Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. Klonierung des tdTomato-markierten Wildtyp und Motorless KIF5B Proteine <ol><li> Erhöhen der cDNAs für das menschliche Wildtyp und motorlose KIF5B Proteine ​​unter Verwendung der Primer in Tabelle 1, Taq-DNA-Polymerase (5 Einheiten pro 100 ul), dNTP-Mix (2 mM je Desoxynukleotid) und dessen 10X Puffer für 30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus einem Denaturierungsschritt (95 ° C für 30 sec), einem Glühschritt (45 ° C für 30 sec) und einem Verlängerungsschritt (72ºC für 3 min). </li><li> Extrahiere die amplifizierte DNA-Produkt mit einem gleichen Volumen Phenol / Chloroform (1: 1). Hinweis: Phenol ist brennbar und kann zu Verbrennungen führen. Chloroform ist gefährlich. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit ihnen und mit ihnen unter einer chemischen Abzugshaube. Alternativ PCR-Produkte können durch verschiedene Kits gereinigt werden. <ol><li> Schleudern bei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 1 min. Die wäßrige Lösung in ein neues Röhrchen und Extrahieren mit einem gleichen Volumen an Chloroform. </li><li> Drehenbei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 0,5 min. Die wäßrige Lösung in ein neues Röhrchen. </li><li> Mischen der wässrigen Lösung mit einem Zehntel Volumen 3 M Na-Acetat und zwei Volumina absolutem Ethanol. </li><li> Schleudern bei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 min. Verwerfen der wässrigen Lösung. </li><li> Waschen Sie die DNA-Pellet mit zwei Volumen von 75% Ethanol. Verwerfen der wässrigen Lösung und Luft in das DNA-Pellet bei Raumtemperatur für 5 min trocknen. Resuspendieren DNA-Pellet in 34 ul Wasser. </li></ol></li><li> Verdauen die Amplifikate in einem Endvolumen von 40 ul mit den Restriktionsenzymen SalI (10 Einheiten) und BamHI (10 Einheiten) und 4 &amp; mgr; l der 10X-Puffer bei 37 ° C für zwei Stunden. Die verdauten Produkte auf einem Agarosegel (1,0% bei 100 V), die Ethidiumbromid (0,2 ug / ml). Hinweis: Ethidiumbromid ein potenter mutagen und kann durch die Haut aufgenommen werden. Daher ist es wichtig, direkten oder indirekten Kontakt zu vermeiden, with Ethidiumbromid. </li><li> Schneiden Sie die richtigen Bands zur Reinigung aus durch Spalten. Man wiegt das Agarosegel das DNA-Fragment enthält. Dann löst ihn in der Solubilisierungspuffer (300 &amp; mgr; l für 0,1 g) bei 37 ° C für ca. 20 min. </li><li> Fügen Sie die erhaltene Lösung auf eine Säule und Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 sec. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Die Säule wird mit 0,5 ml Solubilisierungspuffer durch den Schritt 1.5 wiederholen. Die Säule wird erneut mit 0,75 ml Waschpuffer durch den Schritt 1.5 wiederholen. Drehen Sie die Spalte für 2 Minuten, um loszuwerden, die verbleibende Waschpuffer. </li><li> Man eluiert das DNA-Fragment mit 50 ul Wasser um 1,5 Schritt wiederholen. Schätzung der Konzentration des DNA-Fragments, indem ein Aliquot davon gegen einen DNA-Größenleiter in einem Agarosegel (1,0% bei 100 V) ausgeführt enthalten Ethidiumbromid (0,2 ug / ml). </li><li> Ligation der gereinigten Produkte (etwa 100 ng) mit dem ptdTomato-C1-Vektor 17 (etwa 100 ng), die zuvor mit th verdaute gleichen Restriktionsenzymen in 10 ul T4 DNA-Ligase für 16 Stunden unter Verwendung von (2.000 Einheiten) und 1 ul 10x Ligationspuffer bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Wildtyp und Mutante motorlosen enthält Aminosäuren 2-963 und 584-963, respectively. Zuvor wurde eine größere motorlose KIF5B Mutante verwendet, um seine Funktion 9 zu identifizieren. Eine kleinere motorlose KIF5B Mutante wurde für den vorliegenden Untersuchungen verwendet, um seine Expressionsniveaus zu erhöhen. </li></ol> 2. Immunfluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Für Live-Zelle oder indirekten Fluoreszenzbildgebung mit Vergrößerung bei oder unter 40X, Saatgut 0,2-0.300.000 HeLa-Zellen in 1 ml Komplettmedium [Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS)] in jede Vertiefung einer sechs-Well-Platte. Wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Für die indirekte Immunfluoreszenz-Studien mit Vergrößerungen über 40x, waschen Deckgläser (18 mm x 18 mm, 1,5 Dicke) in absolutem Ethanol kurz und Luft trocknen sie indie Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte in einem biologischen Sicherheitsschrank, Kontamination zu vermeiden. <ol><li> Seed ,2-0.300.000 Zellen in 1 ml komplettem DMEM-Medium in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Transfektion Complex <ol><li> Am nächsten Tag in einem biologischen Sicherheitsschrank, verdünnte 0,6 &amp; mgr; g (gesamt) des Expressionsplasmids für tdTomato-markierten Wildtyp oder motorlose KIF5B in Gegenwart oder Abwesenheit eines Expressionsplasmids für einen Frachtkandidatenprotein (pTagCFP-c-MYC 5 mit 0,1) ml Transfektion Medium in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Anmerkung: Der Vektor pTagCFP-c-MYC drückt die TagCFP-markierten c-MYC. </li><li> In 1,8 ul des Transfektionsreagenz bis 0,1 ml Transfektionsmediums in einem anderen 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Typischerweise einen Master-Mix von verdünnten Transfektionsreagenz genug für 12 Proben vorzubereiten. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> In der verdünnten 0,1 ml Transfektionsreagenz dem verwässerten 0,1 ml DNAs. miden Inhalt X durch die Rohre umgekehrt wird. Drehen Sie die Rohre für 5 Sekunden in einer Mikro. </li><li> Inkubieren für 45 min bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Das Waschen der Zellen <ol><li> Waschen Sie die beimpften Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) während der Inkubationszeit für die Bildung des Transfektionskomplexes. </li><li> Ersetzen Sie das Medium der ausgesäten Zellen in jeder Vertiefung mit 0,8 ml vorgewärmten Transfektionsmediums. Bringen Sie die Platten in den Inkubator bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfektion von Zellen <ol><li> Nach einer Inkubation von 45 min tropfenweise zu jeder Vertiefung der Platte 0,2 ml des DNA / Transfektionsreagenz Komplex (in Schritt 2.3 hergestellten) hinzuzufügen. </li><li> Schaukeln der Platte mit 6 Vertiefungen sanft für 5 Sekunden, bevor sie in den Inkubator bei 37 ° C zurückgeführt werden. </li><li> Nach 6-8 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit der kompletten DMEM-Medium. </li></ol></li><li> Lebender Zellen Fluoreszenz-Imaging 18 <ol><li> Nach weiteren 16 h Inkubation einet 37 ° C, fügen die DNA interkalierende Fleck Hoechst 33342 zu dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 uM. Anmerkung: Hoechst 33342 ist ein zelldurchlässig, DNA interkalierenden Farbstoff, der die Zellkerne färbt. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen für 10 min im Brutschrank bei 37 ° C, bevor sie für die Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines 40X-Objektiv untersuchen. Die Filtersätze für DAPI, CFP, FITC und Cy3 sind (EX350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) und (Ex545 nm / Em605 nm), respectively. Hinweis: Wenn der Hintergrund durch Autofluoreszenz der kompletten DMEM-Medium hoch ist, Medium ohne Phenolrot verwendet wird. </li></ol></li></ol> 3. Für die indirekte Immunfluoreszenz Studies <ol><li> Herstellung von Paraformaldehydlösung <ol><li> Wiegen Paraformaldehydpulver (4 g pro 100 ml PBS) und fügen Sie ihn in PBS. Hinweis: Paraformaldehyd ein brennbarer Feststoff ist und eine potenzielle Krebs hazard. Es reizt Augen, Atmungsorgane und die Haut. Daher ist es wichtig, den Kontakt mit oder Inhalation von Paraformaldehyd zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen NaOH zu der Lösung (150 &amp; mgr; l 10 N NaOH / 100 ml). </li><li> Halten der Lösung bei 37 bis 42 ° C für 2-3 h unter gelegentlichem Schütteln. </li><li> PH-Wert auf 7,0 durch Essigsäure zu der Lösung Zugabe (etwa 75 &amp; mgr; l / 100 ml) nach dem Paraformaldehyd Pulver gelöst ist. </li></ol></li><li> Zielproteine ​​Färbung <ol><li> Nach weiterer Inkubation für 16 h bei 37 ° C, Waschen der transfizierten Zellen bei Raumtemperatur einmal mit PBS von den sechs-Well-Platte für 5 sec wirbeln. </li><li> Fix die Zellen mit 1 ml frisch zubereitet, 4% Paraformaldehydlösung pro Vertiefung. für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS wurde 5 sec wirbelnden der sechs-Well-Platte. Entsorgen Sie die Lösung. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 1 ml von 0,1% Triton X-100 (in PBS) bei Raumtemperatur für 30 min. die detergent Triton-X 100 die Zellmembran permeabilisiert Zugang von Antikörpern auf ihre intrazellulären Ziele zu ermöglichen. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS viermal durch jedes Mal die sechs-Well-Platte für 5 sec wirbeln. Entsorgen Sie die Lösung nach jeder Wäsche. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 1 ml von primären Antikörpern (c-MYC Kaninchen-Antikörper oder p53-Maus-Antikörper; 0,1 &amp; mgr; g / ml) in einem 10% FBS in PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 4 Stunden Schaukel. </li><li> Waschen mit PBS viermal durch die Sechs-Well-Platte für 5 Sekunden wirbeln jedes Mal. Entsorgen Sie die Lösung nach jeder Wäsche. </li><li> Inkubieren mit 1 ml von Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488-konjugiertem anti-Kaninchen oder Anti-Maus-IgG-Antikörper; 0,5 &amp; mgr; g / ml) in 10% FBS in PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde 2 h Schaukel. </li><li> Waschen mit PBS viermal durch die Sechs-Well-Platte für 5 Sekunden wirbeln jedes Mal. Entsorgen Sie die Lösung nach jeder Wäsche. </li></ol></li><li> Kernfärbung und Montage <ol><li&gt; Inkubieren der Zellen mit dem 1 ml DNA interkalierende Farbstoff 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 0,5 &amp; mgr; g / ml) in PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten in Dunkelheit. Gehen 3.4 zu Schritt, wenn keine Deckgläser verwendet werden. Anmerkung: DAPI ist ein DNA-interkalierenden Farbstoff, der die Zellkerne färbt. </li><li> Bewerben 10 ul Befestigungslösung auf jedem Objektträger. Montieren jedes Deckglas über die Befestigungslösung auf einem Objektträger. </li><li> in der Dunkelheit über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Seal die Ränder der Deckgläser mit Nagellack. Legen Sie in der Dunkelheit im Inneren einer Abzugshaube über Nacht die Nagellack um Abgase zu entfernen. </li></ol></li><li> Fluoreszenzmikroskopie 19 <ol><li> Am nächsten Tag, überprüfen Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie einen 40X-Objektiv verwenden. Die Filtersätze für DAPI, CFP, FITC und Cy3 sind (EX350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) und (Ex545 nm / Em605 nm), respectively. </li></ol></li></ol>

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Das beschriebene Verfahren nutzt die Eigenschaften des motorlose KIF5B Mutante, die die Fähigkeit, entlang der Mikrotubuli zu bewegen fehlt, aber behält die Fähigkeit Dimere mit dem Wildtyp-KIF5B zu bilden und dadurch ermöglichen, die tetrameres Protein mit den gleichen Ladung Proteinen zu interagieren wie der Wildtyp-KIF5B. Freilaufendes KIF5B wirkt daher als dominant negative Mutante und Formen mislocalized mit ihren Ladungen zusammenfasst. Dieses Verfahren hat sich bewährt, die Kinesin-1 Fracht c-MYC (Abbildung 1) 5 zu identifizieren. In diesem Artikel wurde das gleiche motorlose KIF5B Mutante zu identifizieren p53 als eine weitere potentielle Ladung von Kinesin-1 (2) verwendet. Dies zeigt, dass die Methodik möglich ist, andere Ladungen von Kinesin-1 zu identifizieren. Darüber hinaus wird die Spezifität der Mutante durch das Fehlen der Wirkung der Mutante auf der negativen Kontrollprotein c-Fos (Figur 3) vorgesehen. In diesem Protokoll, das tdTomato-markierten Wild tyPE oder motorlose KIF5B Protein wird mit einem anderen fluoreszierenden Protein-markierten Kandidaten Fracht Protein koexprimiert. In diesem Fall werden die lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie und bildgebende durchgeführt. Die Bildung der Aggregate durch Zeitraffer-Bildgebung verfolgt werden. Alternativ wird die tdTomato-markiertes Protein exprimiert allein und der Kandidat Ladung Protein an seine physiologischen Niveaus durch indirekten Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht. Das fluoreszierende Protein tdTomato 17 für die Helligkeit und Lichtstabilität gewählt. Wenn der Hintergrund durch Autofluoreszenz der kompletten DMEM-Medium hoch ist, Medium ohne Phenolrot verwendet wird. Die motorlose KIF5B Mutante bildet Dimere mit dem Wildtyp-KIF5B stöchiometrisch. Daher ist es wichtig, eine ausreichende Menge an motorlose KIF5B Mutante auszudrücken Dimere mit dem Wildtyp-Gegenstück zu bilden, deren Funktion zu inhibieren und Aggregate zu bilden. Zur Bewältigung dieses Problems, die Optimierung der ausdrITZUNG des motorlosen Mutante ist von wesentlicher Bedeutung. Es wird unter Verwendung eines kleinen motorlose Mutante mit dem Dimerisierungsdomäne erreicht. Zusätzlich Optimierung des entsprechenden Transfektionsreagenz und Protokoll ist ebenfalls notwendig. Die Dauer der Inkubation von HeLa-Zellen mit dem DNA / Transfektionsreagenz wurde in HeLa-Zellen für die Expression von exogenen Proteinen und Zelllebensfähigkeit optimiert. Die Inkubationsdauer werden müssen für andere Zelllinien optimiert. Für Vergrößerungen zwischen 4X bis 40X, werden keine Deckgläser erforderlich. Die Zellen können direkt in den Vertiefungen untersucht werden. Daher wird in diesem Fall ist das Protokoll, preiswert und einfach. Für Vergrößerungen über 40x, werden die Zellen auf Deckgläser in den Vertiefungen gewachsen und, nach dem Färben, montiert auf Objektträger zur Untersuchung unter Öl-Immersionsobjektive. Beobachtung der Aggregate des motorlose KIF5B Protein wird durch die Größe des Zytoplasmas beschränkt. Es ist leicht, das zu erkennen,Aggregate in vielen Säugerzellen. Es ist jedoch relativ schwierig, die Aggregate in neuronalen Zellen zu beobachten, wenn das Volumen des Zytoplasma und um die Kerne in Neuriten klein ist. Das Protokoll wird verwendet, um den Zusammenhang zwischen 13-16 KIF5B und ihre Ladungen zusätzlich zu der in vivo Hefe-Zwei-Hybrid und biochemische Pulldown-Assays zu zeigen. Alle diese Tests den Verein unter verschiedenen physikalischen Bedingungen bestimmen und ihre Ergebnisse gegenseitig ergänzen können. Darüber hinaus ist der Vorteil dieses Fluoreszenzassay im Vergleich zu anderen Assays, dass es die Regulierung der subzellulären Lokalisierung der Ladungen durch KIF5B zeigen können (1 und 2). Das Protokoll ist nicht auf KIF5B beschränkt und kann verwendet werden Ladungen anderer Motor Proteine ​​zu identifizieren, wie einige andere Kinesin Motoren 3 und einige der Myosin Motoren 23,24 in den intrazellulären Transport von Ladungen verwendet 3. Diese Motorproteine ​​auch Motor-Domains für die Bewegung entlang von Mikrotubuli für Kinesin-Motoren und Mikrofilamenten für Myosinmotoren enthalten, und Coiled-Coil-Segmente für die Oligomerisierung. Die meisten von ihnen bilden Homodimere 3,23. Daher kann eine ähnliche Strategie zu ihnen angewendet werden durch ihre motorlose dominant negative Mutanten schaffen ihre Ladungen zu identifizieren.

Kinesin-1 ist ein Protein, das Motor anterograden Transport von seiner Ladungen 1,2 vermittelt. Es ist ein Heterotetramer der beiden Untereinheiten von Kinesin Light Chain 1 (KLC1) und zwei Untereinheiten von Kinesin Schwere Ketten (KHCs). KIF5B 1, a KHC enthält einen Motor Domäne an ihrem N-Terminus, die hydrolysiert ATP und wandelt die chemische Energie in mechanische Energie zur Bewegung entlang Mikrotubuli. Seine C-terminale Region enthält die Dimerisierungsdomäne, die mit KLC1, die mit Ladungen assoziiert interagiert. Kinesin-1 transportiert Ladungen wie Vesikel, Organellen und mRNAs 3,4. Kürzlich wurde KIF5B die Kerntranskriptionsfaktor c-MYC für proteosomalen Abbau im Zytoplasma 5 zu transportieren gezeigt. Drei Methoden (chemischer Inhibitor, siRNA / shRNA und dominant negative Mutante) wurden verwendet, Kinesin-1-Funktion zu hemmen. Alle Aggregation von c-MYC in das Zytoplasma induziert. Für die letzte Methode, c-MYC wurde nur von der herrschenden negat betroffenive Mutante von KIF5B, aber nicht von der eines anderen verwandten KIF5A Motor Protein, was darauf hindeutet, dass die Mutante nicht allgemeine Wirkungen auf die intrazellulären Komponenten ausübt (wie Mikrotubuli Störung) oder Proteinaggregation. Die dominant negative Mutante von KIF5B wirkte sich auch keine andere Transkriptionsfaktor, was darauf hindeutet, dass es keine allgemeinen Auswirkungen auf die Transkriptionsfaktoren ausübt. Vielmehr schlägt er vor, dass die dominante negative Mutante spezifische Auswirkungen auf die Ladungen ausübt. Die Verwendung von dominant negativen Mutanten ist auf dem Gebiet der Motorproteine ​​gemeinsam. Ähnliche motorlosen Mutanten von kinesins und Myosine wurden bisher verwendeten. Sie wurden hauptsächlich verwendet, 6-12 die Wirkung der Mutanten auf die subzelluläre Lokalisation ihrer Ladungen oder auf zelluläre Funktionen zu demonstrieren. Weniger Wert wurde zwischen den Mutanten auf die räumliche Beziehung setzen und die von ihnen betroffen Ladungen. Jedoch in einigen Fälle wurden die Mutanten beobachtet zusammen lokalisieren mit ihren cargos 6,10. Die Wechselwirkung zwischen KIF5B und die zugehörigen Proteine ​​wurde zuvor von der in vivo Hefe-Zwei-Hybrid-Assay und biochemische Pull-down-Assays, wie Co-Immunpräzipitation und in vitro-Pulldown-Assays 13-16 bestätigt. In diesem Artikel wird eine zusätzliche visuelle Methode unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie beschrieben KIF5B Frachtproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren verwendet eine motorlose KIF5B Mutante, die als dominant negative Mutante wirkt. Es vereinigt in das Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Die Markierung von Wildtyp und motorlose KIF5B Mutante mit dem fluoreszierenden Protein tdTomato 17 ermöglicht, ihre Visualisierung von Fluoreszenzmikroskopie. Die markierten KIF5B Proteine ​​können aus dem KIF5B Tag getrennt mit spektralen Eigenschaften in geeigneter Weise an einem anderen fluoreszierenden Protein fusioniert mit einem Kandidatenprotein coexprimiert werden. Die markierten Proteine ​​werden direkt in lebenden Zellen beobachtetunter Fluoreszenzmikroskopie. Die Induktion der Aggregation des Kandidatenprotein durch die motorlose KIF5B Mutante wird bestätigen, dass die Kandidaten-Protein ist ein In-vivo-Ladung von KIF5B. Darüber hinaus können die tdTomato-markierten Proteine ​​KIF5B allein in den Zellen exprimiert werden, um ihre Auswirkungen auf die endogene Ladung Proteine ​​zu studieren. Später, Immunfluoreszenz-Mikroskopie durchgeführt wird, in dem die transfizierten Zellen fixiert und mit einem spezifischen Antikörper gegen den endogenen Kandidatenprotein, gefolgt von einem geeigneten sekundären Antikörper konjugiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. In diesem Fall wird die endogene Kandidatenprotein an seinem physiologischen Ebene untersucht. Ähnliche motorlosen Mutanten von anderen Motorproteine ​​hergestellt werden, ihre Ladungen zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Exogen exprimierten Wildtyp KIF5B erschien homogen im Zytoplasma, während c-MYC schien hauptsächlich in dem Kern (1A). Jedoch wird das gebildete motorless KIF5B Mutante Aggregate im Zytoplasma (1A). Die Aggregation des motorlosen KIF5B induziert die Aggregation von c-MYC. Der Prozentsatz der Zellen aggregiert exprimieren TagCFP-markierten c-MYC in den Zellen, die Wildtyp-KIF5B war gering. Es war jedoch signifikant höher, wenn die motorlose KIF5B wurde coexprimiert (1A). Die beobachtete Kolokalisation von mutierten KIF5B mit c-MYC (Figur 1) legt nahe, dass die subzelluläre Lokalisation KIF5B von c-MYC reguliert und c-MYC ist eine Ladung von Kinesin-1. Negative Kontrollen, in denen die Konstrukte wurden allein ausgedrückt werden in der unteren Platte der 1A enthalten. Die Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Durchbluten der Fluoreszenz Emission. Die motorlose KIF5B auch Aggregation des endogenen c-MYC (1B) und den Transkriptionsfaktor p53 (Figur 2) induziert, was anzeigt, dass c-MYC und p53 sind sowohl die Ladungen von Kinesin-1 und KIF5B regelt die subzelluläre Lokalisation von beiden körpereigenen Proteinen. Zusammen mit den Ergebnissen, dass die Kinesin-1-Inhibitor bengal Lacton (RBL) 20 induziert die Bildung von hochmolekularen Spezies sowohl c-MYC und p53 5, ist p53 stieg wahrscheinlich eine Ladung von Kinesin-1. Es ist interessant, dass die Kerntranskriptionsfaktor p53 zu beachten, wie c-MYC, ebenfalls aus dem Zellkern in das Zytoplasma für den proteasomalen Abbau 21,22 exportiert wird. Die Bewegung von Transkriptionsfaktoren durch KIF5B scheint spezifisch zu sein, da die Expression des motorlose KIF5B Mutante nicht die subzelluläre Lokalisation c-Fos nicht beeinträchtigte oder dazu führen, dass (Figur 3) zu aggregieren. Die obigen Daten zeigen, dass die method in dieser Veröffentlichung verwendet ermöglicht die hochspezifische Identifikation von Kinesin-1 Ladungen. Eine ähnliche Strategie kann auch auf andere Motorproteine ​​angewendet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Expression des motorlosen KIF5B Mutante induziert c-MYC-Aggregation im Zytoplasma (A) wurden HeLa-Zellen, die mit tdTomato-markierten Wildtyp (WT) KIF5B (rot) und TagCFP-markierten c-MYC (blau).. tdTomato-markierten WT KIF5B schien hauptsächlich im Zytoplasma, während TagCFP-markierten c-MYC hauptsächlich im Zellkern erschien. Allerdings ist die tdTomato-markierten motorlose KIF5B Mutante (rot) fadenförmige oder punktförmige Aggregate im Zytoplasma gebildet. Die Expression des motorlose KIF5B induziert die Aggregation von c-MYC. Das mutierte KIF5B und c-MYC co-lokalisiert zusammen (pink). Die Prozentsätze von Zellen (%) Aggregate von GFP-c-MYC (%) sind anzeigt gezeigt. Die Ergebnisse sind alsMittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Negative Kontrollen mit der Expression von tdTomato-markierten KIF5B Proteine ​​oder TagCFP-markierten c-MYC zusammen mit leeren Vektoren (V) werden im unteren Bereich angezeigt. (B) Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem endogenen c-MYC (grün) erhalten, wenn tdTomato-markierten WT oder motorlose KIF5B Proteine ​​(rot) zum Ausdruck gebracht wurden. Die tdTomato-markierten motorless KIF5B Mutante Aggregate im Zytoplasma gebildet und Aggregation des endogenen c-MYC induziert. Beide Arten von Aggregaten co-lokalisiert gemeinsam in das Zytoplasma (orange). Die Kerne wurden mit dem Farbstoff Hoechst 33342 oder DAPI gefärbt. Maßstabsbalken; 20 &amp; mgr; m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Expression des motorlosen KIF5B Mutante induziert endogenen p53-Aggregation in ter Zytoplasma. In HeLa-Zellen exogene tdTomato-markierten Wildtyp (WT) KIF5B (rot) erschien hauptsächlich im Zytoplasma, während das endogene p53 (grün) erschien vor allem in den Zellkern. Im Gegensatz dazu bildeten die tdTomato-markierten motorlose KIF5B Mutante (rot) Aggregate im Zytoplasma. Die Expression des motorlose KIF5B induziert die Aggregation von p53, was zu einer Co-Lokalisation von KIF5B und p53 im Zytoplasma (gelb). Das Experiment wurde dreimal durchgeführt. Die Kerne wurden mit dem Farbstoff DAPI gefärbt. Maßstabsbalken; 20 &amp; mgr; m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Abb. 3: Die Expression des motorlosen KIF5B Mutante nicht induziert die Aggregation von c-Fos im Zytoplasma tdTomato-markierten Wildtyp (WT) KIF5B (rot) erschienenhauptsächlich im Zytoplasma von HeLa-Zellen, während EGFP-c-Fos (grün) schien hauptsächlich im Zellkern. Im Gegenteil, die tdTomato-markierten motorless KIF5B Mutante (rot) gebildeten Aggregate im Zytoplasma. Die Expression des motorlose KIF5B hat die Aggregation von c-Fos nicht induzieren. Das Experiment wurde viermal durchgeführt. Die Kerne der Zellen wurden mit dem Farbstoff DAPI gefärbt. Maßstabsbalken; 20 &amp; mgr; m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> gemeinsame Rückwärtsprimer </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> Wildtyp-KIF5B Vorwärtsprimer </td><td> 5&#39;AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> motorless KIF5B Vorwärtsprimer </td><td> 5&#39;AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabelle 1: Primersequenzen für die Wildtyp und motorlose KIF5B Proteine ​​klonen.

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine ​​zu identifizieren, eingesetzt werden.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Aufrufe.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine ​​zu identifizieren, eingesetzt werden. 

Serie: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

Verwendung von Stopped-Flow-Fluoreszenz und markierte Nukleotide ATP, um die Umsatz-Zyklus von Kinesine Analysieren

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Forschung

Chemie

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Entwicklungsbiologie

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Ingenieurwesen

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Biochemie

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neurowissenschaften

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biologie

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...