Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. Clonación de la de tipo salvaje tdTomato-etiquetados y sin motor KIF5B proteínas <ol><li> Amplificar el ADNc para la de tipo salvaje humana y proteínas KIF5B sin motor utilizando los cebadores en la Tabla 1, la ADN polimerasa Taq (5 unidades de 100 l), mezcla de dNTP (2 mM de cada desoxinucleótido) y su tampón 10X para 30 ciclos. Cada ciclo consta de una etapa de desnaturalización (95 ° C durante 30 seg), una etapa de recocido (45 ° C durante 30 seg) y un paso de extensión (72 ° C durante 3 min). </li><li> Se extrae el producto de ADN amplificado con un volumen igual de fenol / cloroformo (1: 1). Nota: El fenol es combustible y puede causar quemaduras. El cloroformo es peligroso. Evitar el contacto directo con ellos y utilizarlos en una campana de humos química. Alternativamente, los productos de PCR se pueden purificar por varios kits. <ol><li> Girar a 18.000 xg en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 1 min. Transferir la solución acuosa a un nuevo tubo y se extrae con un volumen igual de cloroformo. </li><li> Girara 18.000 xg en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 0,5 min. Transferir la solución acuosa a un nuevo tubo. </li><li> Mezclar la solución acuosa con un décimo de volumen de 3 M de acetato sódico y dos volúmenes de etanol absoluto. </li><li> Girar a 18.000 xg en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 5 min. Desechar la solución acuosa. </li><li> Lavar el sedimento de ADN con dos volúmenes de etanol al 75%. Descartar la solución acuosa y el aire seco el sedimento de ADN a temperatura ambiente durante 5 min. Resuspender el sedimento de ADN en 34 l de agua. </li></ol></li><li> Digerir los productos amplificados en un volumen final de 40 l con las enzimas de restricción SalI (10 unidades) y BamHI (10 unidades) y 4 l de su tampón 10X a 37 ° C durante dos horas. Resolver los productos digeridos en un gel de agarosa (1,0% a 100 V) que contienen bromuro de etidio (0,2 mg / ml). Nota: El bromuro de etidio es un potente mutágeno y puede ser absorbido por la piel. Por lo tanto, es importante para evitar el contacto directo o indirecto with de bromuro de etidio. </li><li> Recortar las bandas correctas para la purificación por columnas. Pesar el gel de agarosa que contiene el fragmento de ADN. A continuación, disolver en el tampón de solubilización (300 l para 0,1 g) a 37 ° C durante aproximadamente 20 min. </li><li> Añadir la solución resultante a una columna y centrifugado en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 5 seg. Desechar el flujo continuo. </li><li> Lavar la columna con tampón de solubilización 0,5 ml mediante la repetición del paso 1.5. Lavar la columna de nuevo con 0,75 ml de tampón de lavado repitiendo el paso 1.5. Girar la columna durante 2 minutos para deshacerse del tampón de lavado restante. </li><li> Eluir el fragmento de ADN con 50 l de agua repitiendo el paso 1.5. Estimar la concentración del fragmento de ADN mediante la ejecución de una parte alícuota de la misma contra una escala de tamaño de ADN en un gel de agarosa (1,0% a 100 V) que contiene bromuro de etidio (0,2 mg / ml). </li><li> Ligar los productos purificados (alrededor de 100 ng) con el vector ptdTomato-C1 17 (alrededor de 100 ng) previamente digerido con THe mismo enzimas de restricción en 10 l utilizando ADN ligasa de T4 (2.000 unidades) y 1 l de tampón de ligación 10 veces a temperatura ambiente durante 16 hr. Nota: El tipo salvaje y mutante sin motor contiene los aminoácidos de 2 a 963 y 584 a 963, respectivamente. Anteriormente, se utilizó un mutante KIF5B sin motor más grande para identificar su función 9. Un mutante KIF5B sin motor más pequeño se utilizó para los estudios actuales para aumentar sus niveles de expresión. </li></ol> 2. Inmunofluorescencia Microscopía <ol><li> Para vivo de células o de imágenes de fluorescencia indirecta con un aumento de 40X en o por debajo, semilla de 0,2-0,3 millones de células HeLa en 1 ml de medio completo [de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS)] en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Crecer a 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> Para los estudios de inmunofluorescencia indirecta con aumentos por encima de 40X, lava cubiertas de vidrio (18 mm x 18 mm; 1,5 de espesor) en etanol absoluto brevemente y aire secarlaslos pocillos de una placa de seis pocillos, dentro de una cabina de bioseguridad para evitar la contaminación. <ol><li> Seed 0,2-0,3 millones de células en 1 ml de medio completo DMEM en cada pocillo de una placa de seis pocillos. </li></ol></li><li> Preparación de complejo de transfección <ol><li> El día siguiente, dentro de una cabina de bioseguridad, diluir 0,6 g (total) del plásmido de expresión de tipo salvaje marcada con tdTomato o KIF5B motorless en presencia o ausencia de un plásmido de expresión para una proteína candidata de carga (pTagCFP-c-MYC 5 ) con 0,1 ml de medio de transfección en un tubo de 1,6 ml de microcentrífuga. Nota: El vector pTagCFP-c-myc expresa el etiquetado TagCFP-c-myc. </li><li> Añadir 1,8 l de reactivo de transfección de 0,1 ml de medio de transfección en otro tubo de 1,6 ml de microcentrífuga. Por lo general, preparar una mezcla maestra de reactivo de transfección se diluye suficiente para 12 muestras. </li><li> Incubar durante 5 min, a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 0,1 ml del reactivo de transfección se diluyeron a los 0,1 ml diluidos ADN. Mix el contenido invirtiendo los tubos. Girar los tubos durante 5 segundos en una microcentrífuga. </li><li> Incubar durante 45 min, a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavado de Células <ol><li> Se lavan las células sembradas tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante el período de incubación para la formación del complejo de la transfección. </li><li> Vuelva a colocar el medio de las células sembradas en cada pocillo con 0,8 ml de medio de transfección pre-calentado. Devolver las placas a la incubadora a 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfección de células <ol><li> Después de la incubación de 45 min, añadir 0,2 ml del complejo de reactivo de ADN / transfección (preparado en la etapa 2.3) gota a gota a cada pocillo de la placa. </li><li> Rock de la placa de 6 pocillos suavemente durante 5 segundos, antes de que se devuelven a la incubadora a 37 ° C. </li><li> Después de 6-8 horas, sustituir el medio con el medio DMEM completo. </li></ol></li><li> For Imaging fluorescencia de células en vivo 18 <ol><li> Después de un 16 horas de incubación adicional de unat 37 ° C, añadir la mancha de intercalación de ADN Hoechst 33342 para el medio a una concentración final de 1 mM. Nota: Hoechst 33342 es un colorante intercalante de ADN permeable a células que tiñe los núcleos celulares. </li><li> Se incuban las células transfectadas durante 10 min en la incubadora a 37 ° C antes de examinar ellos para la expresión de proteínas fluorescentes por microscopía de fluorescencia utilizando un objetivo 40X. Los conjuntos de filtros para DAPI, PPC, FITC y Cy3 son (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) y (Ex545 nm / Em605 nm), respectivamente. Nota: Si el fondo es alto debido a la auto-fluorescencia del medio completo DMEM, se utiliza medio sin rojo fenol. </li></ol></li></ol> 3. Para los estudios de inmunofluorescencia indirecta <ol><li> Preparación de solución de paraformaldehído <ol><li> Pesar polvo de paraformaldehído (4 g por 100 ml de PBS) y añadirlo a PBS. Nota: El paraformaldehido es un sólido inflamable y un obstáculo de potencial de cáncerre. Se irrita los ojos, las vías respiratorias y la piel. Por lo tanto, es importante para evitar el contacto con o la inhalación de paraformaldehído. </li><li> Añadir NaOH a la solución (150 l 10 N NaOH / 100 ml). </li><li> Mantener la solución a 37-42 ° C durante 2-3 horas con agitación ocasional. </li><li> Ajustar el pH a 7,0 mediante la adición de ácido acético glacial a la solución (alrededor de 75 l / 100 ml) después de que el polvo de paraformaldehído se disuelve. </li></ol></li><li> Las proteínas diana de tinción <ol><li> Después de una incubación adicional durante 16 horas a 37 ° C, se lavan las células transfectadas a temperatura ambiente una vez con PBS haciendo girar la placa de seis pocillos durante 5 segundos. </li><li> Fijar las células con 1 ml de solución recién preparada de paraformaldehído, 4% por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Se lavan las células con PBS una vez por agitación durante 5 segundos la placa de seis pocillos. Desechar la solución. </li><li> Se incuban las células con 1 ml de 0,1% Triton X-100 (en PBS) a temperatura ambiente durante 30 min. la detergent Triton-X 100 se permeabilizar la membrana celular para permitir el acceso de los anticuerpos a sus dianas intracelulares. </li><li> Se lavan las células con PBS cuatro veces por agitación de la placa de seis pocillos durante 5 segundos cada vez. Desechar la solución después de cada lavado. </li><li> Se incuban las células con 1 ml de anticuerpos primarios (anticuerpo de conejo c-MYC o anticuerpo p53 de ratón; 0,1 mg / ml) en un FBS 10% en solución de PBS a temperatura ambiente por agitación durante 4 hr. </li><li> Lavar con PBS cuatro veces por agitación de la placa de seis pocillos durante 5 segundos cada vez. Desechar la solución después de cada lavado. </li><li> Incubar con 1 ml de anticuerpos secundarios de tinte conjugado fluorescente (Alexa Fluor 488-conjugado anti-conejo o anti-ratón de anticuerpos IgG; 0,5 mg / ml) en 10% de FBS en PBS a temperatura ambiente en la oscuridad por balanceo durante 2 hr. </li><li> Lavar con PBS cuatro veces por agitación de la placa de seis pocillos durante 5 segundos cada vez. Desechar la solución después de cada lavado. </li></ol></li><li> La tinción nuclear y de montaje <ol><li&gt; incubar las células con el 1 ml de DNA intercalante tinte 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 0,5 mg / ml) en PBS a temperatura ambiente, en oscuridad durante 10 min. Continúe con el paso 3.4 cuando se utilizan no cubiertas de vidrio. Nota: DAPI es un colorante de intercalación de ADN que tiñe los núcleos celulares. </li><li> Aplique 10 l de solución de montaje en cada portaobjetos de microscopio. Montar cada cubierta de vidrio sobre la solución de montaje en un portaobjetos de microscopio. </li><li> Se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. </li><li> Sellar los bordes de las cubiertas de vidrio con esmalte de uñas. Coloque en la oscuridad dentro de una campana de humos durante la noche para retirar los gases de esmalte de uñas. </li></ol></li><li> Microscopía de fluorescencia 19 <ol><li> Al día siguiente, examinar las células por microscopía de fluorescencia utilizando un objetivo 40X. Los conjuntos de filtros para DAPI, PPC, FITC y Cy3 son (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) y (Ex545 nm / Em605 nm), respectivamente. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

publicación de acceso libre y la producción de este artículo es pagado por Roche.

El método descrito utiliza las propiedades del mutante KIF5B sin motor, que carece de la capacidad de moverse a lo largo de los microtúbulos, pero conserva la capacidad para formar dímeros con la KIF5B de tipo salvaje y, de este modo, permitir que la proteína tetramérica para interactuar con las mismas proteínas de carga como la de tipo salvaje KIF5B. KIF5B sin motor, por lo tanto, actúa como un mutante negativo dominante y formas mislocalized agregados con sus cargas. Este método se ha demostrado para identificar la Kinesin-1 de carga c-MYC (Figura 1) 5. En este artículo, se usó el mismo mutante KIF5B sin motor para identificar p53 como otra carga potencial de Kinesin-1 (Figura 2). Esto demuestra que la metodología es posible identificar otros cargos de Kinesin-1. Además, la especificidad de la mutante es proporcionado por la falta de efecto de los mutantes de la proteína de control negativo c-Fos (Figura 3). En este protocolo, el tdTomato-etiquetados salvaje-tyPE o proteína KIF5B sin motor se coexpresan con otra proteína candidata de carga de proteínas marcadas con fluorescencia. En este caso, se llevan a cabo en vivo de células microscopía de fluorescencia y formación de imágenes. La formación de los agregados puede ser rastreado por la imagen de lapso de tiempo. Alternativamente, la proteína tdTomato-etiquetados se expresa solo y la proteína de carga candidato en sus niveles fisiológicos se visualiza mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos específicos. El tdTomato proteína fluorescente es elegido por su brillo y fotoestabilidad 17. Si el fondo es alto debido a la auto-fluorescencia del medio completo DMEM, se utiliza medio sin rojo fenol. El mutante KIF5B motorless forma dímeros con el KIF5B de tipo salvaje estequiométricamente. Por lo tanto, es crítico para expresar cantidad suficiente de mutante KIF5B sin motor para formar dímeros con la contraparte de tipo salvaje para inhibir su función y para formar agregados. Para abordar esta cuestión, la optimización de exprESIÓN del mutante sin motor es esencial. Esto se logra mediante el uso de una pequeña mutante sin motor que contiene el dominio de dimerización. Además, la optimización de la transfección reactivo apropiado y el protocolo es también necesaria. La duración de la incubación de las células HeLa con el reactivo de ADN / transfección se optimizó en células HeLa para la expresión de proteínas exógenas y la viabilidad celular. La duración de la incubación puede tener que ser optimizada para otras líneas celulares. Para aumentos entre 4X a 40X, no se requieren cubiertas de vidrio. Las células pueden ser examinados directamente en los pocillos. Por lo tanto, en este caso, el protocolo es de bajo costo y conveniente. Para aumentos por encima de 40X, las células se cultivan en cubreobjetos en los pozos y, después de la tinción, están montados en portaobjetos de microscopio para examinarlas con objetivos de inmersión en aceite. Observación de los agregados de la proteína KIF5B sin motor está limitado por el tamaño del citoplasma. Es fácil detectar laagregados en muchas células de mamíferos. Sin embargo, es relativamente difícil de observar los agregados en las células neuronales cuando el volumen del citoplasma es pequeño alrededor de los núcleos y en las neuritas. El protocolo se utiliza para mostrar la asociación entre KIF5B y sus cargas, además de la in vivo levadura de dos híbridos y pull-down ensayos bioquímicos 13-16. Todos estos ensayos determinan la asociación en diferentes condiciones físicas y sus resultados pueden complementarse entre sí. Por otra parte, la ventaja de este ensayo de fluorescencia con respecto a otros ensayos es que puede mostrar la regulación de la localización subcelular de los cargos por KIF5B (Figuras 1 y 2). El protocolo no se limita a KIF5B y se puede utilizar para identificar cargamentos de otras proteínas de motor, tales como algunos otros kinesin motores 3 y algunos de los motores de miosina 23,24 utilizados en el transporte intracelular de cargas 3. Estas proteínas motoras también contienen dominios de motor para el movimiento a lo largo de los microtúbulos para kinesin motores y microfilamentos para motores de miosina, y segmentos de doble espiral de oligomerización. La mayoría de ellos forman homodímeros 3,23. Por lo tanto, una estrategia similar se puede aplicar a ellos mediante la creación de sus mutantes negativos dominantes sin motor para identificar sus cargas.

Kinesin-1 es una proteína de motor que media el transporte anterógrado de sus cargos 1,2. Es un heterotetrámero de las dos subunidades de la cadena Kinesin Light 1 (KLC1) y dos subunidades de Cadenas Kinesin pesados ​​(KHCs). KIF5B 1, un KHC, contiene un dominio de motor en su extremo N-terminal, que hidroliza ATP y convierte la energía química en energía mecánica para el movimiento a lo largo de los microtúbulos. Su región C-terminal contiene el dominio de dimerización que interactúa con KLC1, que se asocia con cargas. Kinesin-1 transporta cargas tales como vesículas, orgánulos y mRNAs 3,4. Recientemente, se demostró KIF5B para transportar el factor de transcripción nuclear c-MYC de la degradación en el citoplasma proteosomal 5. Tres metodologías (inhibidor químico, siRNA / shRNA y mutante dominante negativo) fueron utilizados para inhibir la función Kinesin-1. Todos ellos inducen la agregación de c-MYC en el citoplasma. Para la última metodología, c-MYC solamente se vio afectada por la negat dominanteive mutante de KIF5B, pero no por la de otra proteína motor KIF5A relacionada, lo que sugiere que el mutante no ejerce efectos generales sobre los componentes intracelulares (como interrupción de microtúbulos) o en la agregación de proteínas. El mutante dominante negativo de KIF5B también no afectó a otro factor de transcripción, lo que sugiere que no ejerce efectos generales sobre los factores de transcripción. Más bien, se sugiere que el mutante negativo dominante ejerce efectos específicos sobre sus cargas. El uso de mutantes dominantes negativos es común en el campo de las proteínas de motor. mutantes desprovistos de motor similares de Kinesins y myosins se utilizaron con anterioridad. Se utilizan principalmente para demostrar los efectos de los mutantes en las localizaciones subcelulares de sus cargas o en funciones celulares 6-12. Menos énfasis se puso en la relación espacial entre los mutantes y los cargos afectados por ellos. Sin embargo, en algunas incidencias, se observaron los mutantes para co-localizar con su cargos 6,10. La interacción entre KIF5B y sus proteínas asociadas se confirmó previamente por la levadura in vivo ensayo de dos híbridos y pull-down ensayos bioquímicos tales como co-inmunoprecipitación y en pull-down ensayos in vitro 13-16. En este artículo, se describe un método mediante microscopía de fluorescencia visual adicional para identificar las proteínas de carga KIF5B. El método hace uso de un mutante KIF5B sin motor que actúa como un mutante negativo dominante. Se agrega en el citoplasma e induce la agregación de sus cargas. El etiquetado de los de tipo salvaje y mutante KIF5B sin motor con la proteína fluorescente tdTomato 17 permite su visualización por microscopía de fluorescencia. Las proteínas etiquetadas KIF5B pueden co-expresan con una proteína candidata fusionada a una proteína fluorescente diferente con propiedades espectrales adecuadamente separadas de la etiqueta KIF5B. Las proteínas marcadas se observan directamente en células vivasbajo microscopía de fluorescencia. La inducción de la agregación de la proteína candidato por el mutante KIF5B motorless confirmará que la proteína candidata es una carga in vivo de KIF5B. Por otra parte, las proteínas KIF5B tdTomato-etiquetados se pueden expresar por sí solo en las células para estudiar sus efectos sobre las proteínas endógenas de carga. Más tarde, microscopía de inmunofluorescencia se lleva a cabo en el que se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo específico contra la proteína candidato endógena las células transfectadas, seguido por un anticuerpo secundario apropiado conjugado con un colorante fluorescente. En este caso, se estudió la proteína endógena candidato en su nivel fisiológico. mutantes desprovistos de motor similares de otras proteínas motoras se pueden preparar para identificar sus cargas.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Exógena expresada de tipo salvaje KIF5B apareció homogénea en el citoplasma, mientras que c-MYC apareció principalmente en el núcleo (Figura 1A). Sin embargo, el mutante KIF5B motorless formó agregados en el citoplasma (Figura 1A). La agregación de la KIF5B sin motor induce la agregación de c-myc. El porcentaje de células que expresan agregados de etiquetado TagCFP c-myc en las células que expresan de tipo salvaje KIF5B fue baja. Sin embargo, fue significativamente mayor cuando el KIF5B sin motor fue co-expresó (Figura 1A). La co-localización observada de KIF5B mutante con c-MYC (Figura 1) sugiere que KIF5B regula la localización subcelular de c-myc y c-MYC es un cargamento de Kinesin-1. Los controles negativos en los que se expresan las construcciones solo se incluyen en el panel inferior de la Figura 1A. Los resultados muestran que no hubo significativo derrame de EMISIO fluorescencianorte. El KIF5B motorless también indujo la agregación de la endógena c-MYC (Figura 1B) y el factor de transcripción p53 (Figura 2), lo que indica que c-MYC y p53 son a la vez los cargamentos de Kinesin-1 y KIF5B regula la localización subcelular de ambas proteínas endógenas. Junto con los resultados que el inhibidor de Kinesin-1 rose bengal lactona (RBL) 20 induce la formación de especies de alto peso molecular tanto para c-myc y p53 5, p53 es probable una carga de Kinesin-1. Es interesante observar que la p53 nuclear factor de transcripción, como c-MYC, también se exporta desde el núcleo al citoplasma de la degradación proteasomal 21,22. El movimiento de factores de transcripción por KIF5B parece ser específica ya que la expresión del mutante KIF5B motorless no afectó a la localización subcelular c-Fos o hacer que agregados (Figura 3). Los datos anteriores demuestran que el method empleadas en esta publicación permite la identificación de alta especificidad de Kinesin-1 cargamentos. Una estrategia similar se puede aplicar a otras proteínas de motor también. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figura 1: Expresión de la mutante KIF5B motorless induce la agregación c-MYC en el citoplasma de células (A) HeLa fueron transfectadas con etiquetado-tdTomato de tipo salvaje (WT) KIF5B (rojo) y de etiquetado TagCFP c-MYC (azul).. -etiquetados tdTomato WT KIF5B apareció principalmente en el citoplasma, mientras que TagCFP etiquetada-c-myc apareció principalmente en el núcleo. Sin embargo, el mutante KIF5B motorless-etiquetados tdTomato (rojo) formado agregados filamentosos o puntiformes en el citoplasma. Expresión de la KIF5B motorless indujo la agregación de c-MYC. El KIF5B mutante y c-MYC co-localizados juntos (rosa). se muestran los porcentajes de células (%) que indican agregados de CFP-c-MYC (%). Los resultados se muestran comomedia ± SD (n = 3). Los controles negativos con la expresión de las proteínas marcadas con KIF5B tdTomato o etiquetado TagCFP-c-myc, junto con vectores vacíos (V) se muestran en el panel inferior. (B) Resultados similares se obtuvieron con el endógena c-myc (verde) cuando se expresaron etiquetado tdTomato-WT o proteínas KIF5B sin motor (rojo). El mutante KIF5B motorless-etiquetados tdTomato formó agregados en el citoplasma y se indujo la agregación de la endógena c-MYC. Ambos tipos de agregados co-localizados juntos en el citoplasma (naranja). Los núcleos se tiñeron con el colorante Hoechst 33342 o DAPI. La barra de escala; 20 micras. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figura 2: Expresión de la mutante KIF5B motorless induce la agregación p53 endógeno en tél citoplasma. En las células HeLa, tdTomato-etiquetado de tipo salvaje (WT) KIF5B exógeno (rojo) apareció principalmente en el citoplasma, mientras que el p53 endógeno (verde) apareció principalmente en el núcleo. En contraste, el mutante KIF5B motorless-etiquetados tdTomato (rojo) agregados en el citoplasma formado. Expresión de la KIF5B motorless indujo la agregación de p53, dando como resultado la co-localización de KIF5B y ​​p53 en el citoplasma (amarillo). El experimento se realizó tres veces. Los núcleos se tiñeron con el colorante vital DAPI. La barra de escala; 20 micras. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figura 3:. La expresión de la mutante KIF5B motorless no induce agregación de c-Fos en el citoplasma tdTomato-etiquetado de tipo salvaje (WT) KIF5B (rojo) aparecióprincipalmente en el citoplasma de las células HeLa, mientras EGFP-c-Fos (verde) apareció principalmente en el núcleo. Por el contrario, el mutante KIF5B motorless-etiquetados tdTomato (rojo) agregados en el citoplasma formado. Expresión de la KIF5B motorless no indujo la agregación de c-Fos. El experimento se realizó en cuatro ocasiones. Los núcleos de las células se tiñeron con el tinte DAPI. La barra de escala; 20 micras. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> cebador inverso común </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> De tipo salvaje KIF5B cebador directo </td><td> 5&#39;-3 AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT &#39; </td></tr><tr><td> cebador directo KIF5B motorless </td><td> 5&#39;-3 AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC &#39; </td></tr></tbody></table>Tabla 1: Las secuencias de cebador para clonar el de tipo salvaje y las proteínas KIF5B sin motor.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

A continuación, se presenta un protocolo para identificar Kinesin-1 cargamentos. Un mutante sin motor de la Kinesin-1 de cadena pesada (KIF5B) agregados en el citoplasma e induce la agregación de sus cargas. Ambos agregados se detectan bajo microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede emplear para identificar cargamentos de otras proteínas de motor.

Identificación de Kinesin-1 Cargos El uso de microscopía de fluorescencia

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K vistas.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  A continuación, se presenta un protocolo para identificar Kinesin-1 cargamentos. Un mutante sin motor de la Kinesin-1 de cadena pesada (KIF5B) agregados en el citoplasma e induce la agregación de sus cargas. Ambos agregados se detectan bajo microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede emplear para identificar cargamentos de otras proteínas de motor. 

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

El uso de nucleótidos Stopped-Flow Fluorescencia y etiquetadas para Analizar el Ciclo de Facturación ATP de Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Investigación

Química

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Biología del Desarrollo

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Montaje de lanzaderas moleculares Powered by reversible conectado Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Ingeniería

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Bioquímica

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis &quot;Mapeo de carga&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neurociencias

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Las operaciones de carga en Kinesin molecular Traslados Desarrollado

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biología

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...