטיית תקן (N = 3). בקרות שליליות עם ביטוי של חלבוני KIF5B tdTomato מתויג או TagCFP מתויג c-myc יחד עם וקטורים ריקים (V) מוצגות בפנל התחתון. (ב) תוצאות דומות התקבלו עם c-myc אנדוגני (ירוק) כאשר tdTomato מתויג WT או חלבונים KIF5B motorless (אדום) באו לידי ביטוי. מוטצית KIF5B motorless מתויגת tdTomato יצרה אגרגטים בציטופלסמה מושרה אגרגציה של c-myc אנדוגני. שני סוגי אגרגטים שותף מקומי יחד בציטופלסמה (כתום). הגרעינים הוכתמו לצבוע Hoechst 33342 או DAPI. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> איור 2: הביטוי של מוטצית KIF5B motorless גורם צבירת p53 אנדוגני tהוא בציטופלסמה. בתאים הלה, wild-type אקסוגניים-tagged tdTomato (WT) KIF5B (אדום) הופיע בעיקר בציטופלסמה, בעוד p53 אנדוגני (ירוק) הופיע בעיקר בגרעין. לעומת זאת, מוטצית KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרה אגרגטים בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless המושרה צבירה של p53, וכתוצאה מכך את שיתוף לוקליזציה של KIF5B ו- p53 בציטופלסמה (צהוב). הניסוי בוצע שלוש פעמים. הגרעינים הוכתמו DAPI לצבוע. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> איור 3:. הביטוי של מוטציה KIF5B motorless לא לגרום צבירה של c-Fos בציטופלסמה tdTomato מתויג wild-type (WT) KIF5B (אדום) הופיע<html> בעיקר בציטופלסמה של תאי הלה, תוך EGFP-ג-Fos (ירוק) הופיע בעיקר בגרעין. נהפוך הוא, מוטציה KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרו אגרגטים בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless לא להשרות את ההצטברות של c-Fos. הניסוי בוצע ארבע פעמים. הגרעינים של תאים הוכתמו DAPI לצבוע. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריימר הגב, המשותף </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &quot; </td></tr><tr><td> פריימר wild-type KIF5B קדימה </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &quot; </td></tr><tr><td> פריימר motorless KIF5B קדימה </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &quot; </td></tr></tbody></table>: לשמור-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; טבלה 1: רצפים פריימר עבור שיבוט wild-type וחלבונים KIF5B motorless.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים.

זיהוי של Kinesin-1 מטענים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחר...

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

שימוש בנוקלאוטידים פסיקת זרימת הקרינה ותווית לניתוח מחזור מחזור ATP של Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Chemistry

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Developmental Biology

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Engineering

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Biochemistry

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neuroscience

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...